表达人h-铁蛋白的重组酵母的制作方法

表达人h-铁蛋白的重组酵母的制作方法
【专利摘要】描述了包含在酵母组成型TDH3转录启动子控制下编码人H-铁蛋白的核酸序列的重组酵母，包含整合到酵母染色体中的TDH3位点的编码人H-铁蛋白的核酸序列的重组酵母，在酵母组成型TDH3转录启动子控制下用于表达人H-铁蛋白的酿酒酵母（S.cerevisiae）的H-铁蛋白表达盒，包含所述重组酵母的组合物及其在治疗中的应用，例如铁紊乱的治疗。
【专利说明】表达人H-铁蛋白的重组酵母
[0001] 本申请涉及重组酵母的新的菌株，包含所述酵母的组合物以及治疗铁缺乏紊乱的方法。
_2] 发明背景
[0003]铁是必需的营养素，其不仅是运载氧气遍及血流所需要的，而且是有氧呼吸所必需的酶的重要组分。在世界上，铁缺乏是最常见的营养素缺乏，并且在25%的年龄小于 2 岁的儿童中存在铁缺乏(DeMaeyer, E.and Adiels-Tegman, M., World Health Stat.Q.38: 302-316, 1985 ; Beard, J.and Stoltzfus, R., J.Nutr.131: 563S-703S, 2000)。慢性、重度的儿童铁缺乏的神经后遗症包括学习成绩差、认知能力降低和行为问题(Beard, J., and Connor, J., Annu.Rev.Nutr.23:41-58, 2003 ; Lozoff, B.,等人，Nutr.Rev.64: S34-S43，2006)，其多数持续下述膳食铁补充(Felt, B.，等人，Behav.BrainRes.171:261-270;Lozoff, B.，等人,Nutr.Rev.64:S34_S43, 2006)。脑具有任何器官的最高速率的氧化代谢并且需要相对高数量的铁。在早期出生后发育过程中的膳食铁缺乏可以导致精神紊乱和重度运动损伤，这可能持续到成年。髓鞘形成的过程似乎尤其依赖于铁的可利用性，特别是在关键的生长期期间(见Hulet，S.W.，等人，J.Neurochem.72:868-874，1999 用于引用)。
[0004]已开发了许多膳食铁补充剂，但是具有有限的功效，因为铁吸收差或补充剂依赖于环境条件来产生一致水平的铁。在发达国家护理的标准是一天三次摄取325mg的硫酸亚铁。这种非常高剂量的铁是必需的，因为在这种形式下铁的吸收差。然而，由于如此高剂量的给药方案导致了胃肠的不适和高比率的不依从性， 因此仍然需要用于治疗铁缺乏紊乱的更有效的和成本效益好的口服铁补充剂。
[0005]传统上，认为转铁蛋白是用于细胞铁递送的主要机制，并且已在血脑屏障中鉴定了转铁蛋白介导的转运系统(Jefferies ff.A.,等人 Nature312:162-163，1984;FishmanJ.，等人，J.Neurosc1.Res.18:299-304，1987)。然而，已从低转铁蛋白小鼠的试验提出不依赖转铁蛋白的对脑的铁递送(Malecki E.A.,等人，J.Neurol.Sc1.170:112-118，1999)，并可能涉及铁蛋白。
[0006]铁蛋白，作为在许多原核生物和真核生物中主要的细胞内铁储存蛋白，是包含24个多肽亚基的大的(接近480kDa)多亚基复合物。在血清中发现高浓度的这种铁储存复合物在水合氧化铁核中能够包含多达4500个原子的铁离子(Fe3+)。在哺乳动物中，有两种不同的亚基类，即分子量分别为约21kDa和19kDa的重(H)和轻(L)型，所述重(H)和轻(L)型共享约54%的序列同源性。所述H和L亚基呈现具有不同的功能:L亚基增强铁核的稳定性，而H亚基具有铁氧化酶活性，所述铁氧化酶活性对于亚铁的快速摄取看来是必需的。富含H的铁蛋白位于经历局部铁浓度快速变化的组织中。例如，在经历分化、发育、增殖和代谢应激的细胞中，H亚基的表达相对于L亚基优先增加。
[0007]由于高度发育的结合邻近内皮细胞的紧密连接，脑对于铁的获得施加了提高的挑战，所述内皮细胞组成脑微血管系统。这些连接阻止了分子进入脑的胞外通量。所产生的血脑屏障对于保护脑免受在血液中循环的潜在有害物质是高度有效的机制。然而，这样的封锁的结果是对于许多对正常脑功能所需要的营养物质，例如铁，必须设计特定的转运机制。此外，测量血液样品中血红蛋白和血细胞比容水平的传统方法不说明铁是否穿过血脑屏障或提供脑铁浓度的任何指征(Beard,等人，J.Neurosc1.Res.79:254-261，2005;Malecki,等人，J.Neurosc1.Res.56:113-122，1999)。
[0008]尽管已显示H-铁蛋白向铁缺乏的大鼠提供铁，但是在这些研究中在进食H-铁蛋白的动物中血红蛋白的恢复和血细胞比容水平不比在当前的护理标准进食FeSO4的动物中更好(Chang, Y-J.，等人，Nutrition21:520-524, 2005)。因此，仍然需要治疗铁缺乏紊乱的改进的方法。
[0009]发明概沭
[0010]根据本发明的一方面，提供了包含在酵母组成型TDH3转录启动子控制下编码人H-铁蛋白的核酸序列的重组酵母。
[0011]根据本发明的另一方面，提供了包含整合到酵母染色体中的TDH3位点上的编码人H-铁蛋白的核酸序列的重组酵母。
[0012]根据本发明的又一方面，提供了在酵母组成型TDH3转录启动子控制下用于表达人H-铁蛋白的酿酒酵母(S.cerevisiae)的H-铁蛋白表达盒。
[0013]优选地，所述表达盒包含编码人H-铁蛋白的开放阅读框。
[0014]优选地，所述表达盒包含转录终止子，优选来自酵母CYCl基因。
[0015]优选地,所述表达盒包含一个或多个1xP位点,优选为两个1xP位点。
[0016]优选地，所述表达盒包含可选择标记物，优选为URA3。
[0017]根据本发明的另一方面，提供了包含本发明的重组酵母的组合物。
[0018]优选地，所述组合物是药物组合物。
[0019]优选地,所述组合物是医疗食品。
[0020]优选地，所述组合物是营养补充剂。
[0021]优选地，本发明的组合物包含一种或多种另外的活性化合物。优选地，所述一种或多种另外的活性化合物是治疗活性化合物，例如以用于与本文所描述的组合物共同递送的另外的治疗化合物的形式。
[0022]优选地，所述组合物用于口服给药。
[0023]优选地，所述组合物用于在血液输注中、鼻喷雾或通过在液体中消耗给予患者。
[0024]根据本发明的又一方面，提供了用于在治疗中使用的本发明的重组酵母或组合物。
[0025]根据本发明的另一方面，提供了本发明的重组酵母或组合物在治疗中的应用。
[0026]根据本发明的再一方面，提供了用于治疗疾病或紊乱的方法，所述方法包括给予有需要的患者本发明的重组酵母或组合物。
[0027]根据本发明的另一方面，提供了本发明的重组酵母或组合物在制备用于治疗疾病或紊乱的药物中的应用。
[0028]优选地,所述治疗包括疾病或紊乱的治疗。
[0029]优选地,所述疾病或紊乱是铁紊乱。
[0030]优选地，所述H-铁蛋白是哺乳动物H-铁蛋白。
[0031]优选地，所述哺乳动物H-铁蛋白是人H-铁蛋白或其同源物。[0032]优选地，所述同源物与人H-铁蛋白具有至少90%的序列同源性。
[0033]根据本发明的另一方面，是用于治疗患者中铁紊乱的方法，所述方法包括给予有需要的患者治疗有效量的铁蛋白-铁复合物。
[0034]优选地，所述铁蛋白-铁复合物包含H-铁蛋白。
[0035]优选地，所述H-铁蛋白是重组H-铁蛋白。
