药物组合物及其局部用途
【专利摘要】本发明涉及含有来源于脂肪组织的分泌物的组合物的制备方法，例如来源于牛脂肪组织的那些分泌物，以及该组合物在制备用于局部使用的药物组合物中的用途。本发明还涉及脂肪组织来源的分泌物及其药物组合物在用于通过局部敷用来局部治疗非炎症病况，例如治疗皮肤病况，和刺激个体中毛发的生长中的用途。本发明还涉及脂肪组织来源的分泌物及其药物组合物在痤疮的局部治疗中的用途。
【专利说明】药物组合物及其局部用途
【技术领域】
[0001]本发明涉及含有来源于脂肪组织的分泌物的组合物的制备方法，例如来源于牛脂肪组织的那些分泌物，以及该组合物在制备用于局部使用的药物组合物中的用途。本发明还涉及脂肪组织来源的分泌物及其药物组合物在用于通过局部敷用来局部治疗非炎症病况，例如治疗皮肤病况，和刺激个体中毛发的生长中的用途。本发明还涉及脂肪组织来源的分泌物及其药物组合物在痤疮的局部治疗中的用途。
[0002]发明背景
[0003]脂肪组织含有大体积的，充满脂质的脂肪细胞的细胞群和非脂肪细胞的细胞群，其包括与各种结缔组织纤维相关的细胞以及与毛细血管和大血管相关的细胞。非脂肪细胞群还包括各种浸润的免疫细胞以及与神经系统相关的细胞和细胞过程(cell processes) 0非脂肪细胞群也被认为含有脂肪细胞来源的成体干细胞的细胞群，并因此使用脂肪组织作为分离成体干细胞的来源在多种治疗应用中备受关注。
[0004]在通常情况下，用于获得推测的脂肪组织来源的成体干细胞方法涉及从脂肪来源的非脂肪细胞中清除脂肪细胞，这需要用如胶原酶的酶消化脂肪组织，然后通过离心被消化的样品分离游离的细胞。在离心过程中，脂肪来源的非脂肪细胞与脂肪细胞分离，形成沉淀，而含有脂质的脂肪细胞上浮。然后含非脂肪细胞的馏分作为组织干细胞的来源被使用。
[0005]本发明人之前已经描述了包含脂肪细胞的脂肪组织来源的细胞悬浮液在制备用于治疗个体的炎症或减轻与炎症 疾病相关的疼痛，以及用于治疗和缓解如软骨或骨病症的病况的疼痛的药物中的用途。这在澳大利亚专利申请第2009201915号，并在国际公开第W02010/020005号已有描述，其内容在此作为交叉引用并入本文。仍然存在对于治疗非炎症病况的改进方法和其中使用的组合物的需求。
[0006]痤疮是常见的皮肤病，包括寻常痤疮、囊肿性痤疮。常见的受痤疮影响的皮肤部位包括面部，胸部的上半部分，以及背部。痤疮最常发生于青春期，通常持续到成年期。多种治疗可用于痤疮，但是具有造成痤疮疤痕的可以性以及对多数为青少年的患者具有潜在心理影响，因此替代的或改进的治疗方法是值得期待的。
[0007]发明简述
[0008]本发明人已令人惊奇地鉴定了来自脂肪组织来源的细胞的分泌物，包括来自脂肪细胞的分泌物，对于改善各种非炎症性病况，用于刺激毛发、软毛和毛皮的生长，以及用于治疗或预防痤疮是有效的。用于制备分泌物的脂肪组织来源的细胞可以或不会包括脂肪细胞。
[0009]在本发明的第一方面，提供了含有脂肪组织来源的分泌物的组合物在制备用于局部治疗个体中非炎症性病症的药物中的用途。
[0010]在第二个方面，提供了一种治疗个体中非炎症性病症的方法，该方法包括向个体局部给予药物组合物，该组合物包括脂肪组织来源的分泌物，以及药学上可接受的载体或稀释剂。
[0011]在一个实施例中，非炎症性病症涉及所述个体中一种或多种以下病况:(i)皮肤干燥，(ii)皮肤瘙痒，(iii)昆虫盯咬，(iv)晒伤，(v)皮肤皱纹，(vi)皮肤过薄，(vii)皮肤开裂，(viii)昆虫蜇伤，(ix)症痕，(X)萎缩纹，(xi)晒斑，(xii)老年斑，(xiii)黄褐斑，(XiV)眼睛周围的浮肿和/或黑眼圈，(XV)足癣，(xvi)疣，并且所述治疗缓解一种或多种所述病况。
[0012]在第三方面，提供了脂肪组织来源的分泌物在制备用于局部使用以刺激个体中毛发，毛皮或软毛生长的药物中的用途。
[0013]在第四方面，提供了刺激个体中毛发，软毛或毛皮生长的方法，该方法包括向个体局部给予药物组合物，该组合物包括脂肪组织来源的分泌物，以及药学上可接受的载体或稀释剂。
[0014]在实施方案中，个体具有一种或多种:(i)手术引起的脱发，(ii)与化疗相关的脱发，(iii)辐射暴露相关的脱发，(iv)脱发症，(V)男性型秃顶，(Vi)女性型秃顶。
[0015]在第五方面，提供包含脂肪组织来源分泌物的组合物在制备用于局部治疗或预防个体中痤疮的药物中的用途。在实施方案中，该药物用于治疗或预防青少年痤疮。
[0016]在第六个方面，提供了在个体中治疗或预防痤疮的方法，该方法包括向个体局部给予药物组合物，该组合物包括脂肪组织来源的分泌物，以及药学上可接受的载体或稀释剂。
[0017]在实施方案中个体是青少年。在实施方案中，个体具有临床相关性痤疮。在实施方案中痤疮为囊肿性痤疮。在实施方案中，个体患有重度痤疮。在实施方案中，具有临床相关性痤疮的个体是青少年。
[0018]本文所描述的本发明的实施方案适用于本发明的各个方面，以及有关方面。
[0019]在实施方案中，用于局部给药的药物或药物组合物为乳膏、洗剂、液体或软膏。在实施方案中，药物或药物组合物是人用药物或药物组合物。在实施方案中，药物或药物组合物为兽药或药物组合物。
[0020]在实施方案中，包括脂肪组织来源的分泌物的组合物是来源于牛的。在实施方案中，包括脂肪组织来源的分泌物的组合物是来源于猪的。
[0021]在实施方案中，包括脂肪组织来源的分泌物组合物还包括脂肪细胞。在实施方案中，包括脂肪组织来源的分泌物的组合物基本上不含脂肪细胞。
[0022]在实施方案中，包括脂肪组织来源的分泌物的组合物是从含有脂肪细胞的细胞悬浮液制备的。在实施方案中，包括脂肪组织来源的分泌物的该组合物是从基本不含脂肪细胞的细胞悬浮液制备的。
[0023]在实施方案中，个体是人类。在实施方案中，个体为青春期的人类。在实施方案中， 个体为非人类哺乳动物。在实施方案中，非人类哺乳动物是犬科动物。在实施方案中，非人类哺乳动物是猫科动物。在实施方案中，非人类哺乳动物为马。在实施方案中，非人类哺乳动物是羊。
[0024]在实施方案中，脂肪组织来源的分泌物是个体自体的。在实施方案中，脂肪组织来源的分泌物是与个体同种异体的。在实施方案中，脂肪组织来源的分泌物是与个体异种的。 在实施方案中，脂肪组织来源的分泌物是来源于牛的。在实施方案中，脂肪组织来源的分泌物是来源于猪的。
[0025]在实施方案中，脂肪组织来源的分泌物或包含所述分泌物的细胞培养物是浓缩的，例如通过冷冻干燥和在合适的液体和体积下再水化。在实施方案中，再水化后的体积比冻结干燥前的原体积小约5至20倍。
[0026]在实施方案中，脂肪细胞被添加到脂肪组织来源的分泌物中。
[0027]在第七方面，提供了制备牛脂肪组织来源的分泌物的方法，该方法包括:
[0028](i)将牛脂肪组织暴露于蛋白水解酶溶液，以产生细胞悬浮液；
[0029](ii)离心细胞悬浮液，以形成细胞沉淀、位于含有脂肪细胞的漂浮细胞层上方的游离脂质层、以及位于细胞沉淀与漂浮细胞层之间的中间层，与所述细胞沉淀和所述漂浮细胞层相比，所述中间层的细胞较少；并且
[0030](iii)除去游离脂质层和中间层，
[0031](iv)选择地去除部分或基本所有的含有脂肪细胞的漂浮细胞层，
[0032](V)混悬细胞沉淀与，如果存在的话，包含脂肪细胞的漂浮细胞层，以形成脂肪组织来源的细胞悬浮液，其可以或可以不含有脂肪细胞；
[0033](vi)在合适条件下培养细胞悬浮液；
[0034](vii)收集细胞培养物的上清液以形成含有牛脂肪组织来源分泌物的组合物。
[0035]在实施方案中，蛋白水解酶溶液含有终浓度为约0.25%w/v的胶原蛋白酶。在实施方案中，牛脂肪组织的消化是不完全的。
[0036]在实施方案中，含有脂肪细胞的漂浮细胞层被保留。在实施方案中，含有脂肪细胞的漂浮细胞层被部分地去除。在实施方案中，含有脂肪细胞的漂浮细胞层被去除。
