专利名称：羧甲基化阴沟肠杆菌多糖及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于胞外多糖改性技术领域，具体涉及一种羧甲基化阴沟肠杆菌及其制备方法和它的应用。
背景技术：
多糖(Polysaccharide)又称多聚糖,是一类由醒糖或酮糖通过糖苷键连接而成的天然高分子多聚物，广泛存在于动物、植物和微生物组织中，是天然界含量最丰富的生物多聚物(徐述明，2006)。活性多糖具有促进动物生长、提高畜禽免疫力和抗病毒、抗氧化等功·效，同时具有毒副作用小、无残留、不易产生耐药性等优点。因此，在畜牧业生产中，将生物活性多糖开发为绿色环保的饲料添加剂以替代抗生素的使用，对确保畜产品的安全和畜牧业的可持续发展都具有重要的意义。多糖的分子修饰是通过物理、化学及生物学等手段对其分子进行结构改造，以获得其它结构类型衍生物的方法。分子修饰可以通过改变多糖的空间结构、分子量及取代基种类、位置和数目等增强天然多糖的生物学活性或使多糖产生新的活性，有利于多糖类生物制剂在动物生产中的的开发与应用。常见的多糖分子修饰的方法有物理修饰法(如超声波降解、Y射线降解等)、化学修饰法(如硫酸酯化、羧甲基化、磷酸化、乙酰化等)及生物修饰法(如基因工程修饰、酶法降解等)(王兆梅，李琳，郭祀远，胡松青.多糖结构修饰研究进展.中国医药工业杂志，2012，33(12) :616-620)。多糖的分子修饰可能极大程度提高多糖的生物学功能，因此多糖的分子修饰已成为多糖构效关系研究的重要手段，也是发现和研制多糖类生物制剂的重要途径。羧甲基化多糖是指多糖大分子链中单糖分子上的某一个或几个羟基被羧甲基基团取代而形成的一类化学结构复杂、生物活性多样、构效鲜明的阴离子多糖衍生物。有研究表明，许多原本不具有或仅有微弱抗病毒、抗肿瘤或抗氧化活性的多糖经过羧甲基化修饰后其抗病毒、抗肿瘤或抗氧化活性得到了显著提高。因此，多糖的羧甲基化修饰已经成为多糖分子修饰的一个重要方向，已成为人们关注的焦点。2011年，仰榴青，赵婷等申请的专利“一种羧甲基化黑木耳多糖、粗多糖及其制备方法和应用”(申请号201110219047. 3)，将水提醇沉所得黑木耳多糖与氯乙酸在碱溶液中反应得到羧甲基黑木耳多糖，并证明该多糖与未羧甲基化黑木耳多糖相比，对DPPH自由基、羟基自由基、ABTS+自由基的清除能力和溶解性得到显著的提高。2010年，吴广枫，李平兰等申请的专利“一种羧甲基化双歧杆菌胞外多糖及其制备方法”(申请号201010248295. 6)，利用双歧杆菌胞外多糖制备得到羧甲基化双歧杆菌胞外多糖，并证明该多糖能显著提高小鼠脾细胞中IL-2、IFNy细胞因子水平，免疫调节力得到明显提高。但是有关阴沟肠杆菌胞外多糖羧甲基化衍生物的制备和抗氧化活性研究至今未见国内外报道，也未见相应专利公开
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种羧甲基化阴沟肠杆菌胞外多糖及其制备方法和用途。为了解决上述技术问题，本发明提供一种羧甲基化阴沟肠杆菌胞外多糖的制备方法，包括如下步骤I)、将500mg阴沟肠杆菌胞外多糖溶于2(T30mL异丙醇中，搅拌20 40分钟后滴加质量浓度为18 22% (最佳为20%)的NaOH水溶液，继续搅拌O. 8 1. 2h (最佳Ih)后，加入1. 8 2. 2g (最佳为2g)氯乙酸，然后于50°C 70°C恒温水浴中反应2 4h ；NaOH与氯乙酸(MCA)的摩尔比为2 3:1 ;滴加时间一般为2 10分钟； 2)、将步骤I)所得的反应体系降温至室温，先用质量浓度为4 6%的稀盐酸调pH至 6. 9^7. 1，然后加入为步骤I)所得的反应体系2. 5^3. 5体积倍的无水乙醇，离心收集沉淀，将沉淀溶于蒸馏水中然后装入透析袋内，透析袋先放入自来水中透析22 26h (较佳24 h)，再放入蒸馏水中透析46飞Oh (较佳为48 h);透析袋中的透析产物经冷冻干燥，得到羧甲基化多糖(即，羧甲基化阴沟肠杆菌胞外多糖)。作为本发明的羧甲基化阴沟肠杆菌胞外多糖的制备方法的改进阴沟肠杆菌胞外多糖是通过发酵阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae Z0206) CGMCC NO. 2279而得。