冻干海藻糖磷酸钙bmp-2缓释材料及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种冻干海藻糖磷酸钙BMP-2缓释材料及其制备方法，将骨诱导因子BMP-2与海藻糖溶液滴加到磷酸钙支架材料表面，先置于-80°C冰箱中，预冻3小时后放入冻干机中进一步冻干24小时即可。通过添加海藻糖提高磷酸钙BMP-2缓释材料中骨诱导因子的生物活性以及优化骨诱导因子的缓释速度，延长骨诱导因子的保存时间，提高磷酸钙生物支架材料构建组织工程化骨的成骨效率。
【专利说明】冻干海藻糖磷酸钙BMP-2缓释材料及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及组织工程技术，具体地说，涉及一种冻干海藻糖磷酸钙BMP-2缓释材料及其制备以及在骨组织再生中的应用。
【背景技术】 [0002]骨组织缺损的修复与重建仍然是生物学和临床医学面临的重大难题，利用组织工程技术构建骨组织为骨缺损的修复提供了新的思路。磷酸钙(CPC)类支架材料是组织工程技术中常用的支架材料，具有良好的生物相容性和骨传导性，但缺乏骨诱导性。近年来，有学者通过冻干法将成骨诱导因子与磷酸钙材料复合以增加材料的骨诱导性。这种方法虽然可以在一定程度上达到提高磷酸钙类材料骨诱导性的效果，但是在冻干过程中所产生的冷冻和干燥压力会破坏骨诱导因子的生物活性，并且在骨诱导因子和磷酸钙材料之间产生较大的结合力使其很难从材料表面释放而发挥促进成骨的作用；同时在存放过程中骨诱导因子也易因温度、PH值的变化和(或)酶的作用而发生进一步的变性。为了能够保护骨诱导因子的生物活性在冻干过程中不受影响，优化骨诱导因子的释放速度，并有效保存骨诱导因子的生物学活性，我们选择对蛋白质分子有保护作用的海藻糖为保护剂，尝试通过冻干的方法将骨诱导因子(骨形态发生蛋白2，BMP-2)与磷酸钙材料复合，并将这种方法制备的磷酸钙缓释材料与未添加海藻糖的磷酸钙缓释材料相对照，分析添加海藻糖后对骨诱导因子生物活性，缓释速度以及成骨效果的影响，探索以海藻糖为保护剂通过冻干法在制备磷酸钙骨诱导因子缓释材料中的可行性。
[0003]为了优化磷酸钙BMP-2缓释材料的缓释效果，有研究先将白蛋白溶液预处理磷酸钙材料，然后在复合BMP-2以减小BMP-2与磷酸钙材料之间的结合力，从而促进BMP-2的缓释；也有研究将壳聚糖或者凝胶包裹BMP-2蛋白形成微球结构，然后与磷酸钙材料复合。虽然这些方法可以改善磷酸钙BMP-2缓释材料的缓释效果，但是效果有限，且目前的研究都未曾对复合后以及释放后的BMP-2的生物活性进行明确的阐述，所制备的磷酸钙BMP-2缓释材料是否可以保存及保存有效期限亦未曾报道。本研究所采用的海藻糖(Trehalose)是生物组织的非特异性天然保护剂，属于非渗透性低温保护剂，可使生物体及生物大分子的活性在冷冻、高温、脱水、高渗透压及有毒试剂等环境中仍然能够得以保持。目前其已广泛应用于医学及生物学领域，有学者将其用于保存血小板、细胞、组织、器官、疫苗、蛋白质等，并取得了显著的成果，但未曾应用于缓释材料的制备。发明人前期已经将磷酸钙材料用于骨组织缺损的修复，表现出良好的生物相容性和骨传导性。通过此项研究，我们可以进一步改善磷酸钙类生物支架材料的骨诱导性，延长骨诱导因子的保存时间，优化骨诱导因子的缓释速度，提高磷酸钙生物支架材料构建组织工程化骨的成骨效率。
【发明内容】
[0004]本发明的第一个目的是，提供一种具有优良骨诱导性的磷酸钙BMP-2缓释材料。
[0005]本发明的第二个目的是，提供一种具有优良骨诱导性的磷酸钙BMP-2缓释材料的制备方法。
[0006]本发明的第三个目的是，提供一种具有优良骨诱导性的磷酸钙BMP-2缓释材料的应用。
[0007]本发明的第四个目的是，提供海藻糖在促进磷酸钙BMP-2缓释材料的骨诱导性中的应用。
[0008]为了实现上述第一个发明目的，本发明提供了一种冻干海藻糖磷酸钙BMP-2缓释材料，其特征在于，磷酸钙BMP-2缓释材料添加海藻糖。