[0037]在实施方案中，在合适条件下培养细胞悬浮液的步骤包含培养以形成贴壁培养物。在实施方案中，贴壁细胞培养物为融合细胞培养物。在实施方案中，在合适条件下培养细胞悬浮液包含旋转培养器中培养细胞。在实施方案中，收集的上清液也包含了脂肪细胞。 在实施方案中，收集的上清液基本不含脂肪细胞。在实施方案中，方法还包含从所述上清中去除细胞的步骤。
[0038]在实施方案中，方法还包含冷冻干燥细胞培养物。在实施方案中，方法还包含冷冻干燥牛脂肪组织来源的分泌物。在实施方案中，冷冻干燥的材料在合适体积的合适的液体中被再水化。在实施方案中，再水化后的体积比冻结干燥前的原体积小约5至约20倍。
[0039]在第八方面，提供了含有牛脂肪组织来源的分泌物的组合物在制备用于局部使用以Q)治疗个体中非炎症状态，或者(ii)刺激个体中毛发、软毛或毛皮生长，或者(iii)治疗或预防个体中痤疮的药物中的用途。
[0040]在实施方案中，含有牛脂肪组织来源的分泌物的组合物根据第七方面描述的方法制备。
[0041]在第九方面，提供了含有牛脂肪组织来源的分泌物以及药学上可以接受的载体或者溶剂的药物组合物。
[0042]在实施方案中，药物组合物或者药物针对局部给药来配制，例如以洗剂，乳膏，液体或者软膏的形式。在实施方案中，药物组合物或者药物适用于人类个体。在实施方案中， 药物组合物或者药物适用于非人类个体。
[0043]在实施方案中，含有牛脂肪组织来源的分泌物的药物组合物还包含了脂肪细胞。 在实施方案中，含有牛脂肪组织来源的分泌物的药物组合物基本不包含脂肪细胞。
[0044]上述发明简述并非限制性，并且本发明的其他特征和优点将在下文的优选的实施方案的详细描述和权利要求中列出。
[0045]附图简述
[0046]本发明优选的形式现将参照附图详细说明:
[0047]图1:单个犬中的剃除区域的毛发重生长，在剃除后7天，12天，22天照相记录。左图(“处理组”)显示牛脂肪组织来源分泌物局部给药一天两次的剃除区域的毛发重生长以及右图(“对照组”)显示未受任何处理的剃除区域的毛发重生长。
[0048]图2:七个人个体进行含有牛脂肪组织来源分泌物的组合物局部给药以治疗痤疮的试验结果。(A)显示单独的试验个体结果以及(B)显示7个个体平均每天的结果。
[0049]缩写
[0050]为了方便，以下列出本说明书中使用的缩写。
[0051]DMEM Dulbecco 氏改良 Eagle 培养基
[0052]RPMI皇家公园纪念研究所培养基
[0053]SVC基底血管细胞
[0054]定义
[0055]在本发明的上下文中提及的包含“脂肪组织来源的分泌物”将被理解为指包括一种或多种从脂肪组织的细胞释放的因子的组合物。制备含有分泌物的组合物所使用的材料可以包含脂肪细胞或者基本不包含脂肪细胞。
[0056]本文使用的术语“药学上可接受的载体或佐剂”包含的不仅仅是适用于对人进行局部给药的载体或溶剂，也包括适用于对非人类的个体进行局部给药的载体或溶剂。在特定实施方案中，载体或溶剂适用于对非人类哺乳动物个体进行给药。在特定实施方案中载体或溶剂适用于对人类个体进行给药。
[0057]本发明说明书上下文中的术语“治疗(treating) ”、“治疗(treatment) ”、“疗法 (therapy) ”等是指非炎症疾病或皮肤病况或痤疮的症状和/或形成原因的缓解。简短地说，这些可在此被多样地总结为“病况”或“病症”。在某些实施方案中，治疗会减缓，推迟或阻止疾病或者疾病症状进程，或者逆转疾病进程，至少是暂时性的。因此，在本发明上下文中术语“治疗(treatment) ”或其衍生词例如“治疗(treating) ”当与治疗性应用相关时包括疗法的所有方面时，例如缓解与待治疗疾病相关的疼痛，缓解待治疗疾病的严重性，改善待治疗疾病的一种或多种症状，改善接受治疗的个体的总体健康状况等，例如治疗痤疮中改善了皮肤的外观。术语“治疗”或其衍生词的使用被理解成意为“被治疗的”个体会获得一种或更多上述的益处。
[0058]本说明的全文中，提及的“一种(a)”或“一个(one)”元件不排除复数，除非上下文另有说明。
[0059]本文使用的术语“治疗有效量”包括限于其含义的用于本发明以提供所需的治疗效果的无毒但是足够剂量的化合物或组合物。确切所需的量将因个体之间而异，取决于一些因素例如被治疗的物种，个体的年龄和一般情况，合并症，待治疗病况的严重程度，给予的具体试剂以及给药模式等。因此，在任一给定的案例中，合适的“有效剂量”可以由本领域技术人员仅使用常规方法来确定。
[0060]在本说明书的上下文中，术语“包含”意为包括，但并非仅限必要地包括。另外，术语“包含”的变体，例如“comprise”和“comprises”，具有相对应的变化的含义。因此，术语“包含”及其变体在包容的而不是排他的意义上使用，使得组合物、方法等中任选地出现其他整数或者特征等，被描述为包含整数A，或包含整数A和B，等等。
[0061]在本说明书的上下文中，术语“约”将被理解为表示一个熟练的接收者 (addressee)给定值相关联的通常可接受的范围。
[0062]在本说明书中的上下文中，一个给定了范围的参数可被理解为，该参数包括了规定的范围之内所有的值，包括所述范围的端点。例如，范围“ 5至10 ”将被理解为值5，6，7， 8，9和10，以及给定范围内的任何子范围，例如的6至10，7至10，6至9，7至9等，并包括整数之间的，在所述范围的上下文中合理的任何值与范围，如5.5，6.5，7.5，5.5至8.5和6.5
至9等。
[0063]在本说明书的上下文中，术语“多个”是指任何大于I的数。
[0064]但是应当指出的是，在治疗或疗法中作为参考使用本发明的方法和组合物将被理解为适用于人类和非人类，如兽医方面的应用。因此，应理解的是，除另有说明外，提及患者，个体或个人意为人类或非人类，例如社会、经济或研究上重要的任何物种的个体，包括但不限于羊，牛，马，猪，猫，犬，灵长类动物，啮齿类动物分类学成员，尤其是家养的这种分类学成员如羊，牛，马，犬。
[0065]在一定允许的程度上，本文中引用的所有参考文献通过引用将其整体并入本文。
[0066]优选实施方案详细说明
[0067]本发明将被更详细地描述，包括仅作为说明的方式参照以下实施例。
[0068]令人惊讶的是，本发明人已经鉴别了多种从脂肪组织来源的细胞(可以包括或者不包括脂肪细胞)的分泌物可有效地改善各种非炎症病况，用于刺激毛发、软毛和毛皮的生长，以及用于减轻痤疮。本发明所描述的是含有脂肪组织来源的分泌物的局部组合物以及组合物在用于治疗非炎症性病症，刺激毛发、毛皮和软毛生长，以及治疗或预防痤疮中的用途。
[0069]因此，本发明一方面提供了在个体中治疗非炎症性病症的方法，该方法包括向个体局部给予药物组合物，该药物组合物包括脂肪组织来源的分泌物，以及药学上可接受的载体或稀释剂。
[0070]当术语“炎症”用来表示病症时，指由炎症产生，由炎症导致或者导致炎症的，不正常的或以正常方式不能解除的病理过程。炎症性病症可以是全身性的或局限于特定的组织或器官中。本发明期望治疗的非炎症性病况并不作为以下情况的结果出现:不正常的炎症或以正常方式不能解除的炎症。
[0071]非炎症性病症的治疗包括减轻这类病症的一种或多种症状或表现。例如，本发明的方法包括皮肤病况的治疗。在特定的实施方案中，本发明提供了治疗皮肤病况的方法，其中所述的皮肤病况并不是炎症性病症的表现。虽然本发明期望治疗的特定状态可以出现一定程度的炎症，例如在晒伤的病况下，这种病况一般不归类为炎症性病症因此根据本发明的目的是非炎症性病况或者非炎症性病况的表现。
[0072]本发明期望治疗的具体状态包括:(i)皮肤干燥，(ii)皮肤瘙痒，(iii)昆虫叮咬， (iv)晒伤，(V)皮肤皱纹，(vi)皮肤过薄，(vii)皮肤开裂，(viii)昆虫蜇伤，(ix)症痕， (x)萎缩纹，(xi)晒斑，(xii)老年斑(xiii)黄褐斑，(xiv)眼睛周围的浮肿和/或黑眼圈， (xv)足癣，(xvi)疣，并且所述治疗减轻一种或多种所述治疗。[0073]脂肪组织来源的分泌物及其药物组合物的另一个令人惊讶的效果是，当对个体给药时其刺激毛发生长。因此，本发明在另一方面提供了刺激个体中毛发、软毛或毛皮生长的方法，该方法包括对个体局部给予包括脂肪组织来源的分泌物以及药学上可接受的载体或稀释剂的组合物。
