专利名称：一种靶向egfr受体的肽及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种靶向EGFR受体的多肽及其应用，尤其涉及其在修饰的纳米脂质载体中的应用，属药物制剂领域。
背景技术：
表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)广泛分布于人体各组织细胞膜上，是一种多功能跨膜糖蛋白，属受体型酪氨酸蛋白激酶(RTK)。与正常细胞相比，肿瘤细胞特别是EGFR阳性肿瘤细胞的生长明显依赖于EGFR信号转导，且有显著的降调节机制缺陷，其EGFR表达水平可比正常细胞高几千倍。EGFR的信号传导网络在肿瘤的形成和发展过程中占据了重要地位，是治疗肿瘤的一个很有前景的靶分子，是研究的热点。
然而越来越多的研究发现，以单克隆抗体或其片段作为配基介导肿瘤靶 向治疗， 因靶向配基具有免疫原性在临床应用具有一定局限性。目前，人源化、小型化的小分子多肽几乎不被免疫系统注意，且能有效穿透组织并具有被癌细胞选择性结合和内化的能力使其在提高肿瘤治疗靶向性方面具有较大优势。
据文献报道，EGFR含有3个可以调控EGFR活性的主要自磷酸化作用位点，分别为 Y1068, Y1148和Y1173。采用序列比较/结构分析的方法设计和筛选了来源于三个主要作用位点的氨基酸序列作为靶向EGFR小分子多肽配体。
纳米脂质载体(Nanostructrued lipid carries, NLC)是由固体脂质纳米粒 (Solid lipid nanoparticles, SLN)发展而来的一种新型载药系统。NLC采用生物相容性好、毒性低的类脂材料为载体，制备过程中通过向固态脂质中加入化学差异很大的液态油， 使纳米粒以结晶缺陷型或无定型结构存在，可避免放置过程中脂类由高能态的α、β型结晶向规则的β型转变，避免或减小SLN放置过程中药物外排的现象，提高药包封率及稳定性。
普通纳米粒如SLN或聚合物纳米粒进入体内后，被机体视为异物，易被单核巨噬细胞系统及网状内皮系统(RES)识别并吞噬，在静脉给药时只能作用于吞噬细胞比较丰富的器官，如肝脏、脾等。但若病灶部位不在网状内皮系统，该类制剂则会增加药物对网状内皮系统的毒性。长循环纳米脂质载体(long-circulating NLC)是以PEG对NLC表面进行修饰，PEG链与水分子的相互作用可在NLC表面形成一层固定水化层，由于血浆蛋白不能与亲水表面结合，因此，固定水化层的形成可以防止调理素及蛋白的吸附，避免RES吞噬，延长纳米粒在体内的循环时间，使其进入肿瘤等病变部位的机会增加，提高药物在病灶靶部位的疗效。
靶向EGFR的多肽作为靶向配基，并将其与包载抗肿瘤药物的长循环纳米脂质载体偶联，基于肽配体可与肿瘤细胞表面过度分泌的EGFR特异性结合的原理，将包载化疗药物的长循环纳米脂质载体靶向浓集于肿瘤组织，经部分生物降解后，NLC通过EPR效应进入肿瘤组织，对肿瘤进行特异性治疗，改善化疗药物的治疗效果，降低对正常组织的毒副作用。发明内容
1.本发明的目的是提供与EGFR具有亲和性的小分子肽，并提供该相关小肽的分子结构。
2.本发明的另一目的是提供上述小肽在构建肿瘤靶向给药系统中的用途。