[0036]优选地，所述重组H-铁蛋白在酵母、细菌或杆状病毒中产生。
[0037]优选地，所述铁紊乱是缺铁性贫血。
[0038]优选地，所述铁紊乱与脑中铁缺乏相关。 [0039]优选地，所述铁紊乱是神经障碍或神经退行性障碍。
[0040]优选地，所述铁紊乱选自帕金森病、阿尔茨海默病、抑郁症、失眠症、多发性硬化症、不安腿综合征、注意力缺失症和肌萎缩侧索硬化症。
[0041]优选地，所述铁紊乱包括与出生后发育过程中铁缺乏相关的神经性的、认知的、行为的或运动的缺陷。
[0042]优选地，所述铁紊乱是铁过载紊乱。
[0043]优选地，所述多亚基铁蛋白复合物是处于小于100%的铁结合能力。
[0044]优选地，所述多亚基铁蛋白复合物包含哺乳动物H-铁蛋白或其同源物。
[0045]优选地，所述铁紊乱选自地中海贫血和血色沉着病。
[0046]优选地，在血液输注中、鼻喷雾或通过在液体中消耗给予患者所述铁蛋白-铁复合物或去铁铁蛋白。
[0047]根据本发明的又一方面，提供了用于递送治疗有效量的铁至脑的方法，所述方法包括给予患者铁蛋白-铁复合物，借以将治疗有效量的铁转运通过血脑屏障并递送到脑。
[0048]优选地，所述铁蛋白-铁复合物进一步包含靶向部分。
[0049]优选地，所述靶向部分选自抗体、适配体、受体、配体及其结合片段。
[0050]优选地，所述靶向部分识别脑或血脑屏障特异性标记物。
[0051]在本发明的另一方面，提供了使用H-铁蛋白作为靶向部分的方法，所述方法包括将H-铁蛋白连接到脂质体，借以将脂质体靶向脑。
[0052]根据本发明的又一方面，提供了表达编码人H-铁蛋白的核酸序列的重组酵母，所述编码人H-铁蛋白的核酸序列整合到酵母染色体中。
[0053]优选地，所述编码人H-铁蛋白的核酸序列整合到酵母染色体中的TDH3位点。
[0054]在本发明的再一方面，提供了用于口服治疗患者中铁紊乱的组合物，所述组合物包含本发明的重组酵母。
[0055]在本发明的另一方面，提供了用于口服治疗患者中铁紊乱的组合物，所述组合物包含本发明的重组酵母。
[0056]优选地，所述患者选自倾向于发展一种或多种铁缺乏紊乱的患者、具有一种或多种铁缺乏紊乱但是不表现任何临床症状的受试者，或具有一种或多种铁缺乏紊乱并遭受一种或多种铁缺乏紊乱症状的受试者。
[0057]优选地，所述患者是哺乳动物，例如人、狗、猫、母牛、马、猪、啮齿类动物或灵长类动物。
[0058]优选地,所述患者是人。[0059]本发明提供了用于治疗患者中铁紊乱的方法，所述方法包括给予有需要的患者治疗有效量的铁蛋白-铁复合物。提供了可以用于这些方法的包含整合到酵母染色体的编码人H-铁蛋白的核酸序列的重组酵母和包含所述重组酵母的组合物。本发明还涉及用于递送治疗有效量的铁至脑的方法，所述方法包括给予患者铁蛋白-铁复合物，借以提供了将治疗有效量的铁转运通过血脑屏障并递送至脑。
[0060]本发明还提供了使用H-铁蛋白作为靶向部分的方法，所述方法包括将H-铁蛋白连接到脂质体，借以进一步提供了将脂质体靶向脑。
[0061]在本说明书中，以能够使要撰写的说明书清楚和简明的方式描述了实施方案，但是意在并将会领会的是，可以多方面地组合或分开实施方案而不背离本发明。
[0062]现将参照附图描述本发明的实施例。
[0063]附图的简要i兑明
[0064]图1A显示了在48小时的循环后，在器官中与马脾铁蛋白(以L-铁蛋白使脾铁蛋白丰富)对比的重组人H-铁蛋白(rH-铁蛋白)中59Fe的体内摄取。将所述59Fe标记的rH-铁蛋白或脾铁蛋白注射到成年大鼠尾静脉中并允许循环48小时。通过计算与注射的总量相比的每g组织的μ Ci的量，确定在1.0g的每种器官中放射性的量并确定百分比总量/g组织重量。以这种相同的比例显示两种脑结构以揭示相对量。p〈0.05*。呈现了来自3个动物的平均值土S.E.(标准误)。
[0065]图1B显示了在大鼠脑 中rH-铁蛋白中的59Fe的体内摄取。如在图1A的说明中所描述的，用59Fe标记的rH-铁蛋白或脾铁蛋白经尾静脉注射大鼠。通过确定在脑的一个半球中的μ Ci/注射的总μ CiX 100%来计算总百分比。ρ〈0.005#。呈现了来自3个动物的平均值土 S.E.。
[0066]图2Α显示了在H-铁蛋白缺乏的小鼠(_/+)和野生型(+/+)小鼠中rH-铁蛋白中的59Fe摄取进入全身器官。动物经腹腔内注射接受等量的rH-铁蛋白。所述铁蛋白循环48小时。摘除所示的器官(包括脑，见图2B)和基于0.1g的每种器官确定的总放射性百分比。p〈0.05木。
[0067]图2B显示了通过rH-铁蛋白递送的59Fe在H-铁蛋白缺乏的小鼠脑中(+/_)与野生型(+/+)小鼠脑中的摄取对比。这些数据来自用于产生图2A的数据的小鼠的脑。通过与注射的总μ Ci对比从脑中获得的59Fe的衰变数/分钟来确定脑中放射性的百分比。ρ〈0.05*。显示了三只动物的平均值，土S.E.。
[0068]图3Α显示了在H-铁蛋白缺乏的(_/+)和野生型(+/+)小鼠中经脾(L-丰富的)铁蛋白递送的59Fe全身器官中的摄取。小鼠用含有59Fe的脾铁蛋白腹腔内注射。48小时后，将小鼠处死并将器官摘除。图形显示了存在于每种组织中的每克组织中注射的总放射性百分比。呈现了来自三只动物的平均值，土S.E.。没有差异达到统计学的显著性。
[0069]图3Β显示了在H-铁蛋白缺乏的(+/_)脑中与野生型(+/+)小鼠脑中经脾铁蛋白递送的59Fe脑中的摄取。这些数据来自图3Α中使用的小鼠。报告的放射性的量是注射到动物中的总的百分比。结果呈现了来自三只动物的平均值，土S.E.。这些数据没有显示统计学的显著性。
[0070]图4Α是显示突光标记的rH-铁蛋白穿过在两室碳酸膜(transwell)培养皿中生长的牛视网膜血管内皮细胞(BREC)培养物单层的通量的图。显示了 4小时期间在基底室中FITC-标记的rH-铁蛋白的转运速率。按照实施例1中所描述的确定转运速率。数据表达为通量率的平均值，其通过来自底室荧光每单位量的顶室荧光(Bf/Tf)相对时间的平面图的斜率(cm/s )获得，和平均值的标准偏差。与右旋糖酐对照和脾铁蛋白相比rH-铁蛋白转运是统计学上显著的(ρ〈0.01)**。
[0071]在图4Β中，显示了在底室中通过荧光和特异性结合到H-铁蛋白抗体检测FITC标记的rH-铁蛋白。在底室中H-铁蛋白的存在证实了 H-铁蛋白胞转通过BREC细胞层。泳道:1)来自对照(未标记的铁蛋白)培养物的10 μ I浓缩的基底室培养基；2)来自FITC标记的rH-铁蛋白培养物的基底室培养基的10 μ I浓缩的蛋白质；3)分子量标记物；4)来自对照培养物的30 μ I浓缩的基底室培养基；5)来自FITC标记的rH-铁蛋白培养物的基底室培养基的30 μ I浓缩的蛋白质；6)未标记的rH-铁蛋白；7) FITC标记的rH-铁蛋白。
[0072]图5A是显示对于结合到BREC细胞匀浆的125I_rH_铁蛋白和1251-脾铁蛋白的饱和曲线的图。该图示出了结合到BREC细胞的H-铁蛋白是可饱和的然而没有脾铁蛋白结合到BREC细胞的证据。在4°C下进行饱和结合2小时。确定Kd为2.7±0.9nM和最大结合量(Bmax) 2.7±0.9nM 为 465.7±63.lfmol/mg 蛋白质。 [0073]图5B显示了 1251-rH_铁蛋白和1251-脾铁蛋白在从大鼠脑分离的微血管上的饱和度曲线。该曲线显示了 H-铁蛋白的可饱和结合，但是对于脾铁蛋白无结合。Kd为
