专利名称：一种金针菇不皂化提取物甾醇的微乳制剂及其制备方法
技术领域：
本发明属于纳米医药领域，具体地说是一种金针菇留醇提取物微乳制剂。
背景技术：
金针燕(Flammulina velutipes (ff. Curt. :Fr.) Singer)，又名金钱菌、朴蕈、冬燕、毛柄金钱菌，属真菌门(Eumycota),担子菌亚门(Basidiowyeotina),层菌纲(Hymenomycetes)，伞菌目(Agaricales), 口蘑科(Tricholomataceae),小火焰菌属(Flammulina)、或金钱菌属(Collybia),是古今中外著名的食用菌之一 i郭美英主编，《中国金针菇生产》，北京:中国农业出版社，2000.)。金针菇富含糖类、蛋白质、膳食纤维和矿物质等营养物质。近些年来，学者们已从
金针菇中分离得到许多种蛋白质和多糖类活性物质，这些物质具有抗肿瘤，抗病毒，抗虫，抗真菌，抗人的免疫缺陷病毒(HIV)，降低血清胆固醇，降低血压，提高机体免疫力，以及保护肝脏等广泛药理活性。已经报道的蛋白质类成分主要包括真菌免疫调节蛋白，金针菇毒素，火 素，火燕蛋白原，酶，凝集素，以及Flammulin、Velutin、Flammin和Velin等四种核糖体失活蛋白等。多糖类成分包括PA3DE、PA5DE, EA3> EA5, EAf^P EA7, SFAl, FVP2，胞外多糖，卢-葡聚糖，木甘露聚糖以及甘露岩藻半乳聚糖等iYaqi Wang, Li Bao, XiaoliYang， e tc. Bioac ti ve sesqui terpenoids from the solid cul ture of the ediblemushroom flammulina velutipes growing on cooked rice[J]. Food Chemistry，2012，132(3): 1346-1353· Hui-Hsin Chang, Kuang-Yang Hsieh，Chen-Hao Yeh，etc·Oral administration of an enoki mushroom protein fve activates innate andadapt i ve immuni ty and induces anti-tumor activity against murine hepatocellularcarcinoma [J]· International Inmunopharmacology, 2010, 10: 239-246· ) 0除此之外，留醇、脂肪酸、黄酮、萜类以及核苷等小分子物质也被从中发现。目前关于这些小分子物质的生物活性报道主要集中在抗菌、抗氧化方面{方玉梅，张春生，谭萍，etc·金针菇黄酮类化合物的抗氧化性作用[J].食品研究与开发，2012f 33(3):15-18. V. Μ. Tereshina, A Si Memorskaya. Adaptation of flammulina velutipes tohypothermia in natural environments the role of lipids and carbohydrates [J]·Microbiology，2005，74(3): 279-283. ) 0留醇(Sterol)是一类重要的三職类(Triterpenes)化合物,它们广泛存在于植物，动物和真菌当中。根据来源不同，留醇可分为动物留醇和植物留醇(Plant sterols,PS)。胆固醇是动物体内的主要甾醇，其中游离胆固醇有稳定细胞膜的作用。植物甾醇是植物细胞膜的重要组成部分，与胆固醇类似，自由植物留醇有助于稳定植物细胞膜中的磷脂双层，它们结构与胆固醇相似，但在C-24位有一个甲基或乙基基团。在高等植物中，最常见的PS是豆甾醇(Stigmasterol)、卢-谷甾醇{β -sitosterol)和菜油甾醇(Campesterol),它们有一个共同特点是在甾核的C_5, 6位有一个双键，这种植物留醇称为Phytosterols。