[0074]该组合物针对个人的局部给药来配制。在某些实施方案中，个体是人类。当个体出现(i)手术引起的脱发，(ii)与化疗相关的脱发，(iii)辐射暴露相关的脱发，(iv)脱发症，(v)男性型秃顶，(Vi)女性型秃顶中的一种或多种时，组合物提供在个体中对毛发生长刺激的能力是有益的。
[0075]在某些实施方案中，被给予该组合物的个体是以生产软毛或毛皮为目的饲养的非人类动物。例如，个体可以是饲养用于生产软毛的羊，特别是绵羊。在某些实施方案中，非人类哺乳动物是伴侣动物或用于演艺的动物或种畜动物，如犬，猫，牛或马。
[0076]痤疮
[0077]本发明人已经鉴定脂肪组织来源的分泌物和其药物组合物对治疗痤疮是有效的。痤疮通常作为皮肤毛囊、毛孔或皮脂腺阻塞的结果而发生，其可通过堆积的死皮细胞和/或皮脂发生。这可以通过阻塞的毛囊，毛孔或腺体的菌落形成而加剧，例如通过天然存在的共生细菌痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes),或者通过金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus epidermidis)。[0078]通常受痤疮影响的皮肤区域的毛囊皮脂腺或腺体较为密集，如面部，胸部和背部的上半部分。在痤疮更严重的情况下，在汗水聚集在毛囊和排汗管道的皮肤区域可以发生痤疮囊肿，如臀部，腹股沟和腋下部位。痤疮可以体现为非炎症性的形式，虽然重度痤疮也可以有炎症的组成。但应理解在本发明中预期治疗或预防的痤疮可以有炎症的组成部分。 还应理解的是，在本发明中预期治疗或预防的痤疮可以是非炎症性的。
[0079]痤疮最常发生在青春期并且通常会延续到成年期。青春期的痤疮的发生可以与雄激素的增加有关，例如睾酮，其水平在男性和女性的青春期上升。
[0080]痤疮的物理表现可以是可变的并且根据对外观和长期作用的严重程度变化。轻度痤疮，例如，可以包括鳞片状的红色皮肤，黑头和白头(也可称为粉刺)，丘疹(也可称为针头(pinhead))，以及在更严重的情况下的脓疱或疙瘩，结节和囊肿。较大的结节被称为结节囊性痤疮或囊肿性痤疮。囊肿性痤疮与通常的痤疮相比通常会影响较深的皮肤组织。患有痤疮除了对个体有身体上的不适和潜在的心理影响，痤疮可对个体有较长期的影响，如对皮肤产生身体上的疤痕。
[0081]本发明预期治疗或预防所有形式的痤疮。在特定实施方案中，方法针对临床相关性痤疮。如本文所述，临床相关性痤疮为潜在地对个人产生不利影响的痤疮，无论是身体上的，例如通过疤痕，或者情绪上的，就这种程度来说临床干预是可取的。临床干预有可以或可以不是由一个受过训练的医生进行的。通常情况下，干预在患有中度至重度痤疮的个体， 或具有一种或多种大型结节或囊肿的个体，或患有大面积分布的痤疮的个体，或具有中度至重度痤疮的个人或家族病史的个体中是可取的。
[0082]通过使用本文所描述的脂肪组织来源的分泌物及其药物组合物，患有痤疮的个体可以经历病况的改善，包括减少患处皮肤的炎症，加速愈合和减少瘢痕形成。正如本文表明的，继续使用本发明的组合物，可以预防个体中痤疮的复发，或可以降低复发痤疮的严重程度。
[0083]脂肪组织
[0084]脂肪组织可以是人体脂肪组织或哺乳动物的脂肪组织。人类或动物可以是存活的或者是死亡的，但优选脂肪组织内具有可用的脂肪细胞。脂肪组织可以来源于成年的动物， 或源于未成年的动物。在特定的实施方案中，动物为伴侣动物，如犬或猫等家畜，或工作用动物。在其他具体的实施方案中，哺乳动物是农场用动物，种畜动物，或比赛用动物，如马 (包括马，驴(donkeys)，驴(asses))，牛(包括黄牛和水牛)，羊，山羊，猪，骆驼(包括骆驼，美洲驼，羊驼等)。在其它实施方案中，动物是研究用动物，如啮齿动物。在其它实施方案中，动物是动物园动物，例如猫科成员，犬科成员，啮齿目成员，或鲸目，奇蹄目，偶蹄目， 管齿目，蹄兔目，海牛目，长鼻目中的一个的成员。在优选的实施方案中，脂肪组织是牛的或猪的。
[0085]脂肪组织可来源于将被给予含有脂肪组织来源的分泌物的药物组合物的同一个体，其中脂肪组织以及因此脂肪组织来源的分泌物是自体的。脂肪组织可以来源于与将被给予含有脂肪组织来源的分泌物的药物组合物的个体同一物种的不同的个体，其中脂肪组织以及因此脂肪组织来源的分泌物是同种异体的。在某些实施方案中的脂肪组织可以来源于与将被给予含有脂肪组织来源的分泌物的药物组合物的个体不同物种的个体，其中脂肪组织以及因此脂肪组织来源的分泌物是异种的。脂肪组织可以源于单一来源或可以源于多于一个的来源，如单一物种的多于一个的个体或者或源于多个物种。
[0086]脂肪组织可以源于体内任意的可获得的来源。皮下脂肪，例如，易于只通过表面创伤获得，如从尾基切除，或者使用锁孔手术技术。皮下脂肪组织可利用吸脂技术收集。例如， 在绝育雄性或雌性哺乳动物时脂肪组织可与生殖组织一起去除。可从刚宰杀的动物去除脂肪组织。脂肪组织可以包括“白色”脂肪组织和/或“棕色”脂肪组织。在具体的实施方案中，脂肪组织只包含白色脂肪组织。
[0087]脂肪组织可以用组织培养基或缓冲的等渗溶液冲洗，以除去粘附的红血细胞。月旨肪组织也可用消毒液如聚乙烯吡咯烷酮碘进行冲洗，并可以在制备脂肪组织来源的细胞悬浮液之前被修剪或初步处理，以除去大血管或结缔组织的成分。
[0088]脂肪组织来源的细胞悬浮液
[0089]脂肪组织来源的细胞的分泌物以及因此含有这种分泌物的组合物，优选通过首先获取或制备脂肪组织来源的细胞悬浮液来制备。细胞悬浮液可以含有脂肪细胞，或者可以基本上不含脂肪细胞。当细胞悬浮液与起始物质相比脂肪细胞已大量去除时，如离心后去除脂肪细胞组分，为了制备脂肪组织来源的分泌物目的的细胞悬浮液在本文中应当理解为基本上不含脂肪细胞。应当理解的是在有关细胞悬浮液时使用基本不含有脂肪细胞时，既包括完全不存在脂肪细胞，还包括在原料中出现极微量的脂肪细胞保留的情况。
[0090]本文所用的术语“脂肪组织来源的细胞悬浮液”包括来自脂肪组织分离的细胞或脂肪组织小凝聚体或块，或者两种或更多种分离的细胞、脂肪组织小凝聚体或块的混合物。
[0091]细胞悬浮液可以使用在本【技术领域】中的可用的机械解离脂肪组织的技术获得。任何机械分离脂肪组织的合适的方法都可以 被使用，例如可以使用具有刀片切碎脂肪组织， 或通过剪刀，或迫使脂肪组织通过筛子或通过网眼大小足以破坏组织分离出单独的细胞和 /或脂肪组织小块的滤网。也可使用合适技术的组合。当离解的脂肪来源的细胞重聚集成较大的聚集体时可以形成脂肪组织的小聚集体，例如，在培养基中静置时。脂肪组织的小块或聚集体的最大直径可以小于10毫米,最大直径小于5毫米,最大直径小于1毫米,最大直径小于500 μm或最大直径小于250 u m。在某些实施方案中，使用机械分离技术而不是一种或多种蛋白水解酶。在这些实施方案中采用的技术，可用于迅速产生脂肪组织来源的细胞悬浮液。
[0092]用滤网或筛子过滤脂肪组织来源的细胞悬浮液，以除去大于网眼或筛孔孔径的细胞的聚集体或组织块。
[0093]在某些实施方案中，使用蛋白水解酶促进脂肪组织离解成脂肪组织来源的细胞悬浮液。适合用于此类用途的酶是本【技术领域】中已知的，包括但不限于胰蛋白酶和胶原酶。蛋白水解酶可在使用脂肪组织来源的细胞悬浮液前被去除或失活，特别是其中的这些酶可以与细胞悬浮液所需的用途不相容。在某些实施方案中，蛋白水解酶与机械分离脂肪组织的技术相结合用来产生脂肪组织来源的细胞悬浮液。
[0094]在特定的实施方案中，细胞悬浮液可以被悬浮在介质中。介质可以在脂肪组织离解的过程之前，之中或之后被添加脂肪组织中。介质可以是能够在适当的培养条件下，如组织培养基中，维持脂肪组织细胞至少存活24小时的介质。该介质可以是等渗的缓冲溶液， 如磷酸盐或HEPES缓冲盐水，其能够保持脂肪组织细胞至少存活一小时。该介质可以是无血清培养基。该介质可以包括支持或延长细胞悬浮液中的脂肪组织细胞存活的血清或血清成分。血清或血清成分可以是自体的血清或血清中的成分。血清或血清的成分可以是来源于单一的个人或来源自多个个人并集中的同种异体的血清或血清成分。
