专利名称：菜蛾盘绒茧蜂抗菌肽防御素基因、抗菌多肽及应用的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学和基因工程技术领域。本发明涉及一种菜蛾盘绒茧蜂抗菌肽基因及其所编码的抗菌肽与应用，尤其涉及一种菜蛾盘绒茧蜂抗菌肽防御素(Cv-def)抗菌肽基因及其所编码的抗菌多肽与所述基因在制备具有抗菌活性的人工合成多肽的应用。
背景技术：
由于传统抗菌素的滥用和耐药菌株的不断产生，严重影响了感染性疾病的临床治疗效果。而抗菌肽具有杀菌强，不易引起耐药性等优点，成为抗菌药物新的研究热点。目前抗菌肽产量低，天然抗菌肽的分离难度大，因而倾向于利用基因工程方法获得抗菌肽。防御素(defensin)是近年来发现的广泛存在于动植物体内的一类阳离 子抗菌多肽，由29 54个氨基酸残基组成，含有6 8个保守的半胱氨酸(通常是6个)，分子量小于5KDa。N端有3个β转角和I个Y转角，中间有I个两亲性的α螺旋，C端有I个反向平行的β折叠，由3 4个二硫键连接α螺旋和β转角，形成特定的CS α β结构。防御素可在特定的细胞中合成并贮存于细胞质的颗粒中，或被病原微生物诱导合成，对多种微生物均具有较强的防御能力，主要作用于病原微生物的细胞膜，使病原微生物不易对其产生抗性，防御素是目前颇具吸引力的一类新型候选抗菌药物。寄生蜂类群中大多数是农林害虫的天敌，在农林业害虫综合防治中起到重要的作用。通过长期的进化，寄生蜂在寄生寄主昆虫后能改变寄主体内的生理环境，其幼虫能够在寄主内正常生长发育，但又不至于使寄主昆虫立刻死亡。虽然目前对寄生蜂对寄生后寄主的生理影响有所了解，但是寄生蜂对寄主调控机理的多样性及分子机理目前尚不清楚。菜蛾盘绒茧蜂是防治小菜蛾的主要优势寄生性天敌，该蜂拥有目前国际上研究所揭示的几乎所有的寄生蜂因子(多分DNA病毒、畸形细胞、毒液)，是一个经过长期自然选择而适应寄生小菜蛾的种类。然而，目前菜蛾盘绒茧蜂的先天免疫系统研究较少，且尚未有文献报道从菜蛾盘绒茧蜂分离得到抗菌肽。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，针对目前菜蛾盘绒茧蜂抗菌肽研究状况及其不足，提供一种具有抗菌活性的菜蛾盘绒茧蜂防御素抗菌肽基因、及其所编码的抗菌多肽，及该抗菌多肽的应用。为解决技术问题，本发明的解决方案是提供一种菜蛾盘绒茧蜂抗菌多肽防御素基因，该基因的核苷酸序列如SEQ IDNO. I所示。本发明还提供了一种由该菜蛾盘绒茧蜂抗菌多肽防御素基因编码的抗菌多肽，该抗菌多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。进一步，本发明提供了一种人工合成的抗菌多肽，是将前述菜蛾盘绒茧蜂抗菌多肽防御素基因编码的抗菌多肽去除信号肽前体后得到的，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 3所示。该人工合成的抗菌多肽是采用固相化学法合成的。本发明还提供所述的抗菌多肽在制备用于治疗革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌感染的食品添加剂或药物中的应用。本发明的有益效果在于本发明所提供的菜蛾盘绒茧蜂抗菌肽防御素(Cv-def)基因及其编码的核苷酸序列，使其能够应用在菜蛾盘绒茧蜂中表达的新的抗菌蛋白、编码序列及其在开发成有应用价值的食品添加剂和药物并应用于农业、工业和食品卫生等多个领域。
图I为本发明中转录组抗菌肽筛选策略。图2为菜蛾盘绒茧蜂抗菌多肽防御素Cv-def基因验证。图3为菜蛾盘绒茧蜂抗菌多肽防御素Cv-def的质谱图。图4为琼脂扩散实验测试合成菜蛾盘绒茧蜂抗菌多肽防御素Cv-def表达对枯草芽孢杆菌的抑制效果图。其中A :氣节青霉素；C :阴性对照0· 1%醋酸溶液；I : I. 25 mg/ml样品；2:O. 625mg/ml 样品；3 0. 313 mg/ml 样品；4 0. 156 mg/ml 样品；5: O. 078mg/ml 样品。图5为琼脂扩散实验测试合成菜蛾盘绒茧蜂抗菌多肽防御素Cv-def表达对金黄色葡萄球菌的抑制效果图。其中Amp :氣节青霉素；C :阴性对照0. 1%醋酸溶液；I :1. 25 mg/ml样品；2 :O. 625 mg/ml 样品。图6为琼脂扩散实验测试合成菜蛾盘绒茧蜂抗菌多肽防御素Cv-def表达对大肠杆菌的抑制效果图。 其中Amp :氣节青霉素；C :阴性对照0. 1%醋酸溶液；I :1. 25 mg/ml样品；2 :O. 625 mg/ml 样品。
