一种海蛇提取物及其制备方法和用途
【专利摘要】本发明提供一种海蛇提取物及其制备方法和用途。所述制备方法包含下列步骤：取海蛇干燥体，加水煎煮，水煎液离心滤过；采用截留分子量为2000～8000的有机膜过滤，并将滤液浓缩至相对密度为1.05～1.20，放置，析出沉淀，过滤，取沉淀干燥，即得。本发明制备的海蛇提取物，具有良好的抗类风湿性关节炎作用，可用于制备预防和/或治疗类风湿性关节炎的药物。
【专利说明】一种海蛇提取物及其制备方法和用途
【技术领域】
[0001]本发明属于天然药物领域，具体涉及一种海蛇提取物及其制备方法和其在制备用于预防和/或治疗类风湿性关节炎的药物中的用途。
【背景技术】
[0002]海蛇(拉丁名Pelamis platurus)，爬行纲，眼镜蛇科，海蛇亚科，是生活在海洋里的爬行动物，有毒，身长1.5~2米。海蛇具有祛风止痛，滋补强壮的功效，常用于治疗风寒湿痹，关节疼痛，屈伸不利，皮肤瘙痒，体虚和小儿营养不良等。
[0003]海蛇在中医领域中的应用历史悠久，其功效已被临床实践充分证实。近年来，对海蛇在抗菌消炎、抗病毒、抗癌、治疗呼吸系统疾病以及免疫系统疾病等方面的研究表明，其在临床应用上前景广阔，开发利用潜力很大。但海蛇化学成分复杂，除了对蛇毒的研究比较多以外，其他成分的研究尚不系统深入，且海蛇的应用均是采用原料药材直接入药，或是采用简单水提法或醇提法后入药。目前，海蛇产品的开发形式主要有两种，一是以海蛇干体为主药配伍活血理气药制成复方制剂；二是以海蛇精制成各种保健酒。
【发明内容】
[0004]基于海蛇现有的应用情况，本发明的目的是提供一种海蛇有效部位的制备方法。采用本发明制备方法制得的海蛇提取物，具有良好的抗类风湿性关节炎作用，可用于制备预防和/或治疗类风湿性关节炎的药物。
[0005]本发明提供了一种海蛇提取物的制备方法，所述的制备方法包括下列步骤:
[0006]1)取海蛇干燥体，加水煎煮，水煎液离心滤过；
[0007]2)采用截留分子量为2000~8000的有机膜过滤步骤I)得到的滤液，并将滤液浓缩至在15°C~80°C下相对密度为1.05~1.20，放置，析出沉淀，过滤，取沉淀干燥，即得。
[0008]优选的情况，本发明所述的制备方法包括下列步骤:
[0009]1)取海蛇干燥体，加水煎煮3次，每次加水5~30倍量、煎煮10分钟~2小时，滤过，合并水煎液，离心滤过；
[0010]2)采用截留分子量为2000~8000的有机膜过滤步骤I)得到的滤液，并将滤液浓缩至在15°C~80°C下相对密度为1.05~1.20，放置24小时以上，析出沉淀，过滤，取沉淀
干燥，即得。
[0011]优选的情况，本发明所述的制备方法包括下列步骤:
[0012]1)取海蛇干燥体，加水煎煮2~3次，每次加水10倍量、煎煮I小时，滤过，合并水煎液，离心滤过；
[0013]2)采用截留分子量为2000~8000的有机膜过滤步骤I)得到的滤液，并将滤液浓缩至在15°C~80°C下相对密度为1.05~1.20，放置24小时以上，析出沉淀，过滤，取沉淀干燥，即得。优选的情况，本发明所述的制备方法包括下列步骤:
[0014]1)取海蛇干燥体，加水煎煮2次，每次加水I O倍量、煎煮I小时,滤过,合并水煎液，离心滤过；
[0015]2)采用截留分子量为3000的有机膜过滤步骤I)得到的滤液，并将滤液浓缩至在7(T80°C下相对密度为1.10，放置72小时，析出沉淀，过滤，取沉淀干燥，即得。
[0016]优选的情况，本发明所述的制备方法包括下列步骤:
[0017]I)取海蛇干燥体，加水煎煮，水煎液离心滤过；