7.9± 1.6nM 和 Bmax 为 572.6±64.0fmol/mg 蛋白质。
[0074]图6A是显示由未标记的rH-铁蛋白而不是由脾铁蛋白在BREC匀浆上对于125IiH-铁蛋白结合位点的竞争的图。该图显示了 125IiH-铁蛋白到BREC匀浆的结合被未标记的rH-铁蛋白，而不是被脾铁蛋白的增加的浓度竞争抑制。
[0075]图6B是显示在大鼠微血管上的竞争结合试验结果的图。该图示出了 1251-rH_铁蛋白的结合可以由未标记的rH-铁蛋白而不是由未标记的脾铁蛋白以浓度依赖的方式分离。
[0076]图7是显示在重组酵母中rH-铁蛋白表达的蛋白质印记(4-20%梯度)。在泳道I中为标准品(重组人H-铁蛋白)。泳道2和4是用人L-铁蛋白转化的两种不同的酵母菌落。泳道3和5是用人H-铁蛋白转化的两种不同的酵母菌落。用于这个研究的抗体是抗-HFHS-59(1:40，000，16 小时)，所述抗-HF HS-59 是通常由 Paolo Arosio (Brescia Italy)提供的H-铁蛋白小鼠单克隆。
[0077]图8是用于铁染色的蛋白质印记。首先用凝胶电泳分离蛋白质，并且用Perl试剂对凝胶染色，这是用于证明铁蛋白的铁含量的对铁的标准组织学染色。泳道I和2来自用L-铁蛋白转化的酵母菌落。由于L-铁蛋白不能负载铁，所以在这些泳道中未见到铁的反应产物。泳道3和4是来自表达在铁补充的培养基中(泳道3)和在标准铁培养基条件下(泳道4)生长的H-铁蛋白的酵母的蛋白质提取物。H-铁蛋白标准品用作对照(泳道5)。泳道6包含指示铁蛋白尺寸的分子量标记物。
[0078]图9显示了使用铁缺乏的标准大鼠模型获得的结果。铁缺乏(ID)膳食的动物具有最低水平的血红蛋白(Hb)。接受无铁酵母(无Fe酵母)的动物具有与ID动物类似的Hb水平。在其它3组中看到了 Hb水平的提高，提高中最快速的增加发生在接受铁补充的和用H-铁蛋白强化的酵母(酵母Fe+Ft)的动物中。
[0079]图10代表来自在图9中测试的动物组的血细胞比容水平。这些数据显示了酵母作为铁的载体在存在或缺乏H-铁蛋白下校正血细胞比容同样有效，并且两者都比标准的目前治疗选择FeSO4显著更好。持续ID膳食的动物和接受未被铁补充的酵母的动物在超过11天的调查中没有显示血细胞比容的增加。
[0080]图11显示了在图9和图10中测试的动物组中测量铁生物利用度的测试结果。这些数据显示铁蛋白强化的铁补充的酵母(酵母Fe+Ft)在转铁蛋白(Tf)饱和中提供了最大的增加，接着是无铁蛋白的铁补充的酵母(无Ft酵母)。酵母Fe+Ft对比除了无Ft的酵母之外的全部组P〈0.05。
[0081]图12显示了脑的两个发育上重要的区域:中脑腹侧(ventral midbrain)和尾部(caudate)的铁的状态。在Hb和Hct分析中(图9和图10)所描述的动物在14日龄时被处死，并测定了中脑腹侧(ventral midbrain, VMB)和尾部的铁的浓度。接受H-铁蛋白强化的和铁补充的酵母(酵母-Fe+Ft)的动物在两个脑区域中具有比任何其它组更多的铁。
[0082]图13代表脑的伏核(NA)和前额皮质(PFC)区域的铁水平。在该图中，由铁蛋白强化的铁补充的酵母(酵母-Fe+Ft)递送的铁的区域特异性明显。与其它方式的铁递送相t匕，在NA中(类似于图12中显示的VMB和尾部)铁含量升高。然而，在PFC中，由铁蛋白强化的铁丰富的酵母递送的铁类似于其它组中所发现的铁。
[0083]图14A显示了人H-铁蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)。
[0084]图14B显示了人H-铁蛋白的cDNA序列(SEQ ID N0:2)。起始密码子(ATG)和终止密码子(TAA)为粗体， 而BamHI (在序列的5’端)和XhoI (在序列的3’端)限制性位点为加下划线的。
[0085]图15显示了定位在绒毛上的免疫染色的H-铁蛋白受体的成年大鼠十二指肠的横截面(a和C)。细胞核用DAPI (b和c)染色。重叠图像显示在(C)中。
[0086]图16显示了在酵母TDH3转录启动子控制下用于表达H-铁蛋白的基因盒的结构。H-铁蛋白ORF-编码人H-铁蛋白的开放阅读框；CYClter-来自酵母CYCl基因的转录终止子；填充的矩形-1oxP位点；URA3 -可选择的标记物。
[0087]图17显示了证明染色体位点在转化的酵母中重组H-铁蛋白的表达上的整合效果的蛋白质印记。泳道1-在RLK3190中的H-铁蛋白；泳道2和4-在具有H-铁蛋白基因的其它染色体整合位点的酵母菌株中的H-铁蛋白；泳道3-在RLK3177中的H-铁蛋白，其含有多拷贝染色体外质粒；泳道5-无样品；泳道6-纯化的His-标记的rH-铁蛋白；泳道7-分子量标记物。
[0088]图18表示显示由铁蛋白强化的铁补充的酵母递送的铁的优越的生物利用度的数据。用来自图9-11代表的试验的第14天的数据制图以显示消耗的每mg铁的变化。A.血红蛋白回收率；B.血细胞比容回收率；C.转铁蛋白饱和度；D.不同膳食的转铁蛋白饱和度百分比的对比，p〈0.05**。
[0089]发明的详细描述
[0090]本发明涉及重组酵母的新的菌株，包含所述酵母的组合物，以及用于治疗铁缺乏紊乱的方法和组合物。
[0091]在本说明书中，以能够使要撰写的说明书清楚和简明的方式描述了实施方案，但是意在并将会领会的是，可以多方面地组合或分开实施方案而不背离本发明。
[0092]描述了用于治疗铁缺乏症和其它铁紊乱的优越的方法，所述方法增加铁的生物利用度和恢复正常铁水平比目前护理的标准FeSO4更快且更有效。[0093]在本发明的一个实施方案中，提出了一种新的用于缓解铁缺乏的膳食方法。该方法源于我们发现了在内脏和脑中H-铁蛋白的受体，以及我们证明了相对于富含L-铁蛋白，H-铁蛋白是铁摄取的优选的方式。H-铁蛋白的基因序列和蛋白质结构在动物界是高度保守的。因此，H-铁蛋白作为铁递送蛋白质的应用不仅限于人。
[0094]如本文所使用的，“铁紊乱”包括与铁缺乏、铁摄取和/或铁代谢相关的紊乱或疾病。铁缺乏紊乱的实例包括但不限于缺铁性贫血，例如由膳食摄取铁或铁吸收不足引起的缺铁性贫血。缺铁性贫血可能与例如营养不良、妊娠(包括产后期)、严重子宫出血、慢性疾病(包括慢性肾病)、癌症、肾透析、胃旁路手术并发症、不安腿综合征(RLS，Ekbom’ s病)、多发性硬化症、糖尿病(例如I型糖尿病和II型糖尿病)、胰岛素抵抗和注意力缺失症有关。铁摄取和铁代谢相关的紊乱包括但不限于，铁过载、亨廷顿(Huntington’s)舞蹈病、神经退行性障碍伴随脑铁积聚(NBIA)、阿尔茨海默病、帕金森病、髓鞘形成减少(hypomyelination)和多发性硬化症。 [0095]在本发明的一个实施方案中，铁缺乏紊乱与脑中铁水平不足有关，例如其发生在各种神经和神经退行性障碍，包括帕金森病、阿尔茨海默病、RLS、与女性贫血有关的认知能力不佳(suboptimal cognitive performance)、抑郁和失眠中。在另一个实施方案中，铁缺乏紊乱包括在出生后的发育期间与脑铁缺乏有关的神经功能缺失，包括髓鞘形成减少以及由发育性铁缺乏引发的脑发育缓慢，导致认知能力差和运动损伤，以及注意力不足过动症(ADHD)0