在十字花科植物中主要存在另外一种甾醇-菜籽甾醇(Brassicasterol)。饱和PS,也称为植物甾烧醇(Phytostanols),是在甾核中没有双键的。在过去的15年里，植物留醇(PS)已经被证明具有降低血清总胆固醇和低密度脂蛋白(LDL)胆固醇浓度的功效，被纳入功能性食品的范畴。许多临床研究显示，Γ3克/天PS的剂量能够显著降低血浆LDL胆固醇的浓度。植物留醇还可用于辅助治疗，与他汀类药物联合使用的效果超过他汀类药物加倍剂量的效果。现在已经有40多个关于PS产品的专利，超过 15 个 PS 产品行销全世界{G. Garcia-Llatas, Μ. T. Rodriguez-Estrada.Current and new insights on phytosterol oxides in plant sterol-enrichedfoodfjj. Chem Phys Lipids, 2011, 164(6): 607-624. ) 关于植物甾醇降低胆固醇作用的确切机制尚不清楚，目前认为存在以下几种可能(I)由于植物留醇比胆固醇具有更强的疏水性，因此植物留醇可以取代胆固醇进入混合微粒(Mixed micelles)中。这种取代作用使微粒中的胆固醇含量下降,从而减少胆固醇的吸收。(2)植物留醇可以减缓胆固醇在肠上皮细胞中的酯化速度。由于酯化后的固醇易于进入乳糜微粒中，而未酯化的固醇则较难进入乳糜微粒，因此植物留醇可以减少乳糜
微粒中胆固醇的总量。(3)植物甾醇可能通过ATP结合盒(ATP-binding cassette, ABC)转运体家族影响胆固醇的吸收。ABCG作为ABC的一个亚族，其中两个基因ABCG5和ABCG8与人体对甾醇的选择性吸收有关，也与胆汁中固醇的分泌有关{周晓星，苏宜香.植物&醇降胆固醇作用的研究现状[J].国外医学卫生学分册，2007，34(2): 101-105·)。目前已经从金针菇的子实体以及菌丝体中得到17种包括麦角留类和豆留类的甾醇化合物(2览，24/ )-ergosta-7, 22-diene_3卢，5 σ，6 σ，9 σ -tetrol (I)，(22Ε, 24/P)-ergosta-7, 22-diene_3β ,5 α ,ββ -triol (2), (245) -ergosta-7-ene-3β ,5a ,ββ -triol (3), 5 σ , 8 σ -epidioxy- (22/ , 2AR) -ergosta-6, 22-diene_3/ _ol (4) , 5 σ , 8 σ -epidioxy- (2451) -ergost-6-ene~3β _ol (5), (22/ , 24/P) -ergosta-5, 7, 9(11), 22-tetraene-3/ -oI (6), (2451) -ergosta-7-ene-3β ~o\ (7), ergosta-5, 8, 22-triene-3/ -ol (8)，ergosterol (9), ergosta-5, 7-diene-3/ -oI (10)，ergosta-7, 22-diene_3/ _ol (11)，ergosta-30 -D-glucopyranoside (12), ergosta-7, 22-diene_5，6-epoxy-3_ol (13),5 a -stigmastan-3, 6-dione (14)，(24/P) -stigmast-4-ene-3_one (15)，ergosta-4, 6, 8 (I4), 22-tetraene-3-one (16), ergosta-8(14)-ene~3β -ol (17)。上述的化合物9 (ergosterol,麦角甾醇)是金针燕所含甾醇类物质的主要成分之一，在植物界也广泛存在，其抗肿瘤活性已经得到了多次实验的证实，作用机制亦部分被揭示。Takaku等从姬松鸾中分离出ergosterol,400和800 mg *kg_1的剂量连续20 d 口服给予肉瘤180小鼠，可以显著抑制肿瘤的生长，而且还没有化疗药物通常所引起的如体重、附睾脂肪组织、胸腺、脾脏重量和白细胞数降低等副作用。