[0018]2)采用截留分子量为2000~8000的有机膜过滤步骤I)得到的滤液，并将滤液浓缩至在80°C下相对密度为1.10，放置，析出沉淀，过滤，取沉淀干燥，即得。
[0019]优选的情况，本发明所述的制备方法包括下列步骤:
[0020]I)取海蛇干燥体，加水煎煮3次，每次加水5~30倍量、煎煮10分钟~2小时，滤过，合并水煎液，离心滤过；
[0021]2)采用截留分子量为2000~8000的有机膜过滤步骤I)得到的滤液，并将滤液浓缩至在80°C下相对密度为1.10，放置24小时以上，析出沉淀，过滤，取沉淀干燥，即得。
[0022]优选的情况，本发明所述的制备方法包括下列步骤:
[0023]I)取海蛇干燥体，加水煎煮2~3次，每次加水10倍量、煎煮I小时，滤过，合并水煎液，离心滤过；
[0024]2)采用截留分子量为2000~8000的有机膜过滤步骤I)得到的滤液，并将滤液浓缩至在80°C下相对密度为1.10，放置24小时以上，析出沉淀，过滤，取沉淀干燥，即得。
[0025]优选的情况，本发明所述的制备方法包括下列步骤:`[0026]I)取海蛇干燥体，加水煎煮2次，每次加水10倍量、煎煮I小时,滤过,合并水煎液，离心滤过；
[0027]2)采用截留分子量为3000的有机膜过滤步骤I)得到的滤液，并将滤液浓缩至在80°C下相对密度为1.10，放置72小时，析出沉淀，过滤，取沉淀干燥，即得。
[0028]本发明还提供所述制备方法制得的海蛇提取物。
[0029]本发明还提供一种用于预防和/或治疗类风湿性关节炎的药物组合物，该药物组合物包含所述海蛇提取物。
[0030]本发明还提供所述海蛇提取物在制备预防和/或治疗类风湿性关节炎的药物中的用途。
[0031]本发明制备的海蛇提取物，具有良好的抗类风湿性关节炎作用，可用于制备预防和/或治疗类风湿性关节炎的药物；实验证明，本发明所述制备方法得到的海蛇提取物，与单纯的水提法或醇提法得到的海蛇提取物相比，在改善SD大鼠CIA模型关节指数(Al)和关节病理学表现方面取得的效果更为明显。
【专利附图】
【附图说明】
[0032]以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中:
[0033]图1表示空白对照组SD大鼠踝关节。
[0034]图2表示CIA模型组SD大鼠踝关节。
[0035]图3表示海蛇治疗组SD大鼠踝关节。
【具体实施方式】[0036]以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。
[0037]下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的药材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。
[0038]实施例1
[0039]取海蛇干燥体(购买自广州清平药材市场，经鉴定为海蛇Pelamis platurus) I千克，加水煎煮提取3次，每次加水10倍量，每次煎煮I小时，合并水煎煮提取液，离心滤过，冷却至室温，滤液再采用截留分子量为2000的有机滤膜滤过，滤液浓缩至在15°C下相对密度为1.05，放置I小时，沉淀析出，过滤，取沉淀干燥，得海蛇提取物23克。
[0040]实施例2
[0041]取海蛇干燥体(购买自广州清平药材市场，经鉴定为海蛇Pelamis platurus) I千克，加水煎煮提取2次，每次加水10倍量，每次煎煮I小时，合并水煎煮提取液，离心滤过，冷却至常温，滤液再采用截留分子量为3000的有机滤膜滤过，滤液浓缩至在15°C下相对密度为1.20，放置48小时，沉淀析出，过滤，取沉淀干燥，得海蛇提取物52克。
[0042]实施例3