[0096]在脑中缺铁以及多巴胺合成减少都是铁缺乏紊乱，例如，如RLS和在儿童中发育性铁缺乏的重量因素。多巴胺是脑中合成的神经递质，其对于正常的中枢神经系统(CNS)的功能而言是必不可少的。在合成多巴胺中，铁是酶即酪氨酸羟化酶的辅助因子，这是多巴胺代谢中的限速步骤(Cooper等人.(1991)The Biochemical Basis ofNeuropharmacology, Oxford University Press, New York, N.Y.)。多巴胺能系统中的铁看来是RLS病理以及儿童行为缺陷，包括ADHD中的重要组分。尽管RLS患者和对照的血清中的铁蛋白和转铁蛋白的血清水平正常，但是RLS患者的脑脊液(CSF)铁蛋白小于65%和CSF转铁蛋白(血铁转运蛋白)多于3倍。铁的浓度在整个脑中随着多巴胺的合成位置变化；RLS患者的黑质中和脑壳区域中的铁较少。通常，血清中铁蛋白水平降低的程度指示着RLS症状的严重度。还有报道称患有ADHD的儿童的血清铁蛋白水平减少。
[0097]术语“铁蛋白-铁复合物”是指蛋白质复合物，其包含多个铁蛋白亚基和铁原子。适合的铁蛋白-铁复合物包含哺乳动物的H-铁蛋白和L-铁蛋白亚基。来自各种哺乳类动物的H-铁蛋白亚基的氨基酸序列已经被鉴别(参见,例如,Orino Koichi等人，VeterinaryBiochem.42:7-11(2005);登录号:06A006486)。在一个实施方案中，H-铁蛋白为人H-铁蛋白(SEQ ID NO:1 ;参见图HAXH-铁蛋白还可以为天然形成的或合成的人H-铁蛋白的同源物或变体。在某些实施方案中，H-铁蛋白的同源物与人H-铁蛋白具有约80%至约100%的序列同源性，例如与人H-铁蛋白具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同源性。H-铁蛋白同源物保持着与铁结合的能力并且形成多亚基铁蛋白-铁复合物，但可以突变以提供变化的铁与铁蛋白之间的结合和解离强度。铁蛋白-铁复合物包含H-铁蛋白亚基，但还可以包含一些L-铁蛋白亚基。在某些实施方案中，复合物的铁蛋白亚基组分包含相对于L-铁蛋白至少20%的H-铁蛋白，例如相对于L-铁蛋白约20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或者100%的H-铁蛋白。在一个实施方案中，铁蛋白-铁复合物中的全部铁蛋白亚基(即，100%的铁蛋白亚基)为H-铁蛋白。H-铁蛋白可以是重组的H-铁蛋白。例如，在一个实施方案中，H-铁蛋白可以为人H-铁蛋白或其同源物，所述人H-铁蛋白或其同源物产生于酵母菌株中，该酵母菌株包含在适当的酵母启动子控制下编码H-铁蛋白的多核苷酸序列。产生于酵母的H-铁蛋白可以使用蛋白质纯化的标准方法纯化用于治疗用途。
[0098]铁蛋白-铁复合物中的铁可以为铁分子，或可以为含铁的复合物形式。“含铁的复合物”或“铁复合物”为含有(II)或(III)价氧化态铁的化合物，其与有机化合物复合。铁复合物包括铁-聚合物复合物、铁-碳水化合物复合物以及铁-氨基聚糖(aminoglycosan)复合物。这些复合物是可商购获得的和/或可以通过本领域已知的方法合成。
[0099]铁-碳水化合物复合物的实例包括铁-糖复合物、铁-寡糖复合物以及铁-多糖复合物，例如铁-羧基麦芽糖、铁-蔗糖、铁-聚异麦芽糖(铁-右旋糖酐)、铁-多麦芽糖(铁-糊精)、铁-葡糖酸盐、铁-山梨醇(sorbital)和铁-氢化右旋糖酐);它们可以进一步与其它化合物，例如山梨醇(sorb i to I)、柠檬酸和葡糖酸复合(例如铁-糊精-山梨醇-柠檬酸复合物和铁-蔗糖-葡糖酸复合物);以及它们的混合物。
[0100]铁-氨基聚糖复合物的实例包括铁-硫酸软骨素，铁-硫酸皮肤素，铁-硫酸角质素；它们可以进一步与其它化合物复合；以及它们的混合物。铁-聚合物复合物的实例包括铁-透明质酸复合物，铁-蛋白质复合物及其混合物。
[0101]如本文所使用的“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”,是指病症的完全消除以及任何临床的或可定量测定 的减轻，该病症为患者或受试者正在被治疗的病症。“治疗”是意在防止紊乱的病理或症状发展或改变紊乱的病理或症状而进行的干预。相应地，“治疗”既指治疗性治疗也指预防或防范性措施。“治疗”还可以具体指姑息护理。需要治疗的对象包括已经患有一种或多种铁缺乏紊乱以及要预防这些紊乱的对象。
[0102]在治疗有需要的患者的过程中，根据本发明向其给予治疗有效量的本发明的铁蛋白-铁组合物。如本文所使用的，术语“治疗有效量”是指示用于治疗的组合物的量，而该量不得超过可能造成明显不良作用的量。评价治疗性治疗的有效性的方法为本领域技术人员已知。
[0103]“有需要的患者”或“患者”是指可以从本发明的治疗方法中获益的任何患者或受试者。在某些实施方案中，有需要的患者为倾向于向一种或多种铁缺乏紊乱发展的患者，或患有一种或多种铁缺乏紊乱但未显现任何临床症状的受试者，或患有一种或多种铁缺乏紊乱且正经受一种或多种铁缺乏紊乱症状的受试者。有需要的患者可以为哺乳动物，例如人、狗、猫、母牛、马、猪、啮齿类动物或灵长类动物。在一个实施方案中，所述患者为人。在某些实施方案中，本发明的方法被用于实验动物、兽医和畜牧应用和/或用于疾病的动物模型的培育中。
[0104]可根据治疗的周期、给药频率、宿主和紊乱的本质和严重度来变化要给药的剂量。本领域技术人员不需要过度实验就可以确定剂量。以足以确保将充足剂量单位的铁蛋白-铁复合物释放至患者中的剂量浓度来给予本发明的组合物，以提供对铁缺乏紊乱的希望的治疗。根据身体和生理因素，例如患者的年龄、体重、病症的严重度和/或临床病史来确定给药的实际剂量。可以给予活性成分以实现约50 μ M至约1000 μ M的铁蛋白-铁复合物的体内血浆浓度。例如，本发明的方法可以利用组合物来提供每天每kg体重约0.1至约
I,OOOmg或约I至约IOOmg的铁蛋白-铁复合物，例如每天每kg体重约30mg的铁蛋白-铁复合物。然而，应理解的是，偏离提供的范围的剂量水平也可以适用于给定紊乱的治疗。
[0105]本发明的铁蛋白-铁复合物可以为适合给药的任何形式。这样的给药形式包括片剂，缓冲片剂，丸剂，胶囊，肠溶包衣胶囊，糖衣丸，糯米纸囊剂(cachet),粉剂,颗粒剂,气雾剂，脂质体，栓剂，乳膏，洗剂，油膏，皮肤贴剂，非肠道剂，锭剂，口服液，例如悬浮剂、溶液和乳剂(水包油或油包水)，滴眼液和注射液或它们的缓释剂型，和气雾剂。希望的剂量可以通过连续输注，或通过缓释制剂全天以规定的间隔、以几次增量的方式提供，或可以以大药丸剂、药糖剂或糊剂提供。
[0106]在一个实施方案中，通过与一种或多种药学上可接受的载体混合来制备包含铁蛋白-铁复合物的药物或营养食品组合物或制剂。在一些情况下，铁蛋白-铁复合物可以以包含铁蛋白-铁复合物和缓冲液的组合物来递送，铁分子和铁蛋白分子溶解在该缓冲液中以使铁-铁蛋白相结合(即形成铁蛋白-铁复合物)。然而，如果需要的话，可以加入其它产品从而将铁的递送、储存最大化，或者将具体的递送方法最优化。此外，本发明包括包含如本文所述的铁蛋白-铁复合物与适用于治疗铁缺乏紊乱的其它药剂相组合的组合型组合物的用途。 [0107]本发明所使用的，“药学上可接受的”意思是对于药学和兽医领域的使用是可接受的，与制剂的其它成分相容且无毒，或与合理的利益/风险比相称。“药学上可接受的载体”或“稀释剂”包括任意且全部的溶剂、分散介质、涂覆层、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等等，它们与包含铁蛋白-铁复合物的组合物的药学给药相容。这样的载体或稀释剂的实例包括但不限于，水、盐水、Finger’s溶液和右旋糖溶液。如由医学专业人员所确定的，药学组合物的体积是基于希望的给药模式和个体患者的安全体积。