作为本发明的羧甲基化阴沟肠杆菌胞外多糖的制备方法的进一步改进透析袋的截留分子量为800-12000Da。作为本发明的羧甲基化阴沟肠杆菌胞外多糖的制备方法的进一步改进步骤I)中NaOH与氯乙酸(MCA)的摩尔比为2:1，反应时间为4h，反应温度为60。。。本发明还同时提供了利用上述任一方法制备所得的羧甲基化阴沟肠杆菌胞外多糖该羧甲基化阴沟肠杆菌胞外多糖取代度为O. 68-0. 86，得率为95. 42%_117. 7%，该多糖的红外光谱中在1602 CnT1和1426 cnT1处出现了 COO-的对称和非对称伸缩振动特征吸收峰。本发明还同时提供了利用上述任一方法制备所得的羧甲基化阴沟肠杆菌胞外多糖的用途作为抗氧化剂。在本发明的步骤I)中，2处搅拌的速度均为速度为600 1200rpm(较佳为600 1000 rpm)。在本发明中，室温一般是指10 25°C。本发明所用的原料阴沟肠杆菌胞外多糖是按照申请号为200810121312. 5的《一种阴沟肠杆菌及其多糖和多糖的应用》制备而得的阴沟肠杆菌Z0206多糖，该阴沟肠杆菌Z0206 多糖是通过发酵一种阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae Z0206)CGMCC NO. 2279 而得到的。阴沟肠杆(Enterobacter cloacae Z0206)于2007年12月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号为CGMCC NO. 2279。该菌株已在申请号为200810121312. 5的专利中公开。羧甲基化阴沟肠杆菌胞外多糖中的羧甲基取代度的测定方法参见以下两个文献I)、李小飞，吴玉英，羧甲基壳聚糖的制备，精细与专用化学品，2006，14卷，24期，26-29 ；2)、朱昌玲，史劲松，孙达峰，张和，威善龙，羧甲基壳聚糖的制备及其在保险中的应用，中国野生植物资源，2010，29卷，3期，41-45。采用本发明方法制备而得的羧甲基化阴沟肠杆菌胞外多糖化学性质稳定，体外实验表明该胞外多糖具有较强的清除羟基自由基和超氧阴离子自由基的能力，且清除能力明显高于未改性的阴沟肠杆菌胞外多糖，显示出良好的抗氧化活性。本发明方法制备而得的羧甲基化阴沟肠杆菌胞外多糖的用法和用量可参照未改性的阴沟肠杆菌胞外多糖。
下面结合附图对本发明的具体实施方式
作进一步详细说明。 图1为阴沟肠杆菌胞外多糖对羟基自由基的清除作用图；图2是实施例3所得的羧甲基化阴沟肠杆菌胞外多糖对羟基自由基的清除作用图；图3是实施例8所得的羧甲基化阴沟肠杆菌胞外多糖对羟基自由基的清除作用图。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不限制本发明。实施例1、一种羧甲基化阴沟肠杆菌胞外多糖的制备方法，依次进行以下步骤I)、将500mg阴沟肠杆菌胞外多糖溶于25mL异丙醇中，室温下搅拌(转速为600 IOOOrpm) 30min ;然后滴加8mL质量浓度为20%的NaOH水溶液(B卩为O. 04mol的NaOH),约5分钟滴加完毕，室温下继续搅拌(转速为600 IOOOrpm) Ih后，加入2g氯乙酸(即为O. 02mol的氯乙酸)，然后于50°C恒温水浴中反应2h ；2)、将步骤I)所得的反应体系降温至室温，先用质量浓度为5%的稀盐酸调pH至7，然后加入为步骤I)所得的反应体系3体积倍的无水乙醇，离心收集沉淀，将沉淀溶于15ml蒸馏水中然后装入透析袋中，透析袋先放入自来水中透析24 h，再放入蒸馏水中透析48 h ;透析袋中的透析产物经冷冻干燥(于_80°C干燥至恒重)，得O. 4878g到羧甲基化多糖一一羧甲基化阴沟肠杆菌胞外多糖。得率为97. 56%。备注说明透析袋的截留分子量为8000_14000Da。(3)羧甲基度的测定采用酸碱滴定法(Muzzarelli et al. , 1982)测定羧甲基化多糖的取代度。精确称取30mg羧甲基化多糖于三颈瓶中，精确移取15mL O.1mol / L盐酸标准溶液(含