具体实施方案本发明所述菜蛾盘绒茧蜂抗菌肽防御素(Cv-def)基因，其核苷酸序列如SEQ IDNO. I所示，该序列特征长度515碱基对；类型核酸；链型双链；拓扑结构线性；分子类型cDNA。其核苷酸序列与埃及伊蚊(Aedes aegypti)防御素抗菌肽至少有70%的同源性。本发明所述菜蛾盘绒茧蜂抗菌肽防御素(Cv-def)基因编码的抗菌多肽，其氨基酸如SEQ ID NO. 2所示。该序列特征长度78氨基酸；类型氨基酸；链型单链；拓扑结构线性；分子类型蛋白质。本发明所述菜蛾盘绒茧蜂抗菌肽基因cDNA的克隆方法是以菜蛾盘绒茧蜂总RNA反转录得到cDNA为模板，构建cDNA文库，构建抗菌肽数据库，与菜蛾盘绒茧蜂转录组本地Blast筛选得到defensin部分cDNA序列,然后经RACE方法扩增得到末端序列，最后经序列拼接获得菜蛾盘绒苗蜂抗菌肽defensin基因cDNA全长序列。本发明提供的一种合成抗菌肽，是根据天然抗菌肽序列结构基础上设计合成的，其制备方法可以是固相化学法。本序列来源为SEQ ID NO. 2去除信号肽前体，具体的序列如 SEQ ID NO. 3 所示。作为本发明菜蛾盘绒茧蜂抗菌多肽防御素Cv-def的改进包括菜蛾盘绒茧蜂抗菌多肽Cv-def为多肽，其保守性变异多肽、其活性片段或活性衍生物。利用琼脂扩散法检测多肽的抗菌活性，氨苄青霉素为对照，进行抗菌活性检测。结果表明本发明合成抗菌肽具有抗革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌活性。因此本发明提供了所述抗菌多肽在制备用于治疗革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌感染的食品添加剂或药物中的应用。本发明通过基于高通量转录组测序方法，以菜蛾盘绒茧蜂为实验材料，通过基因注释和与已有抗菌肽序列进行比对，筛选其体内表达的抗菌肽核苷酸序列片段，并通过RACE方法得到抗菌肽cDNA核苷酸序列全长。得到全长抗菌肽cDNA核苷酸序列后，根据其编码的氨基酸序列，利用固相化学快速合成多肽，并应用于抗菌检测。
在本发明中菜蛾盘绒茧蜂抗菌肽防御素(Cv-def)基因或多肽指具有该菜蛾盘绒茧蜂抗菌肽防御素Cv-def活性的SEQ ID NO. 3序列多肽。该术语还包括具有与天然该菜蛾盘绒茧蜂抗菌肽防御素Cv-def相同功能的SEQ ID NO. 3序列的变异形式。这些变异形式包括若干个氨基酸的缺失、插入或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。在本发明中菜蛾盘绒茧蜂抗菌肽防御素(Cv-def)基因保守性变异多肽指■ 与SEQID NO. 3的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳8个，更佳地至多5个氨基酸性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。本发明还包括菜蛾盘绒茧蜂抗菌肽防御素(Cv-def)基因或多肽的类似物。这些类似物与天然抗菌多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。其中修饰形式包括在不改变一级结构的情况下，体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化、羟基化或糖基化。下面结合实验室具体的实验数据和结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于本发明而不用于限制本发明的范围。下例实施例中未注明具体条件的实验方案，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆实验室手册(New York: Cold SpringHaebor Laboratory Press, 1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。实施案例I :菜蛾盘绒茧蜂转录组数据筛选首先从各网站(APD: http://www. bicnirrh. res. in/antimicrobial/ ; CAMP:http://aps.unmc.edu/AP/main.php ;NCBI: http://www.ncbi.nlm.nih.gov)收集尽量已知所有的抗菌肽序列建立抗菌肽数据库，然后与菜蛾盘绒茧蜂转录组测序数据进行本地BlastX，得到与已知抗菌肽序列相似或同源的部分抗菌肽序列。然后利用RACE技术，得到该片段的全长，经过测序验证后，提交NCBI进行序列比对，并根据该序列6个半胱氨酸排列特征，推测该序列属于昆虫防御素家族。整个数据筛选策略如图I所示。实施案例2:菜蛾盘绒茧蜂抗菌多肽防御素(Cv-def) cDNA克隆
I. I、TRIzol 法提取总 RNA(I)将一定量(5只左右菜蛾盘绒茧蜂)冰冻lmin，放入I. 5ml离心管中，加入ImlTRIzol试剂，充分研磨匀浆，室温静置5min。(2)向离心管中加入0.2ml氯仿，振荡15s，混合液转入TIANGEN离心管中，静置2min。(3)4°C，12000g离心15min，取上清液，将其转入一新1.5ml的离心管中。(4)向离心管中加入O. 5ml异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置lOmin。(5) 4°C, 12000g 离心 IOmin,弃掉上清液。