[0009]为了实现上述第二个发明目的，本发明提供了冻干海藻糖磷酸钙BMP-2缓释材料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤:将骨诱导因子BMP-2与海藻糖溶液滴加到磷酸钙支架材料表面，先置于-80° C冰箱中，预冻3小时后放入冻干机中进一步冻干24小时即可。
[0010]作为一个优选方案，所述骨诱导因子BMP-2的浓度是I mg/ml，所述海藻糖溶液的浓度是0.3 mol/1 ο
[0011]为了实现上述第三个发明目的，本发明提供了的冻干海藻糖磷酸钙BMP-2缓释材料在骨组织再生中的应用。
[0012]为了实现上述第四个发明发明，本发明提供了海藻糖在促进磷酸钙BMP-2缓释材料的骨诱导性中的应用。
[0013]本发明的优点在于，通过对冻干海藻糖磷酸钙BMP-2缓释材料与未添加海藻糖的磷酸钙BMP-2缓释材料的生物学特性体内外比较，探索冻干海藻糖磷酸钙BMP-2缓释材料中骨诱导因子的生物活性和缓释规律及其在再生医学中的价值。研究结果表明冻干海藻糖磷酸钙BMP-2缓释材料有如下的特点:(1) BMP-2可以从磷酸钙材料表面持续释放。(2)冻干过程没有对BMP-2的生物活性产生影响。(3)缓释材料能够较好的促进骨髓基质细胞的成骨分化。(4)添加海藻糖能够延长BMP-2的保存时间。(5)与骨髓基质细胞复合具有较好的促进大鼠临界大小颅骨缺损修复的能力。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1.磷酸钙缓释生物支架材料的扫描电镜观察。分别为冻干海藻糖磷酸钙BMP-2缓释材料(A)、冻干磷酸钙BMP-2缓释材料(B)、单纯磷酸钙支架材料(C)(标尺为5μ m)。
[0015]图2.冻干海藻糖磷酸钙BMP-2缓释材料(Lyo-Tre-BMP_2)与冻干磷酸钙BMP-2缓释材料(Lyo-BMP-2) BMP-2缓释曲线图。
[0016]图3.冻干海藻糖磷酸钙BMP-2缓释材料(Lyo-Tre-BMP_2)与冻干磷酸钙BMP-2缓释材料(Lyo-BMP-2)所释放BMP-2的生物活性分析。
[0017]图4.冻干海藻糖磷酸钙BMP-2缓释材料(Lyo-Tre-BMP_2)与冻干磷酸钙BMP-2缓释材料(Lyo-BMP-2)对骨髓基质细胞成骨分化相关基因的影响，分别为Runx2 (A)、OPN (B)、0CN (C),BSP (D) (*表示与Lyo-BMP-2材料组和单纯CPC组相比有统计学差异，Ρ〈0.05)。
[0018]图5.冻干海藻糖磷酸钙ΒΜΡ-2缓释材料(Lyo-Tre-BMP_2)与冻干磷酸钙BMP-2缓释材料(Lyo-BMP-2)对骨髓基质细胞增殖的影响(*表示与单纯细胞组(Blank组)相比有统计学差异，P〈0.05)。
[0019]图6.不同存贮时间和温度对冻干海藻糖磷酸钙BMP-2缓释材料(Lyo-Tre-BMP-2)与冻干磷酸钙BMP-2缓释材料(Lyo-Tre_BMP-2) BMP-2生物活性的影响(图A:存贮2周，图B:存贮5周；*表示与Lyo-Tre-BMP-2组相比有统计学差异，P〈0.05)。
[0020]图7.4组细胞材料复合体植入大鼠颅骨缺损5周后的非脱钙组织切片，分别为冻干海藻糖磷酸钙BMP-2缓释材料+细胞组(A: Lyo-Tre-BMP-2)、冻干磷酸钙BMP-2缓释材料+细胞组(B: Lyo-BMP-2)、磷酸钙材料+细胞组(C: bMSC/CPC)、单纯磷酸钙材料组(D:CPC) (200X)。(E)表示四组植入体成骨面积分析(*表示两组间有统计学差异，P〈0.05)。
【具体实施方式】
[0021]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Samtoook等人，分子克隆:实验室手册(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0022]实施例1.冻干海藻糖磷酸钙BMP-2缓释材料的制备及生物学特性 步骤一、海藻糖BMP-2溶液的配制