3.本发明通过下述技术方案实施首先设计来自于EGFR主要自磷酸化作用位点的小肽 EY1ci68INQ ( SEQ ID NO:1), PDY1148QQD (SEQ ID NO:2)，AEY1173LR (SEQ ID N0:3),选择 LARLLT (Shuxian Song, et al. Novel peptide ligand directs liposomes toward EGFR high-expressing cancer cells in vitro and in vivo, FASEB J. 23(2009) 1396-1404.)作为对照，对上述各肽进行FITC标记。采用流式细胞术分析上述各肽与表达 NC1-H1299及K562不同细胞系的结合率。获得与EGFR高表达的NC1-H1299细胞具有较高的亲和活性的肽AEY1173LR,包含氨基酸序列Ala Glu Tyr Leu Arg (以下简称PE5)的肽。
4.经体内外亲和性及靶向性评价，结果证实，所述的小肽具有与EGFRG高表达的细胞特异亲和的特性；所述的小肽用于修饰载药纳米粒、脂质体、泡囊或胶束，构建成肿瘤靶向给药系统，该类系统能够提高药物在肿瘤组织的浓度，增强治疗效果，降低全身性的毒副作用。
5.本发明的小肽可用本领域熟知的多肽合成仪或固相方法进行合成。如采用有机化学固相合成Fmoc法合成小分子肽，由C端至N端合成，即将该小肽C端的第一个Fmoc-AA 的羧基活化后与HMP树脂结合，再脱去Fmoc-保护基，与第二个羧基活化的Fmoc-AA结合， 再脱去Fmoc-保护基，循环重复，直至合成得到肽树脂，然后用TFA将肽从肽树脂上切下，得到粗品小肽。
采用高效液相色谱法对小肽粗品进行纯化和纯度检测。洗脱系统为①A液: O. 1%TFA的水溶液。②B液B为 含O. 1%TFA的乙腈溶液。用95%A, 5%B 60%A, 40%B，手动进样，1 mL/次,流速4 mL/min,线性梯度,20 min内。275.5 nm处检测紫外吸收,按峰收集组分，冻干，进行纯度检测，贮藏在-20 ° C冰箱中备用。纯化后的肽以质谱法进行鉴定。
通过液相色谱纯化，纯度在98%以上，外观为白色粉末，并通过质谱进结构鉴定 本发明小肽的分子量是650. 74，质谱特征峰651. 27。
6.本发明的肽与纳米脂质载体(NLC)的结合为通过接头的共价结合。
接头为能够共价连接本发明的肽和纳米脂质载体的物质的交联剂。交联剂通常与本发明的肽和纳米脂质载体上存在的功能基团(例如-NH2，-C00H，-mal)反应。由于不同交联剂与不同功能基团反应的能力不同，可以选择不同的交联剂。
所述的本发明的肽偶联的纳米脂质载体的制备方法为首先采用具有 DSPE-PEG-C00H、DSPE-PEG-NH2、DSPE-PEG-mal的脂质制备纳米脂质载体，然后加入交联剂将PE5连接到纳米粒上。
具体步骤如下(1)将固态脂质材料、液态油、脂溶性乳化剂溶于有机溶剂中，该有机溶剂选自二氯甲烷、氯仿、丙酮、乙醇或异丙醇，并加热至60 100°C熔融，以构成有机相；(2)将PEG修饰的脂类、水溶性乳化剂、附加剂溶于注射用水中，并加热至60 100°C， 以构成水相；(3)在60 100°C的温度下，在搅拌或/和高剪切条件下将所述有机相和水相混合，以制备初乳；(4)对所述初乳进行超声或高压均质处理，并倾入冰水中，从而制得长循环纳米脂质载体。
(5)长循环纳米脂质载体混悬于适当缓冲液中(pH 4. O 6. O)中，分别加入 EDC和S · NHS的水溶液，室温下反应10 15m in。然后调pH至7. O 8. 5，加入PE5， 室温孵育过夜，除去游离PE5，即得PE5修饰的长循环纳米脂质载体。
可用于实施本发明的抗肿瘤药物包括但不限于羟基喜树碱、阿霉素。
7.本发明具有以下有益的技术效果(I)本发明得到的多肽，分子量小，合成方便，成本低廉，与EGFR亲和力高，特异性强。