[0095]在另外的实施方案中，细胞悬浮液不是悬浮在介质中，而是将细胞悬浮在组织的离解的过程中形成的液体中。
[0096]在某些实施方案中，脂肪组织来源的细胞悬浮液的制备包括离心步骤。悬浮在液体(例如培养基)中的分离的细胞或者脂肪组织小聚集体或块的离心约为500g下10分钟， 或足够的时间和足够的离心力来产生含有脂肪来源的非脂肪细胞的细胞沉淀，细胞沉淀之上为介质层，依次漂浮在其上的为包含脂肪细胞的层，漂浮在顶部的为来源于破裂的脂肪细胞的脂质层。
[0097]离心后，在某些实施方案中，包含脂肪细胞的分泌物的介质层，可以被收集，从而代表脂肪组织来源的分泌物的一种组合物或来源。在本实施方案中，收集到的含有分泌物的介质或组合物可以包含或不包含脂肪细胞。
[0098]在某些其它实施方案中，离心后，脂质层和介质层被丢弃，保留的细胞被混合，保留脂肪组织来源的细胞悬浮液，其包括脂肪细胞和脂肪来源的非脂肪细胞的细胞。
[0099]在某些其它实施方案中，离心后，脂质层，介质层，含有脂肪细胞的漂浮层都被丢弃，从而保留主要脂肪来源的非脂肪细胞的细胞。
[0100]在某些实施方案中，可以使用多个离心步骤，例如提供额外的细胞分离步骤。
[0101]在其它实施方案中，脂肪组织来源的细胞悬浮液的制备不包括离心步骤。
[0102]脂肪组织来源的细胞悬浮液可以是新鲜分离的，即它可以被用于制备脂肪组织来源的分泌物，在从供体去除脂肪组织的约6个小时内对受体进行给药。在这些实施方案中， 脂肪组织来源的分泌物的制备通常不包括本文所述的培养细胞步骤。或者，脂肪组织来源的细胞悬浮液可以在被用于制备脂肪组织来源的分泌物之前被存储6小时以上，通常当悬浮在介质中时。
[0103]用于制备脂肪组织来源的分泌物的脂肪组织来源的细胞悬浮液可包含或不包含脂肪细胞。在特定的实施方案中，脂肪细胞包括活的脂肪细胞。在特定的实施方案中，脂肪细胞在其细胞质中保留着可检测量的脂质，并且可以根据脂质所提供的不同密度分离脂肪来源的非脂肪细胞。脂质可使用光显微技术被检测到，包括相差显微镜，或者通过用亲脂性染料，如油红0对细胞样品染色。在其细胞质中保留脂质的脂肪细胞比起其他脂肪来源的细胞是相对脆弱的，并且因此当需要活脂肪细胞的，应避免损害相当大的比例的脂肪细胞或致使其非活性的解离组织技术。例如，脂肪组织的超声波离解或使脂肪组织剧烈摇动的技术不可以提供其中包含大量活的脂肪细胞的细胞悬浮液。使用目前可获得技术，如LIVE/ DEAD细胞活力检测(Life Technologies),可以容易地确定脂肪细胞的活力。
[0104]在某些实施方案中，脂肪组织来源的细胞悬浮液不包含大量的脂肪来源的非脂肪细胞的细胞。在这些实施方案中，通过本文所述的包含离心步骤的方法可方便地制备脂肪组织来源的细胞悬浮液，通过该方法排除了沉淀的脂肪来源的非脂肪细胞的细胞。
[0105]在某些实施方案中，脂肪组织来源的细胞悬浮液包括脂肪细胞和脂肪来源的非脂肪细胞的细胞。在这些实施方案中，通过本文所述的包含离心步骤的方法可方便地制备脂肪组织来源的细胞悬浮液，其中脂肪细胞层和沉淀的脂肪来源的非脂肪细胞的细胞被收集。可选地，在这些实施方案中的脂肪组织来源的细胞悬浮液可通过如本文所述的解离脂肪组织来制备而无需离心步骤。
[0106]牛脂肪组织来源的细胞悬浮液
[0107]本发明人已经惊讶地发现，从牛来源的脂肪组织来源的细胞悬浮液的制备，特别是从牛尾基部组织，与适应于多种其他脂肪组织来源，如人，犬，马，小鼠和大鼠，的标准方法相比较难操作。因此，本发明的应用，如果其利用牛脂肪来源细胞的分泌物，优选地采用制备牛脂肪组织来源的细胞悬浮液的方法，此方法包括:
[0108]-将牛脂肪组织的样品暴露于蛋白水解酶的溶液来产生细胞悬浮液；
[0109]-离心细胞悬浮液，以形成细胞沉淀、位于含有脂肪细胞的漂浮细胞层上方的游离脂质层，和位于细胞沉淀与漂浮细胞层之间的中间层，所述中间层缺乏与细胞沉淀和漂浮细胞层相关的细胞；并且
[0110]-除去游离脂质层和中间层，
[0111]-任选地部分或基本完全除去含有脂肪细胞的漂浮细胞层，
[0112]-混合细胞沉淀以及，假如存在，所述漂浮细胞层来形成脂肪组织来源的细胞悬浮液，其可以或可以不包括脂肪细胞。
[0113]如本文所述，脂肪细胞层，也被称为漂浮细胞层，在制备过程中可以或可以不被去除。因此，本发明的方法和组合物，在不同的实施方案中，包括任选地去除脂肪细胞层获得基本不含脂肪细胞的细胞悬浮液；任选地保留脂肪细胞层获得含有脂肪细胞的细胞悬浮液；任选地部分去除脂肪细胞层。
[0114]在某些实施方案中，该方法可包括位于本说明书中的其他地方的制备脂肪组织来源的细胞悬浮液的额外步骤，尤其是上述的“脂肪组织来源的细胞悬浮液”部分。这些额外的步骤包括，例如，机械解离组织，用培养基或缓冲液等悬浮。
[0115]去除的中间层可以被保留因为它通常包括脂肪组织来源的分泌物。[0116]在某些实施方案中蛋白水解酶溶液包括胶原酶。
[0117]在某些实施方案中使用的胶原酶的终浓度为约0.25%w/v或更高。在某些实施方案中，牛脂肪组织暴露于蛋白水解酶是在导致脂肪组织不完全消化的条件下进行的，例如导致显著量的完好的脂肪组织存在的条件。通常情况下，例如，可以存在与开始消化之前具有相同的尺寸的脂肪组织块。在此方法的实施方案中，约20%至约80%的脂肪组织可以不被消化。
[0118]在某些实施方案中，细胞可以受到多个离心步骤或洗涤步骤，例如为了除去过多的游离脂质。
[0119]如以下部分进一步的描述，可以是任何物种的来源，如本文提及的，例如牛，猪， 犬，猫，人等，的脂肪组织来源的细胞悬浮液或其等分试样，可以被用于制备含有脂肪组织来源的细胞的分泌物的组合物。
[0120]含有脂肪组织来源的分泌物的组合物
[0121]含有从脂肪组织来源的细胞的分泌物的组合物可由脂肪组织来源的细胞悬浮液通过任何适当的方式制备，其可以或可以不包括脂肪细胞。如本文中提到的在脂肪组织来源的细胞悬浮液的制备中形成的液体组分通常包括脂肪组织来源的分泌物，从而表示含有这种分泌物的组合物的一个实施方案。以这种形式，含有脂肪组织来源的分泌物的组合物可以在制备细胞悬浮液的任何适当的阶段被收集，例如通过在离心脂肪组织来源的原料后收集位于细胞沉淀和漂浮细胞层之间的中间液体层。在本实施方案中所收集的含有分泌物的原料可以或可以不包括脂肪细胞。
[0122]通常情况下，该组合物通过将介质暴露于脂肪组织来源的细胞悬浮液产生。将介质暴露于脂肪组织来源的细胞悬浮液并不需要使细胞附着到基质上的条件。在这些实施方案中，所述含有脂肪组织来源的分泌物的组合物可通过以下产生:将介质暴露于脂肪组织来源的细胞悬浮液任意一段适当的时间，例如至少6小时,至少8小时,至少10小时,或至少12小时，然后从介质中除去细胞悬浮液，或反之亦然，例如通过离心或过滤。细胞悬浮液与介质的互相分离可以导致完全的或不完全的细胞去除。因此，含有脂肪组织来源分泌物的介质，从细胞悬浮液中取出后可以或可以不包括脂肪细胞。在某些实施方案中，该组合物通过以下产生:将介质暴露于脂肪组织来源的细胞悬浮液不超过12小时，不超过18小时或超过24小时。该组合物可包含脂肪组织细胞的细胞死亡或解体后，从细胞中释放的细胞来源的分子。该组合物含有脂肪组织来源的细胞悬浮液的细胞的分泌物。介质对脂肪组织来源的细胞悬浮液的接触，可以在4°C至50°C的温度下，更典型的温度为10°C至40°C，最典型的温度为20°C至37°C。
[0123]对于典型的脂肪组织来源的细胞悬浮液，5克脂肪组织被分离并被悬浮于含10% 自体血清的50ml的DMEM中。对于每克脂肪组织来源的原料，脂肪组织来源的细胞悬浮液通常包括从100，000个到1，000，000个非脂肪细胞的细胞。每克脂肪组织来源的原料中脂肪细胞数目通常是100，000至5，000，000之间。