以无菌双蒸水ddH20为溶剂,在超净台中按lmg/ml BMP-2, 0.3mol/l (113.5mg/ml)海藻糖的浓度配制海藻糖BMP-2的混合溶液，同时配制lmg/ml的BMP-2溶液。 [0023]步骤二、冻干海藻糖磷酸钙BMP-2缓释材料的制备和扫描电镜观察
(I)材料的制备:磷酸钙(CPC)生物支架材料(直径5mm，厚度2mm，孔隙率75%)高温消毒备用，与海藻糖BMP-2溶液复合前24小时与无菌ddH20中浸泡以充分排出孔隙中的气泡。用消毒滤纸吸出孔隙中的液体后滴加30 μ I海藻糖ΒΜΡ-2溶液,30min后待溶液完全吸入支架材料内，将材料放入-80° C冰箱中预冻3小时，然后再置于冷冻干燥机中，继续冻干24小时，即完成冻干海藻糖磷酸钙BMP-2缓释材料的制备。按同样方法制备冻干磷酸钙BMP-2缓释材料。
[0024](2)材料扫描电镜观察:将制备的缓释材料迅速置入戊二醛液中固定2小时，漂洗样品3次，用饿酸固定样品1.5-2小时，漂洗样品3次，乙醇系列脱水，然后置于醋酸异戊酯中过渡，用临界点干燥仪进行干燥。最后，用离子真空喷度仪喷金，将喷金样品置于扫描电镜样品室内，抽真空后Philips SEM XL-30扫描电子显微镜进行观察。
[0025]步骤三、冻干海藻糖磷酸钙BMP-2缓释材料的生物学特性检测
(I)材料BMP-2缓释检测:将制备好的缓释材料置于离心管中，加入Iml PBS溶液，于加入？85后的1小时、1、3、7、10、14、21、28天分别从离心管中吸取10(^1溶液，并置换为新的PBS溶液Iml。吸取的BMP-2溶液用BMP-2酶联免疫ELISA试剂盒检测BMP-2的浓度，并根据初始BMP-2浓度计算不同时间点BMP-2的释放百分比。
[0026](2)骨髓基质细胞的培养:无菌状态下,取6周龄雄性Fischer 344大鼠胚骨和股骨，切除两端干骺端，显露骨髓腔，用含有肝素(200U/ml)、10%FBS的DMEM培养液冲洗骨髓腔，所得细胞悬液1200rpm离心5分钟，吸去上清液和漂浮于液面的脂肪。加DMEM培养液，均匀吹散至10ml，接种于直径为IOcm的培养皿中，置于培养条件为37° C，100%饱和湿度的培养箱中培养。待细胞生长增殖成单层细胞后，吸去培养液，PBS轻摇洗两次后用0.25%胰蛋白酶液消化，收集细胞于无菌离心管。离心去上清液并加入培养液，接种于培养皿中。同样的方法进行二次传代，取第三代细胞进行以下实验。
[0027](3)缓释液BMP-2生物活性检测
收集前7天的BMP-2缓释液用于BMP-2生物活性检测。将第三代骨髓基质细胞以
2.0 X IO4每孔的密度接种于48孔板，24小时后，培养液换为含5%FBS的DMEM培养液，同时加入100ng/ml的BMP-2缓释液，以相同浓度的新鲜BMP-2为阳性对照；培养3、7、14天后用Triton X-100分别裂解细胞，用ALP定量试剂盒检测经BMP-2缓释液诱导后ALP蛋白的表达，同时用BCA法检测细胞总蛋白的表达，计算ALP在总蛋白中的百分比以确定BMP-2的生物活性。
[0028](4)材料对骨髓基质细胞成骨相关基因表达的影响
将第三代骨髓基质细胞以lX105cell/ml的密度接种于6孔的Transwell培养系统(上层为材料，下层为细胞)，加入DMEM培养液(完全覆盖材料)，培养3、7、14天后提取细胞总RNA并逆转cDNA，进行realtime-PCR反应(ABI 7300实时荧光定量PCR 仪)。