进一步研究表明，ergosterol能够直接抑制基底膜诱导的新生血管形成，因此它是通过直接抑制实体瘤诱导的血管生成来发挥抑瘤活性的{Takeshi Takaku, Yoshiyuki Kimura, Hiromichi Okuda. Isolation of anan ti tumor compound from agari cus blazei muri 11 and its mechanism of action [J].Biochemical and Molecular Action of Nutrients, 2001，131 (5): 1409-1413·、。Yazawa等从Polyporus醇提物中分离出ergosterol,它对5%糖精钠(SodiumSaccharin)、0. 01%N- 丁基-N- (4-羟基丁基)亚硝胺(BHBN)、3%DL-色氨酸(Trp)、2%丁基化羟基苯甲醚(BHA)等诱导的Wistar大鼠膀胱癌，有很好的治疗作用iYasuharuYazawa, Masami Yoko ta, Kiyoshi Sugiyama. An ti tumor promo ting effect of an activecomponent of polyporus, ergosterol and re la ted compounds on rat urinary bladdercarcinogenesis in a short-term test with concana valin A[J], Bi ol. Pharm. Bull.,2000, 23(11): 1298-1302.)。P21是细胞周期素依赖性激酶抑制因子(Cyclin-dependent kinase inhibitor,CDKI )的一种，属于细胞周期负性调节因子，它可通过抑制细胞周期素依赖性激酶(Cyclin-dependent kinase, CDK) CDK2、CDK4的活性，使细胞不能跨越G期检查点，从而阻滞细胞周期的进行，抑制细胞增殖，是肿瘤预防和治疗一个靶点。张娴等发现ergosterol在5(Γ200 μ gmr1可以抑制!fepG2细胞增殖，机制可能与增高Ρ21 mRNA和蛋白表达相关。在 ergosterol 作用 48 h 和 72 h 后，100、200 μ g *mL 1 组 P21 mRNA 的表达明显增高。24h后P21蛋白已经有升高趋势,48 h、72 h后明显升高,提示P21可能是 ergosterol的作用靶点。{张娴，黄羽’曾星·麦角留醇对肝癌细胞H印G2增殖及P21表达的影响[J].中药药理与临床，2011，27(5): 26-29.)
高虹等人采用小鼠S180移植瘤实验研究了巴西燕子实体中ergosterol的体内抗肿瘤活性。结果表明，巴西燕子实体中提取的ergosterol在剂量10、50和100 mg · kg—1 · cf1时的瘤重抑制率分别为62. 75%,76. 61%和79. 18%，说明ergosterol有较强的抑瘤活性，并且认为其抑瘤活性不是通过直接作用于肿瘤细胞发挥，而是通过抑制肿瘤血管增生来扼杀肿瘤{高虹，史德芳，杨德，etc.巴西菇麦角甾醇抗肿瘤活性及作用机理初探[J].中国食用菌，2011, 30(6): 35-39. ) 然而，室温条件下游离的植物留醇在水和油中的溶解度均很小，在人体内的吸收率亦很低，约为 2% 5% {I. Rudkowska. Plant sterols and stanols for heal thyageing [J]· Matur itas, 2010，66(2): 75 -似.)。为了扩宽植物甾醇的应用范围，提高其溶解度是当务之急。目前主要有两种方法，其一是利用留核上重要的活性基团——C-3位羟基，可与脂肪酸化合形成留醇酯，植物留醇酯比游离植物留醇在油中的溶解度增加约10倍；其二是利用乳化剂的乳化增溶作用和高压均质技术，使植物留醇在水相中分散成纳米级的分散体，增加它的溶解度。微乳(Microemulsion)是由水相、油相、两亲性物质混合形成的光学各向同性和热力学稳定的单一液体溶液。