[0124]本文所用的术语“介质”意在包括支持脂肪组织来源的细胞悬浮液中的至少部分细胞中的至少存活一个小时的组合物。该介质可以是组织培养的培养基，如DMEM，RPMI，或基本必需的培养基，任选地补充了血清。该介质可以是缓冲的等渗溶液，如磷酸盐缓冲盐水或Hank’ s缓冲盐水溶液，使介质适合于对个体给药。该介质可以是在脂肪组织的离解过程中形成的液体。该介质可任选地补充促进细胞存活或附着和细胞分裂的因子，如胰岛素， 孕激素和硒，或血清或血清成分。在某些实施方案中的介质必须适合药物组合物，其在体内使用是可以接受的。这样的介质，将基本上不含热原或其它可以对人类或动物有害的杂质。 药学上可接受的介质是可商购的。短语“药学上可接受的”指当给动物或人给药时不产生有害的，致敏的或其它不良反应的分子实体和组合物。
[0125]制备含有脂肪组织来源的分泌物的组合物可以包括裂解脂肪组织来源的细胞悬浮液的步骤。含有细胞的分泌物的裂解产物可以通过合适的方法制备。在示例性实施方案中，脂肪组织来源的细胞悬浮液可以暴露于介质，例如如上所述的介质。悬浮液中的细胞可通过任何合适的装置，例如由机械破坏(例如，剧烈振荡或搅拌)，超声波破坏，冻融，冷冻干燥或添加一种或多种可以诱导细胞裂解，例如脂肪细胞的裂解，的试剂。这种裂解试剂在本【技术领域】中是已知的，包括尿素，十二烷基硫酸钠和Triton XlOO0裂解步骤之后产物被离心或过滤以协助除去细胞碎片，或者它可以不经这种净化步骤就被使用，在这种情况下， 含有脂肪组织来源的分泌物的该组合物可以也包括细胞碎片。在某些情况下细胞裂解产物可以被从裂解试剂中去除，通过细胞裂解产物的沉淀。当裂解步骤导致不完全的细胞裂解时，含有脂肪组织来源的分泌物的该组合物也可以包括脂肪来源的细胞，例如脂肪细胞。
[0126]在某些实施方案中脂肪组织来源的分泌物的制备包括在适当的条件下培养细胞悬浮液。用于培养细胞悬浮液的方法在本【技术领域】是已知的并且包括，例如，培养细胞来形成贴壁细胞培养物，如汇合贴壁细胞培养，以及在旋转培养器中培养细胞。在细胞培养的期间或之后的任何适当时间收集上清液，比如从贴壁细胞培养物，可以是汇合贴壁细胞培养物，以及任选地，从所述上清液去除细胞以形成含有脂肪组织来源的分泌物的组合物。如此培养的细胞悬浮液可以包括脂肪细胞或者可以基本上不含脂肪细胞。为留下含有脂肪组织来源的分泌物的组合物而从上清液中去除细胞，可以是完全去除，或者可以是部分除去。在后者的情况下，包含脂肪组织来源的分泌物的该组合物也可以因此而包括脂肪细胞。
[0127]在细胞培养开始前，脂肪组织来源的细胞悬浮液可以被重新悬浮在所需的体积的合适的缓冲液中，如DMEM，RPMI或基本必须的培养基。细胞悬浮液或其等分试样，可以加入到无菌的组织培养瓶中，并在适当的条件下培养，通常至贴壁细胞达到汇合。细胞培养优选在无菌的血清中进行。培养中血清的浓度可以是协助脂肪组织来源的细胞的培养的任何合适的浓度，例如在约l%v/v至约30%v/v的范围内变化，例如约10%v/v，或约15%v/v或约 20%v/v。培养脂肪组织来源的细胞所用的血清可以是任何合适的血清，如商购的胎儿腓肠血清，或通过本【技术领域】中已知的方法内部制备的血清。优选为从与获取脂肪组织的同一个体来制备的自体血清，或同种异体血清。通常情况下，在37°C下在5%C02下培养细胞。
[0128]在培养过程中，脂·肪组织来源的细胞向培养基中分泌细胞因子，包括抗炎因子，促炎症因子，生长因子和其它细胞信号分子。培养物的上清液因而含有脂肪组织来源的分泌物。
[0129]在某些实施方案中的培养物可以被冷冻并且冷冻干燥，获得含有细胞和分泌物的冷冻干燥制剂。冷冻干燥制剂的再水化将裂解大多数细胞，导致额外的细胞因子被释放。再水化通常使用体积小于脂肪组织来源的细胞原来的体积的液体，例如比原来的体积小约5 和约20倍之间，更典型地为比脂肪组织来源细胞原来的体积小约为10倍，导致了 10倍浓缩的组合物。然后，该组合物可以进行过滤，以除去细胞碎片，产生含有浓缩的细胞因子的组合物。这提供了用于生产大体积浓缩分泌物的优选方法。
[0130]在其他某些实施方案中，上清液可以在任何合适的时间从培养物中收集，虽然通常在贴壁细胞培养中在细胞达到汇合时收集，例如在约3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13或14 天之后。细胞，细胞碎片和其它任何残留脂肪组织可以被从上清液中去除，例如通过过滤。 在实施方案中，可以是通过20微米的筛网过滤。如果需要的话，多个过滤步骤可以通过例如两个或更多个网眼尺寸逐渐减小的滤器进行。脂肪组织来源的分泌物制备产物通常是通过过滤灭菌，如0.22微米的过滤器。灭菌后的组合物可以被立即使用，或者可以被等分使用，或用于贮存。通常情况下，如果存储，该组合物被冷冻保存在_20°C中。该组合物含有脂肪组织来源的细胞的分泌物。
[0131]包含脂肪组织来源的分泌物的该组合物也可以包括脂肪细胞。当存在时，脂肪细胞可以从制备分泌物中使用的原来的脂肪组织残留下来，或者它们可以被添加到含有分泌物的组合物中。
[0132]本发明的药物组合物和其他组合物
[0133]根据本发明的多个方面，含有脂肪组织来源的分泌物的脂肪组织来源的组合物， 用于制备用于局部给药的药物组合物。根据一方面本发明提供了含有脂肪组织来源的分泌物的组合物，用于制备在治疗个体的非炎症疾病中局部使用的药物组合物。在另一方面本发明提供了含有脂肪组织来源的分泌物的组合物，用来制备在刺激个体中毛发、软毛或毛皮生长中局部使用的药物组合物。在另一方面本发明提供了含有脂肪组织来源的分泌物的组合物，用来制备用于治疗或预防痤疮，或其一种或多种的症状的局部使用的药物组合物。 通常情况下药物组合物也包括一种或多种药学上可接受的载体稀释剂、赋形剂或佐剂。根据本发明的再一个方面提供了药物组合物，其含有脂肪组织来源的分泌物以及药学上可接受的载体，稀释剂，赋形剂或佐剂。在某些实施方案中，该组合物包括脂肪组织来源的分泌物,还包括脂肪细胞。
[0134]在某些实施方案中，脂肪组 织取自于单个个体，并且将药物组合物向同一个体局部给药，因此脂肪组织来源的分泌物为纯粹的自体的制剂。
[0135]在某些实施方案中，脂肪组织是从一种或多种个体个体中获取并且药物组合物向同一物种的不同个体局部给药，因此，脂肪组织来源的分泌物是同种异体的细胞悬浮液。在某些实施方案中，脂肪组织从与将成为脂肪组织来源的分泌物的受体的不同物种的个体获取。例如，从牛或猪的组织中制备的含有分泌物的组合物，可用于对不同的物种局部给药， 诸如人。在实施方案中，含有脂肪组织来源分泌物的组合物用于作为原料来源用于同一物种的不同个体，或者作为原料来源用于不同物种，该组合物通常没有免疫系统细胞，以尽量减少宿主(受体)对组合物的免疫反应或移植物抗宿主病的可以性。
[0136]在某些实施方案中药物组合物是从一个以上的脂肪组织来源制备的，如从来自同一个体的不同制剂或取自不同个体的不同制剂。细胞库可以包括多种脂肪组织来源的细胞悬浮液的组合，如在培养皿的培养步骤或可以包含的多个脂肪组织来源的分泌物的组合物的组合，例如可从单独培养或接触步骤获得。
[0137]药物组合物对个体的局部给药，通常通过直接或间接与皮肤接触。还应理解本文所述的局部给药包括经皮给药。通常情况下，经皮给药系统包含被配制为含有一种或多种增加皮肤对此组合物的渗透性的试剂的药物组合物。[0138] 用于局部给药的药物组合物，例如用于治疗皮肤病况或刺激毛发生长，或用于治疗或预防痤疮，可以配制成水基乳膏或乳液，如聚西托醇霜或索柏林(sorbolene)霜，以增加在皮肤表面的停留。如本文所述，本发明人已经确定本发明的组合物能有效地刺激毛发、 毛皮或软毛生长。因此，本发明用于局部使用的组合物包括常规使用的护发产品，如香波， 护发素，发胶，等类似物。
[0139]当药物组合物对角膜给药时，它可以被配制成对角膜给药可接受的油基的软膏， 或者它可以与角膜可接受的人工泪液相混合，以增加在角膜表面的停留时间。
[0140]现在参照以下的实施例仅以说明的方式更详细地描述本发明。实施例旨在用于说明本发明，不应该被解释为限制整个说明书中描述的公布的一般性。