(2)本发明得到的小肽，具有良好的EGFR靶向性，可用于构建靶向治疗EGFR高表达的肿瘤的载体。
图1为流式细胞术测定肽与肿瘤细胞表面结合图；图2为肿瘤细胞对FITC标记肽的内吞图；图3为非小细胞肺癌组织免疫荧光图； 图4为人非小细胞肺癌组织冰冻切片图；图5为AEYLR与NLC偶联的电镜图；图6为AEYLR与NLC偶联的粒径分布图；图7为NC1-H1299细胞对纳米粒的摄取及流式细胞术检测结果；A. FITC-AEYLR-PEG-NLC, B. FITC-RALEL-PEG-NLC, C. FITC- PEG-NLC0具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明，但不以任何形式限制本发明。
实施例1EGFR含有3个可以调控EGFR活性的主要自磷酸化作用位点，分别为Y1068，Y1148和 Y1173。采用序列比较/结构分析的方法设计来源于三个主要作用位点的氨基酸序列作为靶向 EGFR 小分子肽配体EY1ci68INQ , PDY1148QQD , AEY1173LR。
为筛选与EGFR结合的特异性强的活性小肽，我们合成了 FITC标记的 EYINQ、PDYQQD, AEYLR、RALEL (无关肽)、NYQQN (Mineo Abe, et al.1nhibition of Autophosphorylation of Epidermal Growth Factor Receptor by a Small Peptide Not Employing an ATP-Competitive Mechanism, Biopolymers 89 (2007) 40-51.)，并选择了 LARLLT作为对照，对LARLLT也进行了 FITC标记。釆用流式细胞术分析上述各肽与表达 EGFR(NC1-H1299)(图1A)及几乎不表达EGFR (K562)(图1B)的不同细胞系的结合率。
如图1C，结果表明，上述肽与肿瘤细胞的结合率随着浓度的增加而增加， FITC-AEYLR (箭头I所示曲线)与NC1-H1299细胞的结合率都高于FITC-EHNQ、 FITC-PDYQQD，FITC-NYQQN，FITC-RALEL (箭头之外的 4 条曲线)以及对照肽 FITC-LARLLT (箭头I所示曲线XFITC-LARLLT与NC1-H1299细胞的结合率都高于FITC-EHNQ、FITC-PDYQQD，FITC-NYQQN, FITC-RALEL。图1D现显示上述FITC标记的肽与K562细胞均无显著的结合。 说明FITC-AEYLR与高表达EGFR的细胞具有较高的结合活性。
实施例2为进一步考察各肽与肿瘤细胞的结合情况，我们进行了细胞内吞实验(FITCSE 的肽10 μ M与NC1-H1299及Κ562细胞37 °C孵育I小时)，如图2所示，FITC-AEYLR与 FITC-LARLLT均能有效介导细胞内吞，而K562细胞则无此作用。实验结果与实施例1 一致。
实施例3为进一步鉴别这种靶向配体是否对人肺癌活检标本有亲和力，我们用免疫组化测试了 AEYLR和RALEL与肺癌患者肺腺癌的反应性。制备人肺腺癌石蜡切片，封闭内源性过氧化酶活性，然后与生物素标记的AEYLR和RALEL —起保温，用HRP-str印tavidin以常规免疫组化染色来检测，以EGFR单克隆抗体做对照。
结果如图3所示，生物素标记的AEYLR能识别人肺腺癌活检标本中的肿瘤细胞， 所显示的颜色与EGFR单克隆抗体接近，而生物素标记的无关肽RALEL不能结合肺腺癌活检标本，无明显颜色变化。这些数据表明，AEYLR能识别肺腺癌患者癌细胞表面的EGFR。
