专利名称：一种接骨片的制备方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及中药制剂技术领域，具体涉及一种接骨片的制备方法及应用。
背景技术：
接骨片记载于卫生部标准WS3-B-0402-90，由川芎39g、制川乌39g、当归39g、醋炙乳香39g、醋炙没药39g、煅自然铜39g作为原料药制成，能散瘀、活血、止痛、用于跌打损伤， 筋伤骨折，瘀血肿痛。
现有技术中，尚未有接骨片在提取制备方面采用超临界和微波技术的报道，而采用打粉和水煎煮的方法，工艺粗糙、落后，杂质多，导致患者用量过大，不方便服用，严重影响了本品在临床上应用。发明内容
发明目的为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种接骨片的制备方法。
本发明的另一个目的在于提供一种接骨片在制备抑制小鼠白血病细胞NFS-60细胞增殖药物中的应用。
技术方案本发明的目的是通过如下的方案实现的
一种接骨片的制备方法，由川芎39g、制川乌39g、当归39g、醋炙乳香39g、醋炙没药39g、煅自然铜39g作为原料药制成，所述的方法由下列步骤组成取川芎、当归、醋炙乳香、醋炙没药，加入到C02超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂的体 积百分比为4-6%，萃取压力15-30MPa，温度30-50。。，CO2流量l_3ml/g生药· min，萃取时间 150-180min，得超临界萃取物，备用；取其余中药，粉碎，加入2L的70%乙醇，投入微波萃取装置中进行微波萃取，萃取功率400-600W，萃取2次，每次4-8分钟，合并萃取液，浓缩，加到 D102大孔吸附树脂柱上，50%乙醇洗脱，收集5倍量柱体积洗脱液，减压回收乙醇，浓缩并干燥，得微波提取物，备用；将上述超临界萃取物和微波提取物混合，加入淀粉，70%乙醇制颗粒,干燥,压片，制成1000片，每片重O. 5g。
上述一种接骨片的制备方法，所述CO2超临界萃取夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为5%。
上述一种接骨片的制备方法，所述微波萃取功率500W，每次萃取6分钟。
上述一种接骨片的制备方法，所述CO2超临界萃取的萃取压力20MPa，温度40°C， CO2流量2ml/g生药· min,萃取时间160min。
上述接骨片在制备抑制小鼠白血病细胞NFS-60细胞增殖药物中的应用。
现有技术中，接骨片每片O. 5g，每次2片，一日2次，采用本发明制备成的接骨片每片O. 5g，每次仅需I片，一日服用2次，在具有更多活性成分的条件下大大减少了服用量。 此结论可以通过下述试验证明。
试验一、不同方法制备的接骨片中阿魏酸含量的比较
1、仪器及试药本发明接骨片按实施例3方法制备，使用195g原料药，经提取制成1000片，每片重O. 5g。原接骨片，按部颁标准方法制备，使用195g原料药，经提取制成 1000片，每片重O. 5g。Agilent 1200高效液相色谱仪；METTLER AE240电子分析天平；阿魏酸对照品(中国药品生物制品检定所)。
2、方法
色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-水-磷酸(40 60 :0. 2)为流动相；检测波长为280nm。理论板数按阿魏酸峰计算，应不低于3000。
对照品溶液的制备精密称取在60°C减压干燥4小时的阿魏酸对照品适量，加甲醇制成每Iml含18 μ g的溶液，即得。
供试品溶液的制备取本发明接骨片和原接骨片，研细，混匀，取lg，精密称定，精密加入70%乙醇20ml，密塞，超声处理10分钟，离心，取上清液，即得。
测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20 μ 1，注入液相色谱仪，测定，即得。
3、结果
结果表明，本发明接骨片中阿魏酸的含量为2. 34mg/片；而原接骨片中阿魏酸的含量为O. 65mg/片，在服用量减少的情况下，阿魏酸含量有很大提高。
上述研究表明，采用本发明制备的接骨片，有效成分含量高于部颁标准法制备的接骨片。
具体实施方式
以下通过实施例形式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
实施例1