[0043]取海蛇干燥体(购买自广州清平药材市场，经鉴定为海蛇Pelamis platurus) I千克，加水煎煮提取2次，每次加水10倍量，每次煎煮I小时，合并水煎煮提取液，离心滤过，冷却至常温，滤液再采用截留分子量为3000的有机超滤膜滤过，滤液浓缩至在80°C下相对密度为1.10，放置72小时，沉淀析出，过滤，取沉淀干燥，得海蛇提取物61克。
[0044]实施例4
[0045]取海蛇干燥体(购买自广州清平药材市场，经鉴定为海蛇Pelamis platurus) I千克，加水煎煮提取3次，每次加水10倍量，每次煎煮I小时，合并水煎煮提取液，离心滤过，冷却至常温，滤液再采用截留分子量为8000的有机超滤膜滤过，滤液浓缩至在80°C下相对密度为1.20，放置48小时，沉淀析出，过滤，取沉淀干燥，得海蛇提取物56克。
[0046]实施例5
[0047]海蛇提取物的药效试验包含以下步骤:
[0048](1)将64只雄性SD大鼠随机分为8组:空白对照组、CIA (胶原诱导性关节炎)模型组、海蛇治疗I组(即实施例1提取物组)、海蛇治疗2组(即实施例2提取物组)、海蛇治疗3组(即实施例3提取物组)、海蛇治疗4组(即实施例4提取物组)、海蛇治疗5组(即单纯水提法组)、海蛇治疗6组(即醇提法组)，每组8只。
[0049](2)参照文献(Xiao C，Li J, Dong X 等人.Ant1-oxidative and TNF- αsuppressive activities of puerarin derivative(4AC)in RAW264.7cells andcollagen-1nduced arthritic rats.Eur J Pharmacol.2011 Jun 4 ；666 (3)242-250),于实验开始第I天，取适量浓度为2mg/ml的II型胶原蛋白(Collagen II)溶液，将该II型胶原蛋白溶液逐滴加入等容积的不完全弗氏佐剂中后，在冰浴中，用匀浆器将其充分混匀乳化，以滴加水中不扩散为度，配成II型胶原蛋白浓度为lmg/ml的乳剂。
[0050](3)对于CIA模型组和海蛇治疗组，取步骤(2)所得乳剂，分别按每只SD大鼠
0.2ml乳剂量于尾根部皮下免疫；对于空白对照组，按每只SD大鼠以0.2ml等容积蒸馏水于尾根部皮下注射。实验开始7天后，对于CIA模型组和海蛇治疗组，按每只SD大鼠0.1ml乳剂量于尾根部皮下再加强免疫一次；对于空白对照组，按每只SD大鼠以0.1ml等容积蒸馏水于尾根部皮下注射。
[0051 ] (4)实验开始第7天(即第二次免疫后)，对于海蛇治疗各组，按每只SD大鼠以1.84g/kg.d的生药剂量，lml/100g体重的体积灌胃给药；对于空白对照组和CIA模型组，分别按每只SD大鼠以lml/100g体重的体积给予生理盐水灌胃。
[0052](5) 28天期间内对6组SD大鼠进行关节炎指数(Arthritis Index, Al)检测,用来判断其大体发病率。SD大鼠全身病变按5级评分法评价，可以得出SD大鼠的4只肢体病变程度累计积分，然后计算出关节炎指数(Al)。5级评分法具体计分方法为:0分表示无红肿；1分表示小趾关节红肿；2分表示趾关节和足跖肿胀；3分表示踝关节以下的足爪肿胀；4分表示包括踝关节在内的全部足爪肿胀。累计以上所述各个关节的积分，即为每只SD大鼠的关节炎指数(Al)，每只SD大鼠最高得分为I 6分。
[0053](6)治疗结束后，将SD大鼠在乙醚麻醉下取全血；后处死SD大鼠，取其膝关节，用多聚甲醛固定36小时后，放入1096EDTA脱钙溶液，再用酒精逐级脱水，二甲苯透明处理，石蜡包埋、切片后进行常规HE染色(即苏木精-伊红染色)，后于光镜下观察滑膜、软骨、骨的病理改变。