微乳作为一种新型药物载体，其液滴一般介于10 100nm,具有增加难溶性药物的溶解度，提高药物生物利用度，保护易失活、易水解药物的活性，控制药物释放等特点，同时还可以被运用于口服、注射、透皮和眼部等多种给药途径，已经在药学领域得到了广泛的研究与应用{Cai-Xia He, Zhong-Gui He, Jian-Qing Gao.Microemulsions as drug deli very systems to improve the so Iubi Ii ty and thebi oa vai Iabi Ii ty of poorly soluble drugs [J], Expert opinion on drug deli very20W， 7(4): 445-460. M· Jayne Lawrence, Gareth D. Rees. Mi croemulsi on -basedmedia as novel drug deli very systems [J]. Advanced Drug Deli very Reviews, 2000，45: 89-121. ) o微乳配方常见的辅料有油相包括中链的(比如椰子油和棕榈油)或长链的(比如大豆，芝麻，玉米，橄榄油，花生油，菜籽油，氢化植物油和大豆油)植物油；药学上可接受的离子/非离子表面活性剂(Cremophore EL，RH40或RH60，D-α -生育酚聚乙二醇1000 玻拍酸酯，Tween 20 或 80, Span 20, poloxamer 407,各种 Labrasols , Labrafils 和Gelucires )和磷脂(氢化大豆磷脂，二硬脂酰磷脂酰甘油，L-α -十四酰基磷脂酰胆碱，L-α-十四酰基磷脂酰甘油)；有机溶剂(比如聚乙二醇300，丙二醇，乙醇，甘油)。金针菇留醇提取物是将金针菇子实体粉碎后用醇溶液提取，通过浓缩、萃取、皂化反应、结晶等步骤得到的不皂化物。研究证明，该提取物具有体外抑制人肝癌细胞(HepG2)、人胃腺癌细胞(SGC)、人胶质瘤细胞(U251)和人肺腺癌细胞(A549)等肿瘤细胞生长的活性，可用于制备抗肿瘤药物(参见 .金针菇中具有抗肿瘤作用的不皂化提取物及其制法和用途[P],专利申请号.-CN201110364098. 5、。它主要包含ergosterol,22, 23-dihydroergosterol, ergosta-5, 8, 22-triene~3-ol 和 ergost-8 (14) -ene-3β -οI等四种成分。它易溶于乙醚、氯仿以及热乙醇等有机溶剂，室温下极难溶于水和油，具备植物甾醇的一般性质。目前尚未有以金针菇留醇提取物为原料药，制备成微乳制剂，以达到提高该提取物溶解度和生物利用度的研究报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种金针菇留醇提取物的微乳制剂，将难溶于水的金针菇甾醇提取物制备成微乳制剂，提高它的溶解度，改善它在体内的生物利用度极低的缺点。本发明的另一目的是提供这种金针菇留醇提取物微乳制剂的制备方法。为实现上述目的，本发明采用的技术方案是
一种金针菇不皂化提取物留醇的微乳制剂，它是以金针菇不皂化提取物留醇作为原料药，采用表面活性剂、助表面活性剂、油相和蒸馏水组成的混合物作为药物载体，具体的是它包括以下组分0. 01°/Γ %的金针菇不皂化提取物留醇、10°/Γ40%的表面活性剂、3°/Γ20%的助表面活性剂、1°/Γ10%的油相、409Γ80%的分散介质组成，所述的金针菇不皂化提取物甾醇的微乳制剂的粒径在10-50nm之间。所述的金针菇不皂化提取物甾醇是将金针菇子实体用醇溶液提取，通过浓缩、萃取、皂化反应、结晶等步骤得到(参见专利申请号CN 201110364098.5)。它主要包括 ergosterol,22，23-dihydroergosterol, ergosta-5, 8, 22-triene-3/ -οI 和ergost-8 (14)-ene-3卢-οI等四种成分,其中前面二种成分含量较高。