各基因及引物设计如下:Runx2 S: 5 ’ -GCTTCTCCAACCCACGAATG-3，，Runx2A: 5’ -GAACTGATAGGACGCTGACGA-3’ ; OPN S: 5’ -GACGGCCGAGGTGATAGCTT-3’ ， OPNA: 5’ -CATGGCTGGTCTTCCCGTTGC-3’，OCN S: 5’ -AAAGCCCAGCGACTCT-3’，OCN A:5’ -CTAAACGGTGGTGCCATAGAT-3’ ; BSP S: 5’ -GATAGTTCGGAGGAGGAGGG-3’ ， BSP A:5’ -CTAACTCCAACTTTCCAGCGT-3’ ; GAPDH S: 5’ -CCTGCACCACCAACTGCTTA-3’ ， GAPDH A:5’ -GGCCATCCACAGTCTTCTGAG-3’，退火温度 58。C，预计产物大小分别是 212bp、208bp、232bp、172bp、140bp。基因表达变化以未放置任何材料的单纯细胞为对照。
[0029](5)材料对骨髓基质细胞增殖的影响
将第三代骨髓基质细胞以5X 104cell/ml的密度接种于6孔的Transwell培养系统(上层为材料，下层为细胞)，加入DMEM培养液(完全覆盖材料)，培养1、3、7、14天后用细胞增殖试剂盒检测细胞中DNA含量的变化以确定细胞增殖情况，以未放置任何材料的单纯细胞为对照。
[0030](6)存贮时间和温度对BMP-2生物活性的影响
缓释材料密封在离心管中分别放置于-20° C、4° C、25° C的环境温度下，2周和5周后分别取出置于PBS溶液中一周，取100ng/ml BMP-2缓释液检测其生物学活性，方法同步骤三(3)，以相同浓度的新鲜BMP-2为阳性对照，计算材料组ALP含量与新鲜BMP-2组ALP
含量百分比。
[0031]实施例2.冻干海藻糖磷酸钙BMP-2缓释材料复合骨髓基质细胞修复大鼠临界大小颅骨缺损的实验
步骤一、材料与细胞复合
将如前所述的第三代大鼠骨髓基质细胞制成细胞密度为20X 106/ml的细胞悬液，缓慢滴加到材料表面至饱和状态，复合后的细胞支架材料复合物即刻植入。
[0032]步骤二、大鼠颅骨缺损修复
取上述所构建的组织工程复合体植入大鼠颅骨临界大小骨缺损，实验按照随机原则分为:冻干海藻糖磷酸钙BMP-2缓释材料+细胞组(η = 12)，冻干磷酸钙ΒΜΡ-2缓释材料+细胞组(η = 12)，磷酸钙材料+细胞组(η = 12)，单纯磷酸钙材料组(η = 12)。观察时间为5周。取12周龄雄性Fischer 344大鼠,全麻下颉顶骨部皮肤备皮,消毒后沿矢状向切开皮肤黏膜，在左右颅顶骨分别制备直径为5mm的全层缺损，分别将各组复合体植入缺损部位，分层缝合，术后青霉素30万单位肌注3天，预防感染。术后5周取材。
[0033]步骤三、组织病理学观察
标本处理过程如下:①固定:10%甲醛溶液固定3d，自来水冲洗过夜梯度酒精脱水:75%，85%，90%, 95%，100% 5个梯度对标本行脱水处理。每个梯度2d 透明化:弃酒精，将标本放在甲苯中浸泡4h ;④包埋:将标本放入单体中，单体应高于标本顶部1-1.5cm，加入固化单体(最为催化剂)，在干燥器内抽气处理(防止产生气泡)，4° C放置一周，室温下放置至单体变粘稠，转入37° C烘箱内至单体硬化。⑤硬组织切片:MMA完全硬化后，采用LeicaSP1600硬组织切片机切片，切片厚度为150 μ m,打磨至50 μ m,封片，抛光。苦味酸-品红(Van Geison)染色:①超声洗片2min 将切片放置在0.1 %甲酸溶液中3min，水冲洗切片2min。③将切片放置20%甲醇溶液中，2h，擦干。④60° C Stevenol蓝染色5_15min，流水冲洗切片2 mirio⑤Van Geison—苦味酸品红染色3_8min, 100%乙醇清洗；蒸懼水洗，晾干。切片在40X下整体统计新骨形成面积百分比。
[0034]统计方法:组间差异采用ANOVA和SNK法进行统计分析，所有统计过程均在SAS
6.12统计分析软件中进行。P〈0.05表示具有统计学意义。
[0035]实验结果