[0108]载体的选择还取决于希望的给药模式。本发明的组合物可以通过任何多种便利的方式来给药，包括但不限于全身给药(例如，静脉注射、胃肠外注射、吸入、透皮递送、口服递送、经鼻递送、直肠递送)和/或局部给药(例如，直接注射至目标组织中，通过插管递送至组织中，通过植入随时间释放的材料来递送至目标组织中)、通过泵等、口服、胃肠外、骨内、进入脑脊髓流体等递送进组织中。进一步的给药模式包括口腔、舌下、阴道、皮下、肌肉内或真皮内给药。
[0109]在一个实施方案中，利用适于与铁蛋白-铁复合物组合的用于口服吸收的物质来制备要口服给药的组合物。这样的物质包括但不限于，糖，例如乳糖(含水的且流动快)、葡萄糖和蔗糖；淀粉，例如玉米粉和土豆粉；纤维素及其衍生物，包括微晶纤维素、羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素；粉末化的黄蓍胶(tragancanth);胶体二氧化硅；交联羧甲基纤维素钠；麦芽；明胶；滑石；硬脂酸；硬脂酸镁；硫酸钙，植物油，例如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油和玉米油；多元醇，如丙二醇、甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；琼脂；海藻酸；抗酸剂，例如氢氧化铝或氢氧化镁；缓冲剂，例如柠檬酸钠、乙酸盐或碳酸氢盐；水；等渗盐水和磷酸缓冲溶液。也可以存在润湿剂；润滑剂，例如十二烷基硫酸钠；稳定剂；压片剂；抗氧化剂；防腐剂；着色剂和风味剂。
[0110]适用于胃肠外给药的组合物或制剂包括，但不限于，含水和不含水的等渗无菌注射溶液，其可以含有抗氧化剂，缓冲液，抑菌剂或使得制剂与血液等渗的溶质；以及可以包括悬浮剂和增稠剂的含水和不含水的无菌悬浮液。组合物可以存在于单位剂量或者多剂量的密封容器中，例如安瓿和管，并且可以在恰好使用前仅需加入无菌液体载体，例如注射用水的冷冻干燥(冻干的)条件下储存。即用注射溶液和悬浮液可以由无菌粉剂、颗粒或片剂等来制备。
[0111]适用于静脉给药的组合物或制剂包括载体，例如生理盐水、抑菌水、CREM0PH0REL?(BASF;Parsippany, N.J.)或者磷酸缓冲盐水(PBS)。组合物必须是无菌的且应当是流体，以利于用注射器来给药。这样的组合物在制备和储存期间应当是稳定的且必须在防止微生物，例如细菌和真菌污染的条件下储存。载体可以是分散介质，该分散介质含有，例如水、多羟基化合物(例如甘油、丙二醇和液态聚乙二醇)以及其它相容的适合的混合物。各种抗菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸以及硫柳汞可以抑制微生物污染。等渗剂，例如糖；多元醇，例如甘露醇、山梨醇以及氯化钠可以包含在组合物中。可以延缓吸收的组合物包括例如单硬脂酸铝和明胶的试剂。制备用来制备无菌注射溶液的无菌固体的方法包括真空干燥和冷冻干燥，用来产生包含铁蛋白-铁复合物以及任何其它希望的成分的固体。
[0112]全身给药可以是例如跨粘膜的或透皮的。对于跨粘膜给药或透皮给药而言，选择可以渗透目标屏障的渗透剂。跨粘膜的渗透剂包括清洁剂、胆盐和夫西地酸衍生物。鼻腔喷雾剂或栓剂可以用于跨粘膜给药。对于透皮给药而言，将活性化合物制成油膏、软膏、凝胶或乳膏。
[0113]包含铁蛋白-铁复合物的组合物可以用防止复合物从体内迅速消除的载体，例如控制释放的制剂，包括植入体和微胶囊化的递送系统来制备。可以使用生物可降解的聚合物或生物可相容的聚合物，例 如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚羟基乙酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。这样的材料可以从来源包括，但不限于，ALZA Corporation (Mountain View, CA)和NOVAPharmaceuticals, Inc.(Lake Elsinore, CA)商购获得,或者由本领域技术人员制备。
[0114]在适合的液态载体，例如缓冲盐水或生理盐水、脂质体或碱性氨基酸中制备用于眼部给药的组合物。可以采用适当的基质，例如甘油三酸酯基质、脂质体或碱性氨基酸制备乳膏、洗剂和油膏，用于局部应用。这样的乳膏、洗剂和油膏还可以含有表面活性剂。
[0115]在本发明的一个实施方案中，以来自染色体整合的H-铁蛋白表达盒的表达H-铁蛋白的重组酵母菌株的形式来给予铁蛋白-铁复合物。适于铁营养补充的重组酵母菌株可以将铁以对于哺乳动物，包括人来讲高生物活性的形式来储存。酵母菌株包括满足用于人消耗的Generally Regarded As Safe (GRAS)要求的那些。这些可以包括,例如,酵母属(Saccharomyces)和毕赤酵母属(Pichia),以及其他可以用于方法中以产生治疗化合物的酵母。在该实施方案中，铁-储存基因(例如H-铁蛋白编码序列)置于铁-储存表达盒中适当的酵母启动子控制下，以产生足够高水平的铁-储存蛋白质用于酵母充当适当的铁补充载体。在实施例2中描述了特定重组酵母菌株的构建物，所述构建物组成型表达rH-铁蛋白并比用标准膳食补充剂的FeSO4或脾铁蛋白提供显著更高水平的生物相容性铁。
[0116]适合的酵母启动子为本领域所已知，并且包括诱导高水平组成型表达的启动子和其表达可以被环境条件调节的启动子。此外，可以进一步调控酵母的基因组成以实现大量潜在的有益结果。例如，可以调控蛋白质水解来提高铁-储存蛋白质或铁运送机制的稳定性，包括但不限于细胞表面的那些、液泡或线粒体，可以调控以达到合适的效果如在特定的细胞区室中改变铁的浓度。此外，可以以其它方式改变酵母来控制铁-储存蛋白质或细胞区室中铁的水平。可以通过向有酵母生长的培养基中加入已知量的铁化合物来调节酵母的铁含量。利用重组酵母、人或其它动物的铁补充可以通过任何的许多种方式来完成，包括但不限于，消耗作为营养补充物的重组酵母或消耗从重组酵母中提纯或分离的铁蛋白-铁复合物。可以出于补铁的目的特异性培养酵母，或者它们可以是另一过程的副产物(例如，发酵)。
[0117]供选择地或此外，铁蛋白-铁复合物可以包含本领域已知的其它表达体系，包括大肠杆菌、杆状病毒和转基因植物和动物中生成的rH-铁蛋白。在一个实施方案中，可以通过在适当的缓冲液中培养铁蛋白亚基和铁分子来形成铁蛋白-铁复合物，随后将任何未结合的铁分子与得到的铁蛋白-铁复合物分离。
[0118]在某些实施方案中，铁蛋白-铁复合物还包含靶向部分，例如抗体、适配子、受体、配体或它们的结合片段。靶向部分可以识别一种或多种细胞、组织和/或器官特异性标记物，因此调节或改进向体内希望的靶点或位置的递送。在一个实施方案中，铁蛋白-铁复合物可以包含融合蛋白，所述融合蛋白含有与靶向肽融合的铁蛋白亚基，例如H-铁蛋白。在另一个实施方案中，可以将铁蛋白-铁复合物包封在脂质体、脂质体构建物或其它膜结合的囊泡，例如红细胞影中来进行递送或给予。脂质体、脂质体构建物或其它囊泡可以包含靶向部分，例如被引入到脂质体或囊泡中的对于特定的细胞表面蛋白质或受体(见上)具有特异性的抗体或配体。靶向部分可以将铁蛋白-铁复合物或含有铁蛋白-铁复合物的囊泡定向至脑和/或血脑屏障。适合的靶向部分的实例包括转铁蛋白、白细胞介素_13(用于向星形细胞瘤递送)和脂多糖(LPS)。