[0141]实施例1脂肪细胞和脂肪来源的非脂肪细胞的混合物的制备。
[0142]从成年犬腹股沟通过切除收集IOg脂肪组织样品。用生理盐水冲洗脂肪组织然后用剪刀完全切成碎末并且与20ml的Dulbecco氏改良Eagle培养基(DMEM，Sigma)混合。 加入胶原酶(Sigma)，使终浓度为0.05%w/v并将样品在37°C下孵育90分钟。孵育时每15 分钟用手将样品轻轻上下颠倒。
[0143]胶原酶处理后，将样品在无菌条件下通过不锈钢筛网(300 Pm孔径)过滤，转移到 50ml的离心管中，以500g离心15分钟。
[0144]离心样品内可见四个不同的分层:表面上小的(2mm厚)游离脂质层，下面是白色 IOmm厚的脂肪细胞层，然后是大而澄清的主要包括DMEM的液体层，然后是脂肪来源的非脂肪细胞沉淀。用滴管小心地除去小的脂质层。然后用新的滴管小心地穿过脂肪细胞取出澄清的DMEM而不干扰漂浮的脂肪细胞或细胞沉淀。这样获得了只包含漂浮的脂肪细胞和细胞沉淀的样品。漂浮的脂肪细胞和细胞沉淀用滴管轻轻混合并转移到一个15ml的离心管中。
[0145]然后将细胞在DMEM培养基中洗涤以除去胶原酶。加入DMEM培养基至最终体积为 14ml并在500g离心样品10分钟。这导致了三个不同的分层:漂浮的脂肪细胞，DMEM和脂肪来源的非脂肪细胞沉淀。通过插入滴管穿过脂肪细胞小心地除去DMEM注意不要干扰脂肪细胞或细胞沉淀。
[0146]漂浮的和沉淀的细胞被重新轻轻悬浮在4ml的DMEM培养基中并用滴管混合。
[0147]实施例2来自脂肪组织来源的细胞悬浮液的无细胞提取物的制备。
[0148]1Og犬脂肪组织样品用剪刀完全剪碎，然后用5ml的DMEM混合。将自体犬血清过滤灭菌并将Iml的量加入到剪碎组织的混合物中。
[0149]在37°C将组织混合物不搅拌培养过夜。然后将样品在1500g离心15分钟，并将漂浮的脂肪细胞和组织层和脂肪组织来源的非脂肪细胞沉淀之间的液体小心地收集起来。无细胞提取物含有来自脂肪组织的分泌物。
[0150]实施例3来自脂肪组织来源的细胞悬浮液的另一种无细胞提取物的制备。
[0151]从马的尾基通过切除收集IOg脂肪组织样品。用生理盐水冲洗脂肪组织，然后用剪刀粗略地剪成直径约5mm的小块并且与20ml的Dulbecco氏改良Eagle培养基(DMEM， Sigma)混合。加入胶原酶(Sigma)，使终浓度为0.05%w/v并将样品在37°C下孵育30分钟，在30分钟结束时脂肪组织被部分消化并由部分消化的脂肪颗粒，游离的基质血管细胞 (SVC)和游离的脂肪细胞的混合物组成。[0152]然后样品通过500g离心15分钟被洗涤以除去胶原酶。离心样品内可见四个不同的分层:表面上小的(2mm厚)游离脂质层，下面是白色IOmm厚的脂肪细胞层，然后是大而澄清的DMEM/胶原酶层，然后是脂肪来源的非脂肪细胞沉淀。用滴管小心地除去小的脂质层。然后用新的吸管小心地穿过脂肪细胞取出澄清的DMEM而不干扰漂浮的脂肪细胞或细胞沉淀。这样获得了只包含漂浮的脂肪细胞和细胞沉淀的样品。漂浮的脂肪细胞和细胞沉淀用滴管轻轻混合并转移到15ml的离心管中。
[0153]然后如下所述在DMEM中洗涤脂肪组织块和细胞以除去胶原酶。加入DMEM培养基至最终体积为14ml并在500g离心样品10分钟。这导致了三个不同的分层:漂浮的脂肪组织块和脂肪细胞，DMEM和脂肪来源的非脂肪细胞沉淀。通过将滴管插入穿过脂肪细胞小心地除去DMEM注意不要干扰脂肪组织，脂肪细胞或细胞沉淀。
[0154]组织i音养
[0155]将漂浮和沉淀的细胞重新轻轻悬浮于IOml的DMEM培养基中并转移到300ml的组织培养瓶中。加入30ml体积的DMEM和IOml无菌的自体血清，然后于37°C，5%C02下孵育。 每天用显微镜检查烧瓶。在第3和6天之间细胞变得贴壁并在且外观为成纤维状。
[0156]收获无细胞的分泌物
[0157]6天之后收集上清液并通过20微米筛网过滤除去悬浮的脂肪组织和细胞。该溶液通过0.22微米的过滤器过滤灭菌然后在无菌条件下分装到IOml的小瓶中并于_20°C下冷冻保存。
[0158]实施例4不含贴壁细胞的脂肪细胞和脂肪来源的非脂肪细胞的混合物的制备。
[0159]如实施例1中所描述的制备4ml体积的脂肪细胞和脂肪来源的非脂肪细胞。加入 Iml体积的过滤灭菌的自体犬血清至细胞混合物中。
[0160]在组织培养瓶中将细胞混合物在37°C不搅拌培养过夜。使用倒置显微镜检测样品，观察到细胞层贴附在该烧瓶的表面。也观察到了未贴壁的细胞和漂浮的脂肪细胞。非贴壁细胞，包括脂肪细胞和脂肪来源的非脂肪细胞的细胞被小心地倾倒并收集。这些细胞适于制备含有脂肪组织来源的分泌物的组合物。
[0161]实施例5脂肪细胞的悬浮液的制备。
[0162]从犬腹股沟通过切除收集IOg脂肪组织样品。用生理盐水冲洗脂肪组织，然后用剪刀完全剪碎并且与20ml的Dulbecco氏改良Eagle培养基(DMEM，Sigma)混合。加入胶原酶(Sigma)，使终浓度为0.05%v/v并将样品在37°C下孵育90分钟。每15分钟用手将样品轻轻上下颠倒。
[0163]然后将样品通过不锈钢筛网(300i!m孔径大小)的无菌过滤，转移到50ml离心管中，以500g离心15分钟。
[0164]离心样品内可见四个不同的分层:表面上小的(2mm厚)游离脂质层，下面是白色 IOmm厚的脂肪细胞层，然后是大而澄清的DMEM层，然后是脂肪来源的非脂肪细胞沉淀。用滴管小心地除去小的脂质层。然后用新的吸管小心地穿过脂肪细胞取出澄清的DMEM而不干扰漂浮的脂肪细胞或细胞沉淀。这样获得了只包含漂浮的脂肪细胞和细胞沉淀的样品。 漂浮的脂肪细胞和细胞沉淀用滴管轻轻混合并转移到15ml的离心管中。
[0165]然后将细胞在DMEM培养基中洗涤以除去胶原酶。加入DMEM培养基至最终体积为 14ml并在500g离心样品10分钟。通过插入滴管穿过脂肪细胞小心地除去DMEM。[0166]含有脂肪细胞的漂浮的细胞被重新轻轻悬浮在4ml的DMEM培养基中。每一步骤暴露于脂肪组织或脂肪细胞的DMEM含有脂肪组织来源的细胞分泌物。
[0167]实施例6牛脂肪组织来源的细胞悬浮液的制备
[0168]人，犬，家猫，雪豹，马，大鼠和小鼠的脂肪组织均已被正常浓度(0.02%或0.05%) 的胶原酶消化。制备脂肪组织来源的细胞(剪碎和胶原酶消化法)的标准方法的使用，例如上述，当应用于牛组织时是不成功的。本发明人最初试图用0.02%v/v胶原酶消化，此是可以成功地用于人，犬，马脂肪组织的浓度。这没有成功。引入了增加消化时间和摇晃消化混合物。这导致剪碎的组织形成了一个圆形的实心块。胶原酶浓度增加至0.1%组织仍然没有消化。令人惊讶的是，直到用浓度为0.25%v/v胶原酶消化该混合物两小时该组织才会消化。
[0169]由于牛脂肪组织的随时可得性，缺乏人畜共患疾病(特别是澳大利亚)，以及公众对使用牛制品的接受，其是有吸引力的分泌物来源。出于类似的原因，本发明人认为，猪脂肪组织也是本发明方法使用的一个有吸引力的来源。
[0170]实施例7牛脂肪组织的分泌物的制备
[0171]脂肪组织的制备
[0172]从两岁公牛的尾基通过切除收集IOg脂肪组织样品。用生理盐水冲洗脂肪组织， 然后用剪刀完全剪碎并且与20ml的Dulbecco氏改良Eagle培养基(DMEM，Sigma)混合。 加入胶原酶(Sigma)使终浓度为0.25%[w/v]并将样品在37°C下孵育120分钟。
[0173]然后，将样品在500g下离心15分钟。离心样品内可见四个不同的分层:表面上小的(2_厚)游离脂质层，下面是白色20_厚的脂肪细胞层，然后是大而澄清的DMEM层，然后是脂肪来源的非脂肪细胞沉淀。用滴管小心地除去小的脂质层。然后用新的滴管小心地穿过脂肪细胞取出澄清的DMEM而不干扰漂浮的脂肪组织，脂肪细胞或细胞沉淀。这样获得了只包含悬浮在少量DMEM中的漂浮的脂肪组织块和脂肪细胞和细胞沉淀的样品。脂肪组织块和脂肪细胞和细胞沉淀用滴管轻轻混合并转移到一个15ml的离心管中。`