(6)向离心管中加入Iml 75%乙醇，轻轻洗涤沉淀，4°C，7500g离心5min，弃掉上清液。(此时加入无水乙醇，可于_80°C超低温冰箱中长期保存)(7)晾干离心管，加入适量的DEPC H2O溶解(65°C促溶)，分光光度计测量0D260/0D280的值，比值在I. 8^2. O之间时，进行下一步实验。1.2、cDNA 第一链合成(I)往O. 5ml无菌的离心管中分别加入I μ I提取的RNA，I μ I SMART IV /5’ PCR正向引物，1μ I CDS 111/3’PCR反向引物，加2μ I DEPC H2O使总体积达到5 μ I。(2)混匀离心管中的试剂并短暂离心，72°C孵育2min。(3)迅速将离心管冰浴2min，短暂离心。(4)往离心管中分别加入 2 μ I 5XFrist-strand Buffer, I μ I 20mM 二硫苏糖醇(DTT), I μ I IOmM dNTP, I μ I Reverse Transcriptase 反转录酶，反复吹打混勻，短暂离心。(5)42。(孵育111。(6)将离心管置于冰上疒3min，终止反应。取一部分用于进一步实验，其余于-80°C超低温冰箱冷冻保存。1.3、dsDNA 合成(I)往O. 5离心管中分别加入1μ I第一链合成反应产物，5μ I IOXLA Buffer(Mg2+free) ,5μ I Mg2+, 8 μ I dNTP, I μ I SMART IV/5’PCR 正向引物，I μ ICDS III/3，PCR 反向引物，0. 5μ1 LA Tag DNA聚合酶，29. 5 μ I ddH20，充分混匀，短暂离心。(2)PCR 仪中按以下扩增程序(95°C，20s ;25 28X (95。。，5s ;68°C，6min))扩增。(3)取5μ I PCR产物用于凝胶检测(检测条带所含分子量范围及条带亮暗)，取检测结果良好的I μ I产物稀释100倍用于做以后PCR的模板，其余于-80°c超低温冰箱冷冻保存。1.4、PCR扩增菜蛾盘绒茧蜂抗菌多肽防御素(Cv-def)基因5’和3’末端操作按Clontech 公司试剂盒 SMARTer RACE cDNA Amplification Kit 说明书进行。根据试剂盒的要求，依据已知的Defensin基因EST序列分别设计两条上、下游引物，以进行巢式PCR。所用引物分别为第一次PCR 反应条件为98°C，3min ;30X ( 98°C，IOs ;60°C，20s ;68°C，lmin);68°C，6min。第二次PCR以第一次PCR产物为模板进行扩增，反应条件为95°C，3min ；35X(95。。，25s ；63°C，20s ；72°C, lmin) ；72°C, 6min。将扩增产物连接到 pMD-19 载体上得到重组质粒，并用PMD-19的通用引物M13土进行序列测定，测定结果与已知序列片段进行比较和序列拼接。序列拼接结果在NCBI上进行BlastX，结果表明得到序列与埃及伊蚊抗菌肽defensin基因相似度为70%。实施例3 :菜蛾盘绒苗蜂抗菌多肽防御素(Cv-def)多肽合成、抑菌功能测定3. I菜蛾盘绒茧蜂抗菌多肽防御素Cv-def多肽合成和纯化(由上海生工生物工程股份有限公司完成)a.仪器新加坡玻璃仪器厂BZ24/29 D=2. 5CM北京创新通恒LC 3000制备型液相色谱仪；岛津公司的LC IOAvp高效液相色谱仪Waters公司的ZQ-2000质谱仪b.多肽合成流程
肽链合成采用标准Fmoc化学作用的固相法合成。具体合成由下列几个循环组成I.去保护Fmoc保护的柱子和单体必须用一种碱性溶剂(piperidine)去除氨基的保护基团。2.激活和交联下一个氨基酸的羧基被一种活化剂所活化。活化的单体与游离的氨基反应交联，形成肽键。在此步骤使用大量的超浓度试剂驱使反应完成。循环这两步反应反复循环直到合成完成。3.洗脱和脱保护多肽从柱上洗脱下来，其保护基团被一种脱保护剂(TFA)洗脱和脱保护。大致的步骤为先用浸泡树脂，再将氨基酸接在树脂上，按照序列中特定的顺序一直接到最好一个氨基酸，经过缩合-脱保护-缩合-脱保护-缩合-脱保护。最后将多肽从树脂上裂解下来，得到粗肽。采用高效液相色谱(HPLC)进一步的精制、分离与纯化合成肽链，收集到目标肽后进行质谱鉴定。3. 2合成肽抗菌活性的测定本发明涉及供试菌株有革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、昆虫病原真菌和酵母。