取川芎39g、制川乌39g、当归39g、醋炙乳香39g、醋炙没药39g、煅自然铜39g，将川芎、当归、醋炙乳香、醋炙没药，加入到C02超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为4%，萃取压力15MPa，温度301，0)2流量lml/g生药·π η，萃取时间150min，得超临界萃取物，备用；取其余中药，粉碎，加入2L的70%乙醇，投入微波萃取装置中进行微波萃取，萃取功率400W，萃取2次，每次4分钟，合并萃取液，浓缩，加到D102 大孔吸附树脂柱上，50%乙醇洗脱，收集5倍量柱体积洗脱液，减压回收乙醇，浓缩并干燥， 得微波提取物，备用；将上述超临界萃取物和微波提取物混合，加入淀粉，70%乙醇制颗粒， 干燥，压片，制成1000片，每片重O. 5g。
经检测，成品中阿魏酸的含量为2. 55mg/片。
实施例2
取川芎39g、制川乌39g、当归39g、醋炙乳香39g、醋炙没药39g、煅自然铜39g，将川芎、当归、醋炙乳香、醋炙没药，加入到CO2超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为6%，萃取压力30MPa，温度50°C，CO2流量3ml/g生药· min，萃取时间180min，得超临界萃取物，备用；取其余中药，粉碎，加入2L的70%乙醇，投入微波萃取装置中进行微波萃取，萃取功率600W，萃取2次，每次8分钟，合并萃取液，浓缩，加到D102 大孔吸附树脂柱上，50%乙醇洗脱，收集5倍量柱体积洗脱液，减压回收乙醇，浓缩并干燥，得微波提取物，备用；将上述超临界萃取物和微波提取物混合，加入淀粉，70%乙醇制颗粒， 干燥，压片，制成1000片，每片重O. 5g。
经检测，成品中阿魏酸的含量为2. 54mg/片。
实施例3
取川芎39g、制川乌39g、当归39g、醋炙乳香39g、醋炙没药39g、煅自然铜39g，将川芎、当归、醋炙乳香、醋炙没药，加入到CO2超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为5%，萃取压力20MPa，温度40°C，CO2流量2ml/g生药· min，萃取时间160min，得超临界萃取物，备用；取其余中药，粉碎，加入2L的70%乙醇，投入微波萃取装置中进行微波萃取，萃取功率500W，萃取2次，每次6分钟，合并萃取液，浓缩，加到D102 大孔吸附树脂柱上，50%乙醇洗脱，收集5倍量柱体积洗脱液，减压回收乙醇，浓缩并干燥， 得微波提取物，备用；将上述超临界萃取物和微波提取物混合，加入淀粉，70%乙醇制颗粒， 干燥，压片，制成1000片，每片重O. 5g。
经检测，成品中阿魏酸的含量为2. 34mg/片。
实施例4 :接骨片抑制NFS-60细胞增殖的实验研究资料
I实验材料
1.1实验用细胞株
小鼠白血病细胞(NFS-60)，南京正宽医药科技有限公司实验室细胞库， DMEM+10%FBS常规培养。
1. 2实验药物
研究药物本发明接骨片按实施例3方法制备。·
药液储液称取IOOmg接骨片，溶于5ml无水乙醇中，O. 2 μ m滤器过滤，500 μ I doff管分装，-20°C存储，同时O. 2 μ m滤器过滤无水乙醇以备对照组之用。
1. 3实验试剂
DMEM(GIBC0 公司 Cat. No. 12100-061 Lot. No. 758137);胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司Lot. No. 100419);NaHC03(上海久亿化学试剂有限公司Cat. No. 11810-033 Lot. No. 1088387)；Trypsin (AMRESC0 公司批号2010/04)；EDTA (AMRESC0 公司批号:2009/10); Penicillin G Sodium Salt(AMRESC0公司批号2010242)；Streptomycin SulfateCAMRESCO 公司批号2010382);无水乙醇(南京化学试剂有限公司批号080310182);MTT(Biosharp批号:0793) ;PBS (实验室自配)；
1. 4实验器材
莱卡倒置显微镜(德国Leica型号DM1L);可见-紫外光微孔板检测仪(美国MD 公司型号SPECTRAMAX 190) ;C02培养箱(FORMA型号3111);超净台(苏净集团安泰公司制造型号SW-CJ-ZFD);纯水仪(美国Spring公司型号S/N 020579);精密移液器(法国吉尔森公司型号P2);电子天平(德国赛多利斯有限公司型号BT323S);全自动高压灭菌锅 (日本SANK)公司型号MLS-3020);台式电热鼓风干燥箱(上海精密实验设备公司型号 DHG9123A);冰箱(西门子公司型号KG18V21TI);液氮罐(CBS型号:2001);低速离心机(上海安亭科学仪器厂型号ΚΑ-1000) ;0. 2μπι滤器(MILLIP0RE型号SLGP033RB) ;IOcm培养皿(NEST公司)、96孔培养板(NEST公司)；细胞计数板；离心管、移液管、Tips若干。