材料电镜观察:冻干海藻糖磷酸钙BMP-2缓释材料表面可见玻璃态的海藻糖晶体和BMP-2颗粒(图1A)，冻干磷酸`钙BMP-2缓释材料表面可见大量的BMP-2颗粒紧密粘附在磷酸钙晶体表面(图1B)，磷酸钙材料的表面为成簇的片状磷灰石晶体(图1C)。
[0036]材料BMP-2缓释曲线:冻干海藻糖磷酸钙BMP-2缓释材料能够持续释放BMP-2，未见明显的平台期，28天的累积释放量超过50%;而冻干磷酸钙BMP-2缓释材料的释放速度较慢，10天后基本进入平台期,28天累积释放量不足30% (图2)。
[0037]冻干对BMP-2生物活性的影响:BMP-2缓释液与细胞培养后的3、7、14天，冻干海藻糖磷酸钙BMP-2缓释材料所释放的BMP-2与新鲜BMP-2的活性未见明显差别(P>0.05)，而冻干磷酸钙BMP-2缓释材料所释放的BMP-2活性明显低于其他两组(P〈0.05)，说明冻干过程中添加海藻糖可以保护BMP-2，使其活性不受影响(图3)。
[0038]材料对细胞成骨分化的影响:骨髓基质细胞与冻干海藻糖磷酸钙BMP-2缓释材料共培养，细胞中Runx2、OPN mRNA的表达较冻干磷酸钙BMP-2缓释材料组在第3、7、14天时均明显升高(P〈0.05)，0CN、BSP mRNA的表达在第14天时明显升高(P〈0.05)，细胞与单纯磷酸钙材料共培养时成骨相关基因的表达均维持在较低水平(图4)。
[0039]材料对细胞增殖的影响:骨髓基质细胞与材料共培养1、3天后，各组细胞增殖情况没有明显差异，共培养7、14天后冻干海藻糖磷酸钙BMP-2缓释材料组、冻干磷酸钙BMP-2缓释材料组、单纯磷酸钙材料组均明显高于单纯细胞组(P〈0.05),而三材料组之间无明显差异(Ρ>0.05)(图 5)。
[0040]存贮条件对BMP-2生物活性的影响:缓释材料在-20° C、4° C、25° C的环境温度下，经过2周和5周的存放后，其中冻干磷酸钙BMP-2缓释材料中BMP-2的生物活性都有明显的下降(P〈0.05)，而冻干海藻糖磷酸钙BMP-2缓释材料中BMP-2的活性得到了较好的保持(图6)。
[0041]大鼠颅骨临界大小骨缺损修复组织学观察:根据5周取材后非脱钙组织标本光镜观察新骨形成面积百分比情况，其中冻干磷酸钙BMP-2缓释材料+细胞组明显高于冻干磷酸钙BMP-2缓释材料+细胞组、磷酸钙材料+细胞组和单纯材料组(P〈0.05)，而冻干磷酸钙BMP-2缓释材料+细胞组高于磷酸钙材料+细胞组和单纯材料组(P〈0.05)，磷酸钙材料+细胞组则高于单纯材料组(P〈0.05)(图7)。
[0042]以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本【技术领域】的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保 护范围。
【权利要求】
1.一种冻干海藻糖磷酸钙BMP-2缓释材料，其特征在于，磷酸钙BMP-2缓释材料添加海藻糖。
2.权利要求1所述的冻干海藻糖磷酸钙BMP-2缓释材料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤:将骨诱导因子BMP-2与海藻糖溶液滴加到磷酸钙支架材料表面，先置于-80° C冰箱中，预冻3小时后放入冻干机中进一步冻干24小时即可。
3.根据权利要求2所述的冻干海藻糖磷酸钙BMP-2缓释材料的制备方法，其特征在于，所述骨诱导因子BMP-2的浓度是I mg/ml，所述海藻糖溶液的浓度是0.3 mol/1。
4.权利要求1所述的冻干海藻糖磷酸钙BMP-2缓释材料在骨组织再生中的应用。
5.海藻糖在促进磷酸钙BMP-2缓释材料的骨诱导性中的应用。
【文档编号】A61L27/28GK103768657SQ201210408022
【公开日】2014年5月7日 申请日期:2012年10月24日 优先权日:2012年10月24日
【发明者】赵君, 沈刚, 张志愿, 蒋欣泉, 王绍义, 张秀丽 申请人:上海交通大学医学院附属第九人民医院