[0119]在本发明的另一个实施方案中，H-铁蛋白自身可以被用于定向至其它部分。例如，H-铁蛋白可以结合至生物活性剂从而将该药剂递送至脑。在一个实施方案中，H-铁蛋白肽与另一种生物活性肽融合。供选择地或此外，H-铁蛋白可以被接合至脂质体或其它囊泡，以向脑递送囊泡和囊泡内容物。在又一个实施方案中，H-铁蛋白可以结合至诸如对比增强化合物的药剂来增强脑的视觉化(例如，白质束(white matter tracts)和其中的缺陷)。类似于生物活性剂，对比增强化合物可以结合H-铁蛋白蛋白质或在H-铁蛋白蛋白质中或被包封在脂质体或其它囊泡中，它们通过充当受体配体的接合脂质体的H-铁蛋白来定向至脑中的H-铁蛋白受体。
[0120]在本发明的另一个实施方案中，H-铁蛋白，例如以本发明的重组酵母或组合物的形式，可以被用于治疗与铁过量或铁过载有关的紊乱。铁过载，临床上被称为是血色素沉着症，其与例如癌症、心力衰竭、肝功能损伤和糖尿病的风险增大有关。脑中的铁过载可以造成许多种神经退行性障碍，例如帕金森病、阿尔茨海默病、肌萎缩性侧索硬化症、Hallervorden-spatz病和亨廷顿氏(Huntington，s)症以及黄斑变性。由于H-铁蛋白显著的结合铁的能力，H-铁蛋白和/或含有H-铁蛋白的多亚基复合物可以被用作铁螯合剂。“多亚基铁蛋白复合物”的意思是包含多个铁蛋白亚基和任选的铁的蛋白质复合物。H-铁蛋白为如上所述的哺乳动物铁蛋白或其同源物或变体。多亚基铁蛋白复合物可以在相对不含铁的环境中制备，使得得到的复合物具有小于100%的其总的铁结合能力。在某些实施方案中，复合物具有50%或更小的铁结合能力，例如大约50%、40%、30%、20%、10%,5%或1%的铁结合能力。在一个实施方案中，复合物可以有大约0%的铁结合能力(即脱铁铁蛋白(不含铁的铁蛋白)具有100%的铁结合能力或保持着接近100%的铁结合能力)。H-铁蛋白可以被改性来减小其会被任何内生受体识别的可能性或来增加其通过身体的排泄。这样的改性在本领域从业人员的专业范围内是有益的，并且这些改性不会影响蛋白质结合铁的能力。适合用作铁螯合剂的多亚基铁蛋白复合物包含H-铁蛋白亚基，但还可以包含一些L-铁蛋白亚基。在某些实施方案中，相比于L-铁蛋白，多亚基铁蛋白复合物包含至少20%的H-铁蛋白，例如相比于L-铁蛋白大约20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%的H-铁蛋白。
[0121]递送用作铁螯合剂的多亚基铁蛋白复合物可以包括与如上所述的用于递送铁蛋白-铁复合物来治疗铁缺乏紊乱相同范围的递送机制(例如消耗生成铁蛋白的酵母，给予纯化的铁蛋白蛋白质、靶向部分和/或脂质体或其它囊泡)。可以将多亚基铁蛋白复合物递送至胃肠道、或沿着胃肠道的细胞中、或血流中。利用该方法可以消除铁以不经调节的方式不合适地进入脑或其它器官，反之则不可以。此外，来自血液和全身器官的螯合铁可以促进铁在体内的再分布，包括铁从脑中释放。在一些情况下，低于100%的总铁结合能力的脱铁铁蛋白或铁蛋白复合物可以被直接递送进脑脊液、脑或血流中。 [0122]铁蛋白不仅仅具有结合铁的能力，而且还具有结合许多对身体有毒的金属的能力。因此，本发明的另一个实施方案涉及利用脱铁铁蛋白(或其它具有低于100%的总铁结合能力的多亚基铁蛋白复合物)来大体地减少并且消除来自胃肠系统、血液、脑和身体的潜在的有毒金属。
[0123]在输血中，在输注过程中至少15%的细胞将溶解，释放具有潜在危害的游离铁。对需要红细胞(RBCs)并且因此是贫血的患者进行输血。本发明涉及用于将脱铁铁蛋白(或者其它具有低于100%的总铁结合能力的多亚基铁蛋白复合物)与输血混合的方法。这不仅仅提供用于由于细胞溶解而释放的铁的螯合剂，而且能够使得铁以更符合生理条件或生物可利用的形式用于身体来治疗贫血。
[0124]需要频繁输血的一类患者群体是患有地中海贫血(thalessima)的患者。该群体最终由于过量的铁蓄积而遭受肝损害的痛苦。H-铁蛋白和/或含有H-铁蛋白的多亚基铁蛋白复合物可以帮助铁更有效地分布在体内，因此限制其在肝中过量的蓄积。另一类经常接受输血的群体是新生儿，特别是早产儿。与输血一起提供H-铁蛋白、含有H-铁蛋白的多亚基铁蛋白复合物、和/或铁蛋白-铁复合物将改善通常铁的分布以及铁向脑的分布。
[0125]包括H-铁蛋白亚基的铁蛋白亚基可以在患者体内表达。在该实施方案中，铁蛋白-铁复合物可以在体内形成。大量的质粒载体和转染试剂系统可用于离体转染细胞，以产生稳定的转化子或者暂时转染的细胞用于再输注到宿主动物或患者中。适合的表达质粒如转染试剂一样是可商购获得的，其中后者中的许多为一类或另一类阳离子脂质体。对于体内以及离体基因转移而言，例如基因疗法，适合的载体是本领域已知的，并且包括逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关的病毒载体、慢病毒载体和电穿孔系统。
[0126]在考虑以下说明性实施例的基础上理解本发明的其它方面和优点。实施例不意在以任何方式来限制本发明的范围。本领域技术人员考虑本发明公开的内容，应当理解在公开的具体实施方案中可以作出变化并且仍然获得相像或相似的结果，而不脱离本发明的精神和范围。
[0127]本申请所引用的全部参考文献、出版物和专利文献均被引入本文作为参考。实施例
[0128]实施例1铁蛋白摄取和转运
[0129]通
[0130]铁蛋白制各
[0131]在本实施例中的所有试验使用重组人H-铁蛋白或马脾铁蛋白。通过用重组人H-铁蛋白质粒转化化学感受态的Br21细胞来制备重组人H-铁蛋白。在细胞生长后，用镍蛋白质滤柱纯化蛋白质至最终浓度为2.8mg/ml。马脾铁蛋白是商购获得(Sigma),并且是经过挑选的，因为它含有的L铁蛋白亚基与H铁蛋白亚基为约90:10。
[0132]细胞培养物和单层内皮细胞的制备
[0133]我们使用牛视网膜内皮细胞(BREC)作为血脑屏障(BBB)的体外模型来测试铁蛋白可以被转运通过内皮细胞层的假设并开始提出铁蛋白转运通过BBB的机制。该充分研究的模型已显示具有血液-神经屏障的全部必要的特征和属性(AntonettiD.A.,等人J.Neurochem.80:667-677, 2002)。从当地屠宰场获得牛眼睛并根据先前公开的步骤(Gardiner T.A.,等人Lab Invest.72:439-444，1995)分离和加工牛视网膜内皮细胞(BREC)。在补充 10%FBS、10ng/ml EGF,0.2mg/ml 1END0 GR0?(VECTechnologies, Inc., Rensselaer, N.Y., USA)、0.09mg/ml 肝素、抗菌的 / 抗真菌的溶液(Gibco, Rockville, Md., USA)和泰乐菌素抗生素(Sigma)的 MCDB-131 培养基(Sigma, St.Louis, M0.，USA)中使BREC生长。 首先在烧瓶中培养细胞直到它们达到至少80%的融合。
随后，使BRECS进行轻微的胰蛋白酶处理并在COSTARlt TRANSWELL70.4ym多孔过滤器