[0174]然后将脂肪组织和细胞在DMEM培养基中洗涤以除去胶原酶。加入DMEM培养基至最终体积为14ml并在500g离心样品10分钟。这导致了三个不同的分层:漂浮的脂肪组织块和脂肪细胞，DMEM培养基和脂肪组织来源的非脂肪细胞沉淀。DMEM用滴管小心地穿过脂肪细胞取出而不干扰脂肪组织块，脂肪细胞或细胞沉淀。
[0175]组织培养
[0176]将漂浮和沉淀的细胞重新轻轻悬浮于IOml的DMEM培养基中并转移到300ml的组织培养瓶中。加入30ml体积的DMEM和IOml无菌的自体血清，然后将培养瓶置于37°C， 5%0)2下培养。每天用显微镜检查烧瓶。在第3和6天之间细胞变得贴壁并且外观为成纤维状。在第5和10天之间细胞达到汇合状态。
[0177]收集含有细胞的分泌物的组合物
[0178]一旦细胞在培养瓶底部汇合即收集上清液并通过20微米筛网过滤除去悬浮脂肪组织和细胞。该溶液通过0.22微米的过滤器过滤灭菌，然后在无菌条件下分装到IOml的小瓶中并于_20°C下冷冻保存。
[0179]实施例8:牛脂肪组织来源的浓缩分泌物的制备
[0180]牛脂肪组织被收集，处理，并置于如实施例7所述的组织培养瓶中。[0181]一旦贴壁细胞汇合组织培养瓶即被冷冻，然后在Telstar Lyobeta冷冻干燥机中冷冻干燥2天。将所得的冻干饼用2.5ml的蒸馏水再水化。然后将浓缩的样品通过HHO 柱(GE Lifesciences)来脱盐从柱中洗脱。3.5ml体积。此小体积包含了浓缩的细胞因子混合物。
[0182]实施例9:来源于不含脂肪细胞的牛脂肪来源细胞的分泌物的制备
[0183]脂肪组织的制备
[0184]从两岁公牛的尾基通过切除收集IOg脂肪组织样品。用生理盐水冲洗脂肪组织， 然后用剪刀完全剪碎并且与20ml的Dulbecco氏改良Eagle培养基(DMEM，Sigma)混合。 加入胶原酶(Sigma)使终浓度为0.25%[w/v]并将样品在37°C下孵育120分钟。
[0185]然后，将样品在500g下离心15分钟。离心样品内可见四个不同的分层:表面上小的(2_厚)游离脂质层，下面是白色20_厚的脂肪细胞层，然后是大而澄清的DMEM层，然后是脂肪来源的非脂肪细胞沉淀。所有的液体和漂浮层被除去。
[0186]然后将脂肪组织和细胞在DMEM培养基中洗涤以除去胶原酶。加入DMEM培养基至最终体积为14ml并在500g离心样品10分钟。然后倾倒出DMEM培养基。
[0187]组织培养
[0188]将沉淀的细胞轻轻重新悬浮于IOml的DMEM培养液中，并转移到300ml的组织培养瓶中。加入30ml体积的DMEM和IOml无菌的自体血清，然后将培养瓶置于37°C，5%C02下培养。每天用显微镜检查烧瓶。在第3和6天之间细胞变得贴壁并在且外观为成纤维状。 在第5和10天之间细胞达到汇合状态。
[0189]收获包括细胞分泌物的组合物
[0190]一旦细胞在培养瓶底部汇合即收集上清液并通过20微米筛网过滤除去细胞。该溶液通过0.22微米的过滤器过滤灭菌，然后在无菌条件下分装到IOml的小瓶中 并于_20°C 下冷冻保存。
[0191]实施例10
[0192]除其他外，实施例1-9描述了脂肪组织来源的细胞悬浮液的制备，其中所述悬浮液可以或可以不包括脂肪细胞，以及包含脂肪组织来源的分泌物的无细胞提取物(例如， 实施例2)。在这些细胞悬浮液的制备过程中，方法可包括脂肪组织，其可以或可以不被部分地或完全地消化，暴露于液体，通常是实施例中的DMEM培养液。在暴露期间，包括脂肪细胞的脂肪组织来源的细胞向液体中分泌细胞因子。在制备脂肪组织来源的细胞悬浮液过程中，液相例如DMEM培养基可以被描述为含有脂肪组织来源的分泌物的组合物。
[0193]实施例1-9中所述的脂肪组织来源的细胞悬浮液，可进一步在含有脂肪组织来源的分泌物的组合物的制备中应用，如本文所描述的方法。例如，脂肪组织来源的细胞悬浮液可以暴露于合适的培养基并且收集培养基，或细胞悬浮液被裂解并且收集培养基，或者细胞悬浮液可以在适当的条件下培养并收集培养基，或者细胞悬浮液可以在适当的条件下培养并进行冷冻干燥然后在所要求的量的合适的液体中再水化。在包含脂肪组织来源的分泌物的组合物的制备中利用脂肪组织来源的细胞或细胞悬浮液的这些方法的多种实施例在本文中有描述。
[0194]实施例10:加速犬的毛发生长
[0195]脂肪组织来源的分泌物对犬类的给药导致在动物中毛发再生的加速。两只相关的罗德西亚背脊犬在其肩膀上具有剃除的区域。一只狗具有如实施例7中描述制备的牛来源的分泌物对左侧的区域局部使用，每天两次，而右侧区域没有接受处理。另一只狗具有剃除区域而没有接受处理。定期对区域摄像。两个星期后，处理的区域已经再生为原毛发的 75%(图1左图)。同一只狗的未经处理的区域再生为约20%(图1右图)。未经处理的狗的区域再生5% (图中未显示)。
[0196]实施例11:人的皮肤病况的处理
[0197]根据实施例7中所述方法制备牛脂肪组织的分泌物。分泌物与等量的水基乳膏BP 混合并分装到塑料小瓶中在4°C下保存直至使用。向人群提供小瓶乳膏用于局部应用范围的试验。以下的说明举例说明了各种患者使用组合物的方式，所治疗的病症和结果，由患者所描述。
[0198](i)患者 I
[0199]感谢试用乳膏的机会。我在两个区域涂敷了乳膏。
[0200]1.面部疤痕_(两年疤痕)
[0201]2?跖疣_(至少5年)
[0202]1.面部疤痕
[0203]试验开始:2010年11月
[0204]我每天直接将乳膏涂在疤痕上。
[0205]第一周-没有明显的改善。
[0206]第二周-疤痕看起来更平滑。
[0207]第三周-继续看上去更平滑/轻微变淡。
[0208]第四周-至2011年I月-没有进一步改善。
[0209]2.跖疣
[0210]试验开始:2010年11月
[0211]我晚间直接将乳膏涂在跖疣上。
[0212]第一至四周-没有明显的改善。
[0213]第四周-疣的外观有明显的变化。
[0214]第四周至11年I月-每日改善-导致疣体完全消失。
[0215](ii)患者 2
[0216]我在我的胳膊上的手术疤痕上试用乳膏。将它涂敷在一半的疤痕上每天两次约3 周，在疤痕的愈合上可观察到与未经治疗的一半相比的差异。
[0217]被处理的一半疤痕显示出比未经处理的部分的深红色更浅更一致的颜色。在处理几天后观察到了变化。
[0218](iii)患者 3
[0219]牛分泌物乳膏对晒伤有快速而积极的效果。
[0220]晒伤为中度(显著的皮肤发红和疼痛)，位于面部，前臂和小腿。在阳光下暴露后晚上将乳膏涂于面部和前臂两次(阳光照射后约1.5小时和5小时)。在即将睡觉之前第二次涂敷乳膏。用水洗涤皮肤，但没有使用任何肥皂或非皂类清洁剂。
[0221]没有任何形式的乳膏涂敷于晒伤的小腿皮肤。
[0222]烧伤的手臂和面部在首次涂敷2小时后明显痛苦减轻。在下一个早晨(涂敷两次后)面部和胳膊几乎无疼痛。在40oC淋浴时手臂和面部有一点疼痛，然而，未处理的小腿相当疼痛。
[0223]早晨在面部和手臂第三次应用乳膏(日晒后约16小时)。疼痛消失并且发红显著降低。未经处理的小腿皮肤还是红/粉红色并疼痛。
[0224](iv)患者 4
[0225]这里是我的乳膏体验:
[0226]主要观察结果:我的妻子和我将乳膏涂于蚊虫叮咬处，约10分钟内瘙痒消失。同一天涂敷乳膏两次以上则在一天之内叮咬消失。我已经试了三次而我的妻子试了一次。其他未经处理的蚊虫叮咬处瘙痒若干天。
[0227](V)患者 5
[0228]我将乳膏涂于蚊虫叮咬处约10分钟内瘙痒消失。第二次涂敷乳膏后叮咬处痊愈没有进一步瘙痒。在同一时间，我用l%Dermaid霜处理其他蚊虫叮咬处并观察到Dermaid 霜效果并不像牛的分泌物乳膏那么明显。
[0229](vi)患者 6
[0230]我是一名50岁的妇女并且每天我将乳膏涂在面部。4周后我的皱纹变得不太明显。6周后人们开始评论我的外表。
[0231](vii)患者 7
[0232]牛细胞的分泌物乳膏被给予一位具有足癣的患者自我涂敷一段时间。治疗的患者的报告如下:
[0233]我使用了牛细胞的分泌物乳膏来治疗我的左脚小脚趾之间的足癣。足癣是鳞片状的皮肤并且一直超过12个月无法愈合。最近我还没有治疗这种状态。我每天晚上用乳膏涂擦患处约一星期。经过约一个星期我停止使用该乳膏后，我注意到鳞片状皮肤似乎不太明显和发痒。再经过一·周(没有进一步应用乳膏)，瘙痒和脱皮的皮肤已经消失并且6个月以上没有复发。
[0234](viii)患者 8
[0235]对于我13岁女儿的晒伤，她被晒伤尤其是她的胸部和肩部周围发红。我认为这相当严重并且皮肤会十分迅速剥离。那天晚上，我涂了牛细胞分泌物乳膏。在早晨发红减少， 那个早晨我再次涂敷了乳膏。在24小时内发红已经明显减少，皮肤没有任何明显的起泡或剥离。我认为我们再次使用了乳膏。没有负面作用。
[0236]实施例12:治疗痤疮
[0237]这个例子演示了牛脂肪组织来源的分泌物在治疗痤疮中的疗效。
[0238]方法:
[0239]如实施例7中详细描述，制备了牛脂肪组织来源的分泌物(以下简称“CellFree”) 生产的一个批次(批号# CFB-3A)。此CellFree过滤灭菌然后在BTF在T175组织培养瓶内冷冻干燥。将100ml的CFB-3A放置在2个T175中，然后每个培养瓶再用IOml无菌水重建。然后10倍浓缩液通过roio柱子过滤，如下所示:
[0240]1.从roio顶部倾倒叠氮化钠
[0241]2.切断F1DlO底部的滴落(tip off)
[0242]3.向roiO顶部加入20ml的PBS允许其排水[0243]4.向 PDlO 顶部添加 2.5ml 浓缩 CellFree
[0244]5.允许所有的液体通过在roiO顶部的玻璃珠
[0245]6.添加3.5ml的PBS并在TOlO底端放置收集管来收集脱盐浓缩的CellFree。
[0246]总共收集27ml的脱盐浓缩CellFree并加至54克水基乳膏BP (Kenkay Batch29A01exp05/13)。
[0247]进行批次测试。6名人类志愿者在他们的胳膊上施加200 U I乳膏并在上面放置了创可贴。将其保持在适当位置约8小时。目前还没有乳膏的不利影响的报告。
[0248]乳膏在从药店购买的透明塑料小瓶里被分为7X 10克。
[0249]收到参与试验的个人(此处简称为人类志愿者(HV) # 1- # 7)的知情同意书后， 每人完成了 TF-002痤疮试验表格，生产的7瓶乳膏每瓶被提供给试验中的每个个体。
[0250]根据TF-002痤疮试验协议个人分别被给予以下说明:
[0251]这是一个21天的试用期，您需要每日填写提供的试验记录表。[0252]第1-7天不涂敷乳膏。
[0253]第8-21天您需要涂敷乳膏，每天两次。
[0254]-在整个21天中请继续与您当前的日常皮肤治疗。
[0255]-每天一次给你的皮肤打分，使用以下的1-6分级。
[0256]-记录使用痤疮乳膏时与你的皮肤有关的任何其他观察，以下包括潜在因素列表。
[0257]-请使用反面表格给你的皮肤打分。
[0258]-请每天在大致相同的时间记录你的分数。
[0259]-使用此表格结束时提供的线，请注意您的当前皮肤的日常护理。例如清洁，处方药或者来自药房或超市治疗。
[0260]1-6痤疮等级
[0261]1.清洁，显示无炎性病变(红疙瘡，白色或黄色的‘挤压’的点)或非炎症性病变 (黑头或白头)。
[0262]2.一些零星的黑头和白头以及你的皮肤油腻。
[0263]3.在四分之一的面部具有30-40个红色的小突起，黑头和白头。
[0264]4.在一半面部具有红色的小突起，黑头和浅表的白色或黄色的“挤压”点。
[0265]5.四分之三的面部有许多黑头和白色或黄色的“挤压”点。
[0266]6.大部分面部受到大的红色发炎肿块或黑头，白头或白色或黄色的“挤压”点影响。
[0267]观察注意事项
[0268]1.发红
[0269]2.瘙痒
[0270]3.皮肤变得坚硬
[0271]4.皮肤变得光滑
[0272]5.皮肤变得柔软
[0273]6.涂敷时有刺痛感
[0274]7.褪色
[0275]8.没有变化[0276]结果:
[0277]
【权利要求】
1.含有脂肪组织来源的分泌物的组合物在制备用于局部治疗个体中非炎症性病症的药物中的用途。
2.脂肪组织来源的分泌物在制备用于局部使用以刺激个体中毛发，毛皮或软毛生长的药物中的用途。
3.含有脂肪组织来源的分泌物的组合物在制备用于局部治疗或预防个体中痤疮的药物中的用途。
4.如权利要求1至3中任一项所述的用途，其中所述脂肪组织来源的分泌物来源于牛或猪。
5.如权利要求1至3中任一项所述的用途，其中所述含有脂肪组织来源的分泌物的组合物还包含脂肪细胞。
6.如权利要求1所述的用途，其中所述非炎性病症与所述个体中一种或多种下述病况有关:(i)皮肤干燥，(?)皮肤瘙痒，(iii)昆虫叮咬，(iv)晒伤，(v)皮肤皱纹，(vi)皮肤过薄，(vii)皮肤开裂，(viii)昆虫蜇伤，(ix)症痕，(x)萎缩纹，(xi)晒斑，(xii)老年斑(Xiii)黄褐斑，(XiV)眼睛周围的浮肿和/或黑眼圈，(XV)足癣，(xvi)疣，并且所述治疗缓解一种或多种所述病况。
7.如权利要求2所述的用途，其中所述个体具有一种或多种:(i)手术引起的脱发，(?)化疗相关的脱发，(iii)辐射暴露相关的脱发，(iv)脱发症，(V )男性型秃顶，(Vi)女性型秃顶。
8.如权利要求3所述的用途，其中所述个体是青少年。
9.治疗个体中非炎症性病症的方法，所述方法包括向所述个体局部给予药物组合物，所述药物组合物包含脂肪组织来源的分泌物以及药学上可接受的载体或稀释剂。
10.刺激个体中毛发、软毛或毛皮生长的方法，所述方法包括向所述个体局部给予药物组合物，所述药物组合物包含脂肪组织来源的分泌物以及药学上可接受的载体或稀释剂。
11.治疗或预防个体中痤疮的方法，所述方法包括向所述个体局部给予药物组合物，所述药物组合物包含脂肪组织来源的分泌物以及药学上可接受的载体或稀释剂。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述个体是青少年。
13.如根据权利要求11的方法，其中所述个体具有临床相关性痤疮。
14.如权利要求9至13中任一项所述的方法，其中所述脂肪组织来源的分泌物来源于牛或猪。
15.如权利要求9至14中任一项所述的方法，其中所述包含脂肪组织来源分泌物的组合物还包含脂肪细胞。
16.制备牛脂肪组织来源的分泌物的方法，所述方法包括: (i)将牛脂肪组织样品暴露于蛋白水解酶的溶液，以产生细胞悬浮液； (?)离心所述细胞悬浮液，以形成细胞沉淀、位于包括脂肪细胞的漂浮细胞层上方的游离脂质层、和位于细胞沉淀与漂浮细胞层之间的中间层，与所述细胞沉淀和所述漂浮细胞层相比，所述中间层的细胞较少；并且 (iii)除去游离脂质层和中间层； (iv)任选地除去部分或基本所有的包含脂肪细胞的漂浮细胞层； (v)混合细胞沉淀与，如果存在的话，包含脂肪细胞的漂浮细胞层，以形成脂肪组织来源的细胞悬浮液，所述细胞悬浮液可以包括或不包括脂肪细胞； (Vi)在适当的条件下培养所述细胞悬浮液； (Vii)收集细胞培养物的上清液以形成含有牛脂肪组织来源的分泌物的组合物。
17.如权利要求16的方法，其中所述蛋白水解酶溶液含有最终浓度为约0.25%w/v的胶原酶。
18.如权利要求16所述的方法，其中培养细胞悬浮液包含培养(i)贴壁细胞培养物，或(?)培养旋动培养物。
19.如权利要求16所述的方法，其中收集的上清液包含脂肪细胞。
20.如权利要求18所述的方法，其中所述贴壁细胞培养物为融合细胞培养物。
21.如权利要求16所述的方法，其还包括冷冻干燥所述牛脂肪组织来源的分泌物。
22.如权利要求21所述的方法，其还包括再水化所述冷冻干燥的材料。
【文档编号】A61P17/12GK103596577SQ201280022199
【公开日】2014年2月19日 申请日期:2012年3月15日 优先权日:2011年3月15日
【发明者】格雷厄姆·维赛, 丽贝卡·安妮·韦伯斯特 申请人:赛尔爱迪尔私人有限公司