实施例4制备人肺腺癌冰冻切片，封闭内源性过氧化酶活性，然后与FITC标记的AEYLR和RALEL 显色，用FITC标记的EGFR抗体做对照。
结果如图4所示，FITC-AEYLR能识别人肺腺癌活检标本中的肿瘤细胞,所显示的荧光比FITC标记的EGFR抗体稍弱，而无关肽FITC-RALEL不能结合肺腺癌患者癌细胞表面的EGFR，未见有明显荧光。
实施例5为进一步检测AEYLR作为靶向配基的安全性，进行了 MTT实验，将NC1-H1299细胞以 5000个/孔的密度接种与96孔板，以不同浓度的AEYLR接种于96孔板，培养96小时。结果显示AEYLR对细胞没有明显的促进增殖和抑制的作用，是一个比较安全的靶向配基。
实施例6为进一步检验AEYLR的靶向性，我们采用近红外染料Cy5. 5标记AEYLR和无关肽 RALEL,通过尾静脉向 NC1-H1299 移植荷瘤小鼠注射 PBS、Cy5. 5、AEYLR- Cy5. 5、RALEL-Cy5. 5，随后在不同时间点麻醉小鼠，并用Optix体内荧光成像系统(GE Healthcare)成像。 每组至少3只鼠。注射后不同时间点对小鼠体内Cy5. 5的荧光分布成像。
Cy5. 5染料注射的小鼠中，肿瘤区域的荧光信号与背景一致，但是在AEYLR-Cy5. 5注射的小鼠中，注射后I到6小时之间，与周围组织相比，肿瘤组织的荧光信号更强， 而无关肽RALEL- Cy5. 5注射的小鼠在肿瘤区域内未显示出任何荧光聚集。
实施例7将轻基喜树碱O. 5mg,单硬脂酸甘油酯40mg,大豆油IOmg,磷脂15mg, DSPE-PEG2000-C00H 6mg加入适量乙醇溶解，旋转蒸干除去有机溶剂，80°C熔融作为油相。 将PEG分子量为2000的硬脂酸酯18mg溶于4. 7ml注射用水中，加热至80°C作为水相。在 600r/min搅拌条件下缓慢将水相加至有机相中，制备初乳；滴加后继续搅拌lOmin，探头超声(20%功率，20s)，然后至冰浴中迅速搅拌冷却，制得长循环纳米脂质载体。
长循环纳米脂质载体混悬于Mes buffer ( pH 5.0)中，分别加入EDC和S *NHS的水溶液，室温下反应10 m in，超滤；加入pH7.4 PBS重悬，加入PE5，室温孵育过夜，透析除去游离PE5，即得PE5修饰的长循环纳米脂质载体。
实施例8按上述纳米粒的方法制备过程中加入DSPE-PEG-biotin，滴加avidin_FITC制备荧光标记的NLC。NC1-H1299细胞加入12孔板中过夜培养，加入上述FITC标记的纳米粒，37°C 孵育I小时，荧光显微镜观察形态，流式细胞技术测定纳米粒与细胞的结合率。
如图7所示，AEYLR连接的纳米粒可有效地使NLC进入细胞，无关肽RALEL连接的纳米粒与没有连接肽的纳米粒相比，没有显著性差异。
实施例9将PE5与对照肽RALEL溶解在PBS-EDTA中，N-琥珀酰亚胺-3- (2-吡啶二硫代)-丙酸酯(STOP)溶解于DMSO中，室温下与肽以1. 2:1的摩尔比混合I小时后冻干，得到硫化的肽。DSPE-PEG2000-Mal溶于氯仿中，蒸干形成薄膜，在Ifepes缓冲液(pH7. 4)中水化，浓度大约为0.4馳。将已经硫化的肽加到三(2-羧乙基)膦(TCEP)溶液中，室温下加氮气孵育I 小时，立刻与DSPE-PEG2000-Mal胶束以5:1的摩尔比混合，在氮气流下10°C保持搅拌反应过夜。通过HPLC分析，几乎所有的DSPE-PEG2000-Mal都被修饰。过量的肽可以使用标准的技术除去，凝胶过滤、透析等。