(Coming, Acton Mass.)上生长至融合。以I μ g/cm2的浓度加入纤连蛋白以促进粘附到过滤器。然后清洗细胞并移入补充IOOnm氢化可的松的无血清的无EGF的MCDB-131培养基培养72小时。向这些细胞培养物中加入氢化可的松促进紧密连接的形成。
[0134]在BBB模型中铁蛋白的转运
[0135]购买预纯化的转铁蛋白并重悬浮至最终浓度为2.5mg/ml。约250 μ g的重组人H-铁蛋白、马脾铁蛋白(Sigma)和转铁蛋白用异硫氰酸荧光素(FITC) (PierceBiotechnology)在pH9.0的IOOmM碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液中标记。通过穿过
5-ml G-25脱盐柱实现过量的或水解的FITC的去除。在CENTR丨PREP'浓缩器
(Amicon, Inc.，10，000MWC0)中浓缩FITC-结合的H-铁蛋白、脾铁蛋白和转铁蛋白并用PBS交换缓冲液。转铁蛋白作为阳性转运对照包括在BREC模型中(Burdo J.R.,等人Neurosciencel21:883-890, 2003)。
[0136]如先前在Burdo等人，2003中所描述的并用公式:(Bf/Tj)*(Vb/A) =(通量)*t进行一些修改来确定穿过融合的BREC单层的通量率。简要地，在加入140 μ g的FITC-标记的rH-铁蛋白、脾铁蛋白或转铁蛋白至顶室(顶端的)之前，在碳酸脂膜装置中使BREC生长至融合。通过在向顶端室加入示踪物后，从在不同时间(15、30、45、60、120、180和240分钟)收集的底室的(基底的)100 μ I等分试样取样来确定示踪物的转运。然后在分光荧光计(SPECTRAMAXK'_ GEMINI, Molecular Devices)中对来自基底室的等分试样进行突
光分析。获得的通量率为每单位量的顶室荧光(Bf/Tf)的底室荧光相对时间(t)作图的斜率(cm/s)。这里，Bf表示转运通过单层的示踪物的量，其相对于底室的体积(Vb)以及用于转运的表面积(A)进行归一化。顶室中的Tf的浓度在进行试验的4小时过程中没有显著改变，因此，对于计算通量被认为是恒量。在转运试验结束时(4h)从ΙΟΟμ I等分试样获得顶室中荧光的量。
[0137]作为细胞旁(paracellular)通量的对照，同时向顶端室加入RITC右旋糖酐(70kDa)作为对照。右旋糖酐没有以可评估的水平被内皮细胞吸收(Raub T.J.，等人J.CellPhysiol.149:141-151，1991)。因此，右旋糖酐在基底室中的积聚将是由于细胞旁转运。没有条件会影响右旋糖酐的通量率，所述右旋糖酐的通量率在各种条件下是最小的。
[0138]化学发光系统也用于在基底室中免疫检测FITC标记的rH-铁蛋白。收集基底培养基并使用Centripr印浓缩器从1.5ml浓缩至100 μ I。使浓缩的培养基接受SDS-PAGE并将明胶在462nm的荧光下成像。随后将蛋白质转移至薄膜上并用针对rH-铁蛋白的抗体进行免疫印迹分析。如图4B所示,这些试验证实了 FITC与rH-铁蛋白相关。
[0139]转运机制的确定 [0140]为了确定胞饮作用是否显著地有助于铁蛋白的转运，在加入铁蛋白和右旋糖酐前，向碳酸脂膜装置的顶端室加入菲律宾菌素50 μ g/ml，保持30分钟。已显示菲律宾菌素的添加抑制通过胞饮作用的非特异性转运的作用(Stremmel W，等人Lipids36:981-989，2001)。为了确定H-铁蛋白的摄取是否通过网格蛋白依赖的内吞作用发生，在钾缺乏的培养基中进行研究(IOOmM NaCl/50mM HEPES)。在加入铁蛋白之前在钾缺乏的培养基中孵育细胞10分钟。细胞内钾的缺失抑制通过网格蛋白包覆的凹点发生的受体介导的内吞过程。这些后面的试验仅可以在钾缺失改变细胞至细胞的连接的完整性之前进行I小时，所述细胞至细胞的连接的完整性由在右旋糖酐转运中的增加所指示。每个处理条件(或标准)进行最小的6次。贯穿试验，视觉评估培养物以确保试验处理和操作不影响细胞生存力。如在基线试验中，包括RITC右旋糖酐作为紧密连接的完整性的指示剂。使用单向方差分析来分析在不同的条件下FITC rH-铁蛋白的平均值之间的差异。对于那些具有显著不同平均值的测量值，进行Bonfeironi事后比较来分析成对的差异。显著性水平设定为P〈0.05。
[0141]结合实验
[0142]使用1251-重组人H-铁蛋白或马脾铁蛋白在第四代BREC细胞中进行在BREC细胞匀浆上的结合实验，每个实验进行两次。两者的比活度为约340，000Cpm/pmol。为了确立总的特异性和非特异性结合，向IOOyg BREC细胞匀浆的总蛋白中加入一系列浓度的1251-H-铁蛋白伴随加入或不加入1000倍摩尔过量的未标记的rH-铁蛋白。结合缓冲液由50mM Tris-HCl (pH7.4),0.1%BSA组成。在22°C进行孵育2h。通过加入3ml的冰冷的50mMTris-HCl终止结合。使用细胞收集器，通过在Whatman玻璃纤维C过滤器上快速过滤和洗漆来分离结合放射性，所述Whatman玻璃纤维C过滤器之前用5%脱脂奶粉和0.lmg/ml马脾铁蛋白包覆。
[0143]进行平衡竞争结合试验，其中增加浓度的未标记的H-铁蛋白与25 μ g的BREC匀浆蛋白质一起在与前述相同的结合缓冲液中用0.4nM1251-rH-铁蛋白在22°C孵育120分钟。如前所述，进行结合的终止、细胞膜的分离以及特异性结合的计算。
[0144]大鼠脑的微血管
[0145]六只成年雄性大鼠用于各微血管制品。用致死剂量的戊巴比妥钠(100mg/kg体重)麻醉大鼠然后去头。摘除脑并置于冰上的Petri盘中。摘除小脑和脑膜并加入5体积的微血管缓冲溶液(lx MVB, Ix盐，Ix HEPES, 0.5%BSA和5mM葡萄糖)与蛋白酶抑制剂。使用玻璃-聚四氟乙烯匀浆器(0.25mm清除率)以20次击打轻轻匀浆脑并且匀浆在4°C以1000x g离心10分钟。弃去上清液并将沉淀重悬浮在5体积的17%的右旋糖酐中(I:1比例的IX盐和1XHEPES与右旋糖酐)，接着涡旋，然后以3000x g在4°C下离心。从管壁收集微血管并在20ml的Ix MVB缓冲液中重悬浮。通过120 μ m网孔过滤微血管。然后通过附着到40 μ m网孔支撑的玻璃珠(Sigma)进一步纯化微血管制品。小珠用加入了蛋白酶抑制剂的缓冲液清洗。在5ml的MVB中冲洗小珠，然后通过在4°C下以1000x g离心15分钟使微血管沉淀。将微血管重新悬浮在Iml的HES+(IOmM HEPES, ImM EDTA, 250mM蔗糖，pH7.4和蛋白酶抑制剂混合物)中并确定总蛋白浓度。在_80°C储存样品直至使用。
[0146]在微血管上的铁蛋白结合
[0147]结合悬浮液由50mM Tris-HCl (pH7.4)、0.1%BSA和20 μ g的膜蛋白制剂组成，该膜蛋白制剂加入或不加入最终体积为250 μ I的I μ M未标记的rH-铁蛋白。通过加入3ml冰冷的50mM Tris-HCl终止结合。通过在Whatman玻璃纤维C过滤器上快速过滤来分离结合放射性，所述Whatman玻璃纤维C过滤器之前在5%脱脂奶粉(Blotto)和0.lmg/ml马脾铁蛋白的溶液中包覆。以经验确定该结合以将放射性标记的蛋白与过滤器的非特异性结合减少至加入总数的1_3%。用含有200mM NaCl的3ml冰冷的50mM Tris洗涤过滤器5次。在MICR0MEDIC4/200加自动伽玛计数器中对过滤器计数。通过从存在的无过量未标记的rH-铁蛋白的结合(总结合)中减去在过量的未标记的rH-铁蛋白的存在下的结合(非特异性结合)计算特异性结合。