[0054]结果显示:关节炎指数检测表明，各海蛇治疗组对C II所致SD大鼠CIA模型关节炎指数均有不同程度的降低，但以海蛇治疗3组(即本发明制备方法制得的海蛇提取物实施例3提取物)关节炎指数降低最明显(见表1)。病理学观察显示，与空白对照组(图1)相比，CIA模型组踝关节滑膜细胞增生，滑膜组织内可见有扩张的血管、新生毛细血管，并伴有淋巴细胞浸润；各跗骨关节的软骨基质及软骨细胞出现不同程度的退行性变，严重处软骨坏死剥脱、变性，剥脱的软骨表面，可见由滑膜细胞和毛细血管增生所形成的血管翳，软骨下骨也受到血管翳的侵袭，出现退行性变(见图2);各海蛇治疗组对C II所致SD大鼠CIA模型踝关节滑膜细胞增生、炎性细胞浸润、血管翳形成、软骨及骨质破坏等病理学改变均有不同程度的减轻，但以海蛇治疗3组(即本发明制备方法制得的海蛇提取物实施例3提取物)上述病理学改变最明显(见图3)。
`[0055]表1:大鼠 Al 的变化(i±s，0=8)[0056]
【权利要求】
1.一种海蛇提取物的制备方法，其特征在于，该制备方法包括下列步骤: 1)取海蛇干燥体,加水煎煮,水煎液离心滤过； 2)采用截留分子量为2000~8000的有机膜过滤步骤1)得到的滤液，并将滤液浓缩至在15°C~80°C下相对密度为1.05~1.20，放置，析出沉淀，过滤，取沉淀干燥，即得。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括下列步骤: 1)取海蛇干燥体,加水煎煮f3次，每次加水5~30倍量、煎煮I O分钟~2小时，滤过，合并水煎液，离心滤过； 2)采用截留分子量为2000~8000的有机膜过滤步骤I)得到的滤液，并将滤液浓缩至在15°C~80°C下相对密度为1.05~1.20，放置24小时以上，析出沉淀，过滤，取沉淀干燥，即得。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括下列步骤: 1)取海蛇干燥体,加水煎煮2~3次，每次加水10倍量、煎煮I小时，滤过，合并水煎液，离心滤过； 2)采用截留分子量为2000~8000的有机膜过滤步骤I)得到的滤液，并将滤液浓缩至在15°C~80°C下相对密度为1.05~1.20，放置24小时以上，析出沉淀，过滤，取沉淀干燥，即得。
4.根据权利要求1至3任一项所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括下列步骤: 1)取海蛇干燥体,加水煎煮2次，每次加水IO倍量、煎煮I小时，滤过，合并水煎液，离心滤过； 2)采用截留分子量为3000的有机膜过滤步骤I)得到的滤液，并将滤液浓缩至在7(T80°C下相对密度为1.10，放置72小时，析出沉淀，过滤，取沉淀干燥，即得。
5.根据权利要求1至4任一项所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2)中将滤液浓缩至在80°C下相对密度为1.10。
6.根据权利要求1至5任一项所述的制备方法制得的海蛇提取物。
7.一种用于预防和/或治疗类风湿性关节炎的药物组合物，其特征在于，该药物组合物包含根据权利要求6所述的海蛇提取物。
8.根据权利要求6所述的海蛇提取物在制备预防和/或治疗类风湿性关节炎的药物中的用途。
【文档编号】A61P29/00GK103800379SQ201210453697
【公开日】2014年5月21日 申请日期:2012年11月13日 优先权日:2012年11月13日
【发明者】肖诚, 徐世杰 申请人:肖诚