将阿霉素O. 5mg,单硬脂酸甘油酯40mg,大豆油IOmg,磷脂15mg, DSPE-PEG2000-PE5 6mg加入适量乙醇溶解，旋转蒸干除去有机溶剂，80°C熔融作为油相。将 PEG分子量为2000的硬脂酸酯18mg溶于4. 7ml注射用水中，加热至80°C作为水相。在 600r/mi n搅拌条件下缓慢将水相加至有机相中，制备初乳；滴加后继续搅拌lOmin，探头超声(20%功率，20s)，然后至冰浴中迅速搅拌冷却，制得PE5修饰的长循环纳米脂质载体。
权利要求
1.一种靶向EGFR受体的肽，其特征在于靶向EGFR受体的肽的序列如SEQ ID NO:1、 SEQ ID N0:2 或 SEQ ID N0:3 所示。
2.根据权利要求1所述的肽，其由SEQID NO:3组成。
3.—种靶向EGFR受体的肽修饰的纳米脂质载体，其特征在于，所述的修饰的纳米脂质载体包含下列的序列SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3。
4.根据权利要求4所述的靶向EGFR受体的肽修饰的纳米脂质载体，其特征在于，其包含位于所述纳米脂质载体与所述肽之间的交联剂。
5.根据权利要求4所述的靶向EGFR受体的肽修饰的纳米脂质载体，其特征在于，所述的纳米脂质载体包括固态脂质材料、液态油、脂溶性乳化剂、PEG修饰的脂类、水溶性乳化剂、附加剂。
6.根据权利要求5所述的靶向EGFR受体的肽修饰的纳米脂质载体，其特征在于，所述的 PEG 修饰的脂类选自 DSPE-PEG-C00H，DSPE-PEG-NH2, DSPE-PEG-mal。
7.根据权利要求5所述的靶向EGFR受体的肽修饰的纳米脂质载体，其特征在于所述固态脂质材料为硬脂酸、单硬脂酸甘油酯、三硬脂酸甘油酯、二月桂酸甘油酯、三月桂酸甘油酯、三肉豆蘧酸甘油酯、蜂蜡、十六醇、十六醇酯、山嵛酸甘油酯、卵磷脂、PEG-40硬脂酸酯、PEG-100硬脂酸酯中的任意一种或任意两种的混合物。
8.根据权利要求5所述的靶向EGFR受体的肽修饰的纳米脂质载体，其特征在于所述液态油为大豆油、油酸、花生油、三油酸甘油酯、Miglyol 812、维生素E、维生素A中的一种或任意两种的混合物。
9.根据权利要求5所述的靶向EGFR受体的肽修饰的纳米脂质载体，其特征在于所述脂溶性乳化剂选自磷脂类、脂肪酸山梨坦类、聚山梨酯类、聚氧乙烯、聚氧丙烯共聚物类、聚氧乙烯脂肪酸脂类、聚氧乙烯脂肪醇醚类或其任意组合。
10.根据权利要求5所述的靶向EGFR受体的肽修饰的纳米脂质载体，其特征在于还包含一种选自下列的药物羟基喜树碱或阿霉素。
全文摘要
本发明属于医药技术领域，涉及一种靶向EGFR受体的多肽及其应用，本发明的设计来自于EGFR主要自磷酸化作用位点的小肽EY1068INQ(SEQ ID NO:1)，PDY1148QQD(SEQ ID NO:2)，AEY1173LR(SEQ ID NO:3)，所述的肽用于修饰纳米脂质载体，所述的纳米脂质载体包括固态脂质材料、液态油、脂溶性乳化剂、PEG修饰的脂类、水溶性乳化剂、附加剂。本发明具有如下特点(1)得到的多肽，分子量小，合成方便，成本低廉，与EGFR亲和力高，特异性强。(2)本发明得到的小肽，具有良好的EGFR靶向性，可用于构建靶向治疗EGFR高表达的肿瘤的载体。
文档编号A61K47/42GK102993272SQ201210491720
公开日2013年3月27日 申请日期2012年11月28日 优先权日2012年11月28日
发明者潘卫三, 韩翠艳, 杨星钢, 太玲钰, 孙明爽, 李静 申请人:沈阳药科大学