所述的表面活性剂是脂肪酸山梨坦、聚山梨酯、聚氧乙烯脂肪酸酯、聚氧乙烯脂肪醇醚或聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物中任意一种或者它们的混合物。所述的脂肪酸山梨坦是司盘20、司盘40、司盘60、司盘65、司盘80、司盘85的任意一种或者它们的混合物。所述的聚山梨酯是吐温20、吐温40、吐温60、吐温65、吐温80或吐温85的任意一种或者它们的混合物。所述的聚氧乙烯脂肪醇醚是苄泽30、苄泽35、苄泽72、苄泽92、西土马哥、平平加
O、聚氧乙烯蓖麻油或聚氧乙烯氢化蓖麻油的任意一种或者它们的混合物；
所述的聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物是泊洛沙姆124、泊洛沙姆188、泊洛沙姆237、泊洛沙姆338或泊洛沙姆407的任意一种或者它们的混合物。所述的助表面活性剂是乙醇、异丙醇、1，2_丙二醇、甘油、聚乙二醇200、聚乙二醇300、聚乙二醇400或聚乙二醇600中的任意一种或者它们的混合物。所述的油相为植物油或中等脂肪链长度的肪酸酯中的任意一种。
所述的植物油是大豆油、菜籽油、麻籽油、玉米油、花生油、红花油、橄榄油、棕榈油或葵花籽油的任意一种或者它们的混合物。所述的中等脂肪链长度的脂肪酸酯是油酸乙酯、肉豆蘧酸异丙酯、棕榈酸异丙酯、辛酸甘油单酯、辛酸甘油二酯、辛酸甘油三酯、葵酸甘油单酯、葵酸甘油二酯、葵酸甘油三酯或辛葵酸甘油酯中的任意一种或者它们的混合物。一种制备上述的金针菇不皂化提取物留醇的微乳制剂的方法，其特征是包括以下步骤
(1)按上述配方的组成和比例称取金针菇不皂化提取物留醇、表面活性剂和油相，在超声条件下促使金针菇不皂化提取物留醇溶解；
(2)再加入所述量的助表面活性剂，磁力搅拌下混匀，并且使得金针菇不皂化提取物留醇进一步溶解完全；
(3)最后缓慢加入所述量的蒸馏水，边滴加边搅拌，直至形成均匀、透明的溶液，即得所述的金针菇不皂化提取物留醇的微乳制剂。本发明所述的一种含有金针菇甾醇的微乳制剂，可制成胶囊、软胶囊、口服液等剂型，也可进一步用任意比例的水分稀释成稳定的任意浓度的纳米乳，并制成各种相应的剂型。本发明所选用的表面活性剂、助表面活性剂、油相均为药剂学上广泛应用的药用辅料，具有无毒、无刺激性的特性。本发明选用的表面活性剂为非离子表面活性剂，具有毒性低、生物相容性好的优点，是制备口服及注射用微乳的主要辅料。本发明采用的油相均可食用，无毒无刺激，因此采用这些药用辅料和本发明制备方法得到的微乳制剂具有安全的特点。有益效果
本发明具有以下的有益效果
1、本发明解决了金针菇不皂化提取物留醇溶解度低的问题，极大地增大药物的溶解度，提高了药物的生物利用度；
2、本发明采用的配方和方法简单可行，无需特殊设备，便于大规模工业化生产。
图I为实施例I制备的金针菇不皂化提取物甾醇的微乳制剂的透射电镜照片(X500k)。图2为实施例I制备的金针菇不皂化提取物留醇的微乳制剂的粒径分布图。图3为实施例4制备的金针菇不皂化提取物留醇的微乳制剂平均血药浓度-时间曲线图(n=5)。
具体实施例方式 以下所列实施例有助于本领域技术人员更好地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。实施例I金针菇不皂化提取物留醇的微乳制剂
(1)在烧杯中按下表称取金针燕不阜化提取物留醇，聚氧乙烯蓖麻油(CremophorEL)，辛癸酸甘油酯，在超声条件下促使金针菇不皂化提取物留醇溶解；
(2)再加入表中的乙醇，磁力搅拌下混匀，并且使得金针菇不皂化提取物留醇进一步溶解完全；
(3)最后缓慢加入表中的蒸馏水，边滴加边搅拌，直至形成均匀、透明的溶液，即得金针菇不皂化提取物留醇的微乳制剂。体系最终体积为30 mL,药物浓度为O. 68 mg经测定，实施例I制备的金针菇不皂化提取物甾醇的微乳制剂的平均粒径为22. 9 nm。
权利要求