其中革兰氏阳性菌为金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus);革兰氏阴性菌为肠道沙门氏菌(Salmonella enteritidis)和大肠杆菌(Escherichia coli );昆虫病原真菌为球抱白僵菌(Beuaveria bassiana)、金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae);植物病原真菌灰霉菌(Botrytis cinerea);酵母为毕赤酵母(pichia pastoris)。实验前，将2. 5mg合成肽固体溶于2ml 0.01%的乙酸溶液中配成I. 25 mg/ml的样品母液，并分装保存于_80°C。按琼脂平板扩散抑制试验进行本抗菌试验，具体步骤为供试菌株在培养基(细菌培养基为MH培养基，真菌和酵母培养基分别为改良马丁和YDP培养基)中生长到0D600为0. 8后，加入至预融并降温至40°C左右的相应固体培养基，混匀，倒板等其冷却后，将三层滤纸片(新华I号定性滤纸，打孔器打成6mm的小纸片，灭菌烘干备用)放置于培养基上，然后滴加10 μ I合成肽溶液与滤纸片上，用卡那霉素做阳性对照，0.01%的乙酸溶液为阴性对照，正面向上吸收完全后倒置培养过夜。观察抑菌圈，测其大小。菜蛾盘绒茧蜂抗菌多肽防御素Cv-def抗菌活性结果如图所示，菜蛾盘绒茧蜂抗菌多肽防御素Cv-def具有抗革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌活性，对真菌和酵母无抗性。3.3体外溶血活性测定本实施案例用于检测合成的多肽的对于哺乳动物红细胞是否具有溶血活性，其测定方法如下
取新鲜提取的小鼠血液，4。(^下1500 rpm离心10 min,弃血清,将血细胞用预冷的O. 15 M，pH 7.2的PBS缓冲液润洗3次(3000 rpm)，最后用PBS将血细胞的浓度调整为 0.5%。取 75 μ I 血细胞悬液加 75 μ I 不同浓度(L 25、0· 625、0· 313、0· 156、0· 078mg/ml)的合成肽溶液于96孔板中。37°C水浴中孵育I小时，4000 rpm离心10 min后取60 μ I上清液检测紫外分光光度(波长414 nm)。设阴性和阳性对照(0%和100%溶血)，阴性对照为加入PBS缓冲液的血细胞悬浮液，阳性对照为加入O. 1% Triton X-100的血细胞悬浮液；用下列公式计算溶血性溶血作用=(抗菌肽光密度值-阴性对照光密度值)/(O. l%Triton X-100光密度值-阴性对照光密度值)X 100。取三次实验的平均值为最终实验结果，检测结果见下表I。表I合成肽的溶血活性
权利要求
1.一种菜蛾盘绒茧蜂抗菌多肽防御素基因，其特征在于，该基因的核苷酸序列如SEQID NO. I 所示。
2.权利要求I所述菜蛾盘绒茧蜂抗菌多肽防御素基因编码的抗菌多肽，其特征在于，该抗菌多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
3.—种人工合成的抗菌多肽，其特征在于，是将权利要求2中所述菜蛾盘绒茧蜂抗菌多肽防御素基因编码的抗菌多肽去除信号肽前体后得到的，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 3所示。
4.根据权利要求3所述的抗菌多肽，其特征在于，该人工合成的抗菌多肽是采用固相化学法合成的。
5.权利要求3或4所述的抗菌多肽在制备用于治疗革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌感染的食品添加剂或药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及基因工程技术领域，旨在提供一种菜蛾盘绒茧蜂抗菌肽防御素基因、抗菌多肽及应用。该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，该基因编码的抗菌多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；将该抗菌多肽去除信号肽前体后还得到的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的抗菌多肽。本发明还提供了抗菌多肽合成方法及在制备用于治疗革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌感染的食品添加剂或药物中的应用。本发明所提供的菜蛾盘绒茧蜂抗菌肽防御素(Cv-def)基因及其编码的核苷酸序列，使其能够应用在菜蛾盘绒茧蜂中表达的新的抗菌蛋白、编码序列及其在开发成有应用价值的食品添加剂和药物并应用于农业、工业和食品卫生等多个领域。
文档编号A61P31/04GK102816770SQ20121031502
公开日2012年12月12日 申请日期2012年8月30日 优先权日2012年8月30日
发明者陈学新, 王知知, 时敏, 赵伟 申请人:浙江大学