2实验方法
I) NFS-60 细胞用 DMEM+10%FBS 于 37 °C、5%C02 进行常规培养(IOcm 培养皿)， 当细胞生长至对数期时，收集细胞，弃去培养液，PBS轻洗3遍，加入3ml O. 25%胰蛋白酶-O. 049ffiDTA，37°C消化2min后，向其中加入5ml完全培养基中和反应，吹打细胞后将其转入离心管中，IOOOrpm离心5min，调整细胞悬液浓度3X 104个/ml。
2)将细胞种入96孔培养板中，每孔加入细胞悬液180 μ I,培养板放入细胞培养箱中(37 °C，5%C02 )常规培养。
3)根据细胞生长情况，一般长至50%_70%，加入接骨片溶液，继续培养24h。
4) 24h 后加入 20 μ I MTT 溶液(5mg/ml，即 O. 5%MTT)，继续培养 4h。
5) 4h后扣板法倒去上清，用吸水纸轻轻拍干，每孔加入200 μ I 二甲基亚砜，置摇床上低速振荡lOmin，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪490nm处测量各孔的吸光值。
6)同时设置本底(不加细胞，只加培养液) ，对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜)，每组设定6个复孔。
7)结果以药物对细胞的抑制率表示
细胞增值抑制率(％)=(对照孔OD值-给药孔OD值)/对照孔OD值X 100%。实验重复3次。
3统计处理
采用Microsoft Excel 2003软件中的相关分析和Student t检验，数据以 mean + S. D.表不。
4实验结果
MTT法实验后统计结果显示，与对照组比较，当剂量达到5mg/ml时，对NFS-60细胞增殖抑制有差异(p〈0. 05)，剂量在10mg/ml时该差异具有显著性(P〈0. 01)，当剂量达到 15-20mg/ml时有极显著性差异(Ρ〈0· 001)。
表I接骨片对NFS-60细胞增殖抑制影响研究(X + SD)
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注与对照组比较，*P〈0.01 ;**Ρ〈0· 001
5实验结论
接骨片可以抑制NFS-60细胞增殖，减少NFS-60细胞的细胞生长数目，该作用呈剂量依赖性。
权利要求
1.一种接骨片的制备方法，由川芎39g、制川乌39g、当归39g、醋炙乳香39g、醋炙没药39g、煅自然铜39g作为原料药制成，其特征在于所述的方法由下列步骤组成取川芎、当归、醋炙乳香、醋炙没药，加入到CO2超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为4-6%，萃取压力15-30MPa，温度30_50°C，CO2流量l_3ml/g生药·π η，萃取时间150-180min，得超临界萃取物，备用；取其余中药，粉碎，加入2L的70%乙醇，投入微波萃取装置中进行微波萃取，萃取功率400-600W，萃取2次，每次4-8分钟，合并萃取液，浓缩，加到D102大孔吸附树脂柱上，50%乙醇洗脱，收集5倍量柱体积洗脱液，减压回收乙醇， 浓缩并干燥，得微波提取物，备用；将上述超临界萃取物和微波提取物混合，加入淀粉，70% 乙醇制颗粒，干燥，压片，制成1000片，每片重O. 5g。
2.根据权利要求1所述一种接骨片的制备方法，其特征在于所述CO2超临界萃取夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为5%。
3.根据权利要求1所述一种接骨片的制备方法，其特征在于所述微波萃取功率500W， 每次萃取6分钟。
4.根据权利要求1所述一种接骨片的制备方法，其特征在于所述CO2超临界萃取的萃取压力20MPa,温度40°C, CO2流量2ml/g生药· min,萃取时间160min。
5.根据权利要求1所述一种接骨片在制备抑制小鼠白血病细胞NFS-60细胞增殖药物中的应用。
全文摘要
本发明提供一种接骨片的制备方法，由川芎39g、制川乌39g、当归39g、醋炙乳香39g、醋炙没药39g、煅自然铜39g作为原料药制成，采用超临界萃取和微波萃取制备而成，使得阿魏酸含量有很大提高，本发明还提供了接骨片在制备抑制小鼠白血病细胞NFS-60细胞增殖药物中的应用。
文档编号A61K9/20GK102988509SQ20121038890
公开日2013年3月27日 申请日期2012年10月15日 优先权日2012年10月15日
发明者不公告发明人 申请人:李正梅