1.一种金针菇不皂化提取物留醇的微乳制剂，其特征是它是以金针菇不皂化提取物甾醇作为原料药，采用表面活性剂、助表面活性剂、油相和蒸馏水组成的混合物作为药物载体，具体的是它包括以下组分0. 019Tl%的金针菇不皂化提取物留醇、109Γ40%的表面活性剂、3°/Γ20%的助表面活性剂、1°/Γ10%的油相、40°/Γ80%的分散介质组成，所述的金针菇不皂化提取物留醇的微乳制剂的粒径在10-50nm之间，所述的金针菇不皂化提取物留醇是将金针菇子实体用醇溶液提取，通过浓缩、萃取、皂化反应、提取和结晶步骤得到。
2.根据权利要求I所述的金针菇不皂化提取物留醇的微乳制剂，其特征是所述的表面活性剂是脂肪酸山梨坦、聚山梨酯、聚氧乙烯脂肪酸酯、聚氧乙烯脂肪醇醚或聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物中任意一种或者它们的混合物。
3.根据权利要求2所述的金针菇不皂化提取物留醇的微乳制剂，其特征是所述的脂肪酸山梨坦是司盘20、司盘40、司盘60、司盘65、司盘80、司盘85的任意一种或者它们的混合物。
4.根据权利要求2所述的金针菇不皂化提取物留醇的微乳制剂，其特征是所述的聚山梨酯是吐温20、吐温40、吐温60、吐温65、吐温80或吐温85的任意一种或者它们的混合物。
5.根据权利要求2所述的金针菇不皂化提取物留醇的微乳制剂，其特征是所述的聚氧乙烯脂肪醇醚是苄泽30、苄泽35、苄泽72、苄泽92、西土马哥、平平加O、聚氧乙烯蓖麻油或聚氧乙烯氢化蓖麻油的任意一种或者它们的混合物。
6.根据权利要求2所述的金针菇不皂化提取物留醇的微乳制剂，其特征是所述的聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物是泊洛沙姆124、泊洛沙姆188、泊洛沙姆237、泊洛沙姆338或泊洛沙姆407的任意一种或者它们的混合物。
7.根据权利要求2所述的金针菇不皂化提取物留醇的微乳制剂，其特征是所述的助表面活性剂是乙醇、异丙醇、1，2-丙二醇、甘油、聚乙二醇200、聚乙二醇300、聚乙二醇400或聚乙二醇600中的任意一种或者它们的混合物。
8.根据权利要求I所述的金针菇不皂化提取物留醇的微乳制剂，其特征是所述的油相为植物油或中等脂肪链长度的脂肪酸酯中的任意一种。
9.所述的植物油是大豆油、菜籽油、麻籽油、玉米油、花生油、红花油、橄榄油、棕榈油或葵花籽油的任意一种或者它们的混合物；所述的中等脂肪链长度的脂肪酸酯是油酸乙酯、肉豆蘧酸异丙酯、棕榈酸异丙酯、辛酸甘油单酯、辛酸甘油二酯、辛酸甘油三酯、葵酸甘油单酯、葵酸甘油二酯、葵酸甘油三酯或辛葵酸甘油酯中的任意一种或者它们的混合物。
10.一种制备权利要求I所述的金针菇不皂化提取物留醇的微乳制剂的方法，其特征是包括以下步骤 (1)按权利要求I所述配方的组成和比例称取金针菇不皂化提取物留醇、表面活性剂和油相，在超声条件下促使金针菇不皂化提取物留醇溶解； (2)再加入所述量的助表面活性剂，磁力搅拌下混匀，并且使得金针菇不皂化提取物甾醇进一步溶解完全； (3)最后缓慢加入所述量的蒸馏水，边滴加边搅拌，直至形成均匀、透明的溶液，即得所述的金针菇不皂化提取物留醇的微乳制剂。
全文摘要
一种金针菇不皂化提取物甾醇的微乳制剂，它是以金针菇不皂化提取物甾醇作为原料药，采用表面活性剂、助表面活性剂、油相和蒸馏水组成的混合物作为药物载体，具体的是它包括以下组分0.01%~1%的金针菇不皂化提取物甾醇、10%~40%的表面活性剂、3%~20%的助表面活性剂、1%~10%的油相、40%~80%的分散介质组成，所述的金针菇不皂化提取物甾醇的微乳制剂的粒径在10-50nm之间，所述的金针菇不皂化提取物甾醇是将金针菇子实体用醇溶液提取，通过浓缩、萃取、皂化反应、提取和结晶步骤得到。本发明解决了金针菇不皂化提取物甾醇溶解度低的问题，极大地增大药物的溶解度，提高了药物的生物利用度；本发明公开了其制法。
文档编号A61K36/07GK102872164SQ20121031496
公开日2013年1月16日 申请日期2012年8月30日 优先权日2012年8月30日
发明者徐希明, 易承学, 余江南, 张辉云, 奚超群, 奉建芳 申请人:江苏大学