O.1mol / L氯化钠)于其中，振摇，使完全溶解，用O.1mol / L氢氧化钠标准溶液(含
O.1mol / L氯化钠)滴定，同时用pH计测量pH值。羧甲基取代度的计算公式如下DS=O. 161A / (1-0. 058A) A= (V2-V1) M / W式中A为每克样品中羧甲基的物质的量，mmol ；0. 161为每个乙酰氨基葡萄糖残基的物质的量，mmol ；0. 058为每毫克当量的羧甲基质量；Vi为pH值为2.1时滴定所消耗的氢氧化钠标准溶液的体积；v2为pH值为4. 3时滴定所消耗的氢氧化钠标准溶液的体积；W为样品净重;M为氢氧化钠标准溶液浓度。所得结果如表2所示。实施例实施例9、以氢氧化钠与氯乙酸的比例、反应时间、反应温度为考察因素，每个因素拟定3个水平，以得率和羧甲基取代度(DS)为考察指标，选用L9 (33)正交表(见表I)进行试验，试验水平及编码见表I。S卩，相对于实施例1而言，改变步骤I)中氢氧化钠与氯乙酸的摩尔比(氯乙酸的用量保持不变O. 02mol的氯乙酸)，还改变反应温度和反应时间；其余同实施例1，从而获得相应的实施例2 实施例9。
将实施例2 实施例9所得的羧甲基化多糖按照实施例1所述方法进行羧甲基度的测定，所得结果如表2所示。表1、羧甲基化正交试验水平及其编码
水平
因素---123
氢氧化钠氯乙酸(A)2 I2.5 I3 I
反应温度(B)50 C60°C70 C
反应时间(C)2 h3 h4 h表2、不同反应条件对羧甲基化阴沟肠杆菌胞外多糖得率及取代度的影响
权利要求
1.羧甲基化阴沟肠杆菌胞外多糖的制备方法，其特征是包括如下步骤1)、将500mg阴沟肠杆菌胞外多糖溶于2(T30mL异丙醇中，搅拌2(Γ40分钟后滴加质量浓度为18 22%的NaOH水溶液，继续搅拌O. 8 1. 2h后，加入1. 8 2. 2g氯乙酸，然后于500C 70°C恒温水浴中反应2 4h ；所述NaOH与氯乙酸的摩尔比为2 3:1 ;2)、将步骤I)所得的反应体系降温至室温，先用质量浓度为4飞％的稀盐酸调pH至6.9^7. 1，然后加入为步骤I)所得的反应体系2. 5^3. 5体积倍的无水乙醇，离心收集沉淀，将沉淀溶于蒸馏水中然后装入透析袋内，透析袋先放入自来水中透析22 26h，再放入蒸馏水中透析46飞Oh ;透析袋中的透析产物经冷冻干燥，得到羧甲基化多糖。
2.根据权利要求1所述的羧甲基化阴沟肠杆菌胞外多糖的制备方法，其特征是所述阴沟肠杆菌胞外多糖是通过发酵阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae Z0206) CGMCCNO. 2279 而得。
3.根据权利要求2所述的羧甲基化阴沟肠杆菌胞外多糖的制备方法，其特征是所述透析袋的截留分子量为8000-14000Da。
4.根据权利要求3所述的羧甲基化阴沟肠杆菌胞外多糖的制备方法，其特征是所述步骤I)中=NaOH与氯乙酸的摩尔比为2:1，反应时间为4h，反应温度为60°C。
5.利用权利要求Γ4任一方法制备所得的羧甲基化阴沟肠杆菌胞外多糖，其特征是该羧甲基化阴沟肠杆菌胞外多糖取代度为O. 68-0. 86，该多糖的红外光谱中在1602 cnT1和1426 cm 1处出现了 COO-的对称和非对称伸缩振动特征吸收峰。
6.利用权利要求Γ4任一方法制备所得的羧甲基化阴沟肠杆菌胞外多糖的用途作为抗氧化剂。
全文摘要
本发明公开了一种羧甲基化阴沟肠杆菌胞外多糖的制备方法，包括如下步骤1)将阴沟肠杆菌胞外多糖溶于异丙醇中，滴加NaOH水溶液，继续搅拌0.8～1.2h后，加入1.8～2.2g氯乙酸，然后于50℃～70℃恒温水浴中反应2～4h；2)将步骤1)所得的反应体系经调节pH、沉淀、透析、冷冻干燥；得到羧甲基化多糖。该羧甲基化阴沟肠杆菌胞外多糖取代度为0.68-0.86，该多糖的红外光谱中在1602cm-1和1426cm-1处出现了COO-的对称和非对称伸缩振动特征吸收峰。其能作为抗氧化剂。
文档编号A61P39/06GK103012610SQ20121052268
公开日2013年4月3日 申请日期2012年12月4日 优先权日2012年12月4日
发明者汪以真, 黄明, 王友明, 路则庆, 靳明亮 申请人:浙江大学