[0148]饱和度分析
[0149]各个结合实验都进行两遍。将增加浓度的125I_rH-铁蛋白加入到结合悬浮液，该结合悬浮液由与之前描述相同的结合缓冲液和20 μ g膜蛋白质制品组成，该膜蛋白质制品加入或不加入最终体积为250 μ I的I μ m未标记的H-铁蛋白。在22°C下孵育120分钟之后，终止结合，并且如之前所述计算总的结合、非特异性结合和特异性结合。
[0150]竞每试齡
[0151]在与之前描述相同的结合缓冲液中在0.4nM1251-rH_铁蛋白存在的情况下，将增加浓度的未标记的竞争剂(rH-铁蛋白和脾铁蛋白)与100 μ g膜蛋白一起在22°C下培养60分钟。结合、终止结合、膜分离和特异性结合的计算均如上所述进行。将竞争试验进行两遍。
[0152]体内摄取研究
[0153]将rH-铁蛋白或脾铁蛋白(1.2mg)在40 μ IlmM的氨三乙酸(nitriolotriaceticacid) (ρΗ6.0)、0.5μ I硫酸亚铁铵，2μ 10.5Μ碳酸氢钠、和40 μ Ci59FeCl中在37°C下孵育4小时。在孵育后，将铁蛋白在10，000MW柱体中用Ix PBS透析24小时，以去除任何未结合的59Fe0 rH-铁蛋白的比活度为0.04 μ Ci/g，而脾铁蛋白的比活度为0.08μ Ci/g。将放射性标记的蛋白质(3.4 μ g/g重量)注射到雌性Sprague-Dawley大鼠(约350g体重)的尾静脉中(n=3)。在48小时后，将大鼠断头并立即将器官摘除。将各个器官切开并用0.1M PBS彻底冲洗。对于脑而言，将大脑与小脑分开并将其一分为二，并且将脑膜与脑完全切开。Ig各个器官的组织(湿重量)被用于确定铁的摄取。
[0154]H-铁蛋白缺乏的小鼠被作为实验模型进行评价，来确定器官中潜在的受损害的铁调控是否可以影响铁蛋白的铁递送。使用相似的方法来研究对照和H-铁蛋白缺乏的小鼠中的铁蛋白摄取，方法如上文所述的用于大鼠的方法，除了经腹膜内注射小鼠。rH-铁蛋白的比活度为0.06 μ Ci/g，而脾铁蛋白的比活度为0.31 μ Ci/g。注射铁蛋白并使其在血流中循环48小时，直到将小鼠处死并将其器官摘除。
[0155]以基于碘化钠(NaI)的单通道分析器孔计数器系统(Canberra IndustriesInc.)运行I分钟来确定各个器官中放射性的量。从Y计数/分钟(cpm)中减去本底计数，除以计数的效率，然后再除以每分钟的衰变数来计算uCi。为了计算％总量，器官的UCi除以注射的μ Ci总量，然后再乘以100%。
[0156]MM.[0157]通过将含有放射性标记的59Fe的rH-铁蛋白或脾铁蛋白注射到成年大鼠的尾静脉中，来检测体内摄取结合到铁蛋白的铁。在脑、心脏、肾、肌肉和肺中，来自rH-铁蛋白的铁摄取明显高于来自脾铁蛋白的铁摄取(图1A)。当59Fe呈现出与rH-铁蛋白结合时，与59Fe与脾铁蛋白结合时相比，脑中的59Fe的量要高出2倍(p〈0.005)(图1B)。只有在肝中，从脾铁蛋白中摄取的铁比从rH-铁蛋白中摄取的铁显著更高(p〈0.05)。
[0158]为了确定在各种器官中铁储存能力的潜在变化对rH-铁蛋白和脾铁蛋白向各个器官递送铁的影响，我们研究了在H-铁蛋白缺乏的小鼠系中从这些蛋白中摄取的 59Fe (Thompson K.J., Fried M.G., Zheng Y., Boyer P., Connor J.R.J CellSc1.115:2165-2177,2002)。相比于同窝出生的对照，H-铁蛋白受损害的小鼠的脾、肺和肌肉中由rH-铁蛋白递送的铁减少(p〈0.05)(图2A)。在脑中也观察到相似的现象(图2B)。在铁储存受损害的小鼠的任何器官中，脾铁蛋白的摄取都无变化(图3A和3B)。
[0159]虽然血清铁蛋白能够不受限制地通过全身器官而向脑递送铁，但是它必须穿过内皮细胞屏障(BBB)。为了研究是否发生铁蛋白转胞吞作用，我们利用了 BBB的细胞培养物模型。H-铁蛋白而非脾铁蛋白以显著的量转运穿过BREC细胞单层(图4)。转运穿过BREC单层的FITC标记的H-铁蛋白的速率比RITC标记的右旋糖酐多5倍(p〈0.001)。脾铁蛋白的转运速率与在右旋糖酐对照中所见的水平相似。为了确定H-铁蛋白被转胞吞的机制，我们在不含钾的培养基中进行转运试验来阻止包覆网格蛋白的囊泡的形成。未形成网格蛋白包覆与H-铁蛋白转运速率降低80%有关(p〈0.001)。相反地，菲律宾菌素对BRECs的预处理阻止了胞饮作用，未造成速率的显著降低。右旋糖酐对照品被包含在各个实验条件中，并且根据未处理条件下的图中的显示(数据未显示)，速率没有变化。包含转铁蛋白转运作为阳性对照并且依照之前的报道来检测(Burdo J.R., Antonetti D.A., Wolpert E.B., Connor J? R.Neurosciencel21:883-890, 2003)。荧光标记的转铁蛋白和铁蛋白的比活度是不同的，因此不能得出关于这两种蛋白质的相对转运速率的结论。
[0160]为了更彻底地评价通过铁蛋白向脑递送铁的机制，进行结合研究来确定BREC模型中铁蛋白的转运是否是受体介导的。此外，为了扩展对结合到体内系统的铁蛋白的评价，将微血管从大鼠脑中分离(RBMVs)。利用饱和度实验和竞争性实验来实施结合到BREC和RBMV 的铁蛋白。在 GRAPHPAD PRISM?4.0 (GraphPad Software, Inc.)中使用非线性回归来得到Kd和Bmax值。
[0161]将各种浓度(1、2、3、5、7和IOnM)的125I标记的铁蛋白(rH_铁蛋白或脾铁蛋白)与100 μ g组织(BRECs或RBMVs) —起孵育。通过在Whatman过滤器上进行试验来获得总的结合和非特异性的结合(在1000nM未标记的铁蛋白的存在下)。为了从这样的结合试验中获得Kd和Bmax，对单一位点的结合进行非线性整体回归。在该方法中，将总结合和非特异性结合相对于标记的铁蛋白的浓度来制图。得到的图拟合到公式:非特异性的=NS*X和总的=特异性的+非特异性的，其中特异性的=Bmax*X/ (Kd+X)。在整体法中，特异性结合并不来自总结合和非特异性结合的数据。相反地，Kd和Bmax值是通过在两种数据集(总的和非特异性的)之间共用(sharing)非特异性结合常数(NS)来获得的。来自该回归分析的数据显示在图5A和5B中。只有rH-铁蛋白与BRECs或RBMVs的结合都是显著可饱和的。RBMVs 的 Kd 和 Bmax 分别为 7.9±1.6nM 和 572.6±64.0fmol/mg 蛋白质。对于 BRECs，Kd 为2.7±0.9nM,而 Bmax 为 465.7 ±63.lfmol/mg 蛋白质。对于 BRECs 和 RBMVs，曲线拟合的 R2值 >0.8。
[0162]各种浓度的未标记的铁蛋白(0.03、0.1、0.3、1、3、10、30、100、300 和 1000nM)与ΙΟΟμ g BRECs或RBMV组织以及0.4nM的放射性标记的铁蛋白一起孵育。通过在Whatman过滤器上进行试验来获得总结合。然后将总结合(fmol/mg蛋白质)相对于log[浓度(nM)]来作图。然后将这些图与单一位点竞争公式:总量=底室+(顶室-底室)/(l+10(X-LOgEC5Q))相拟合。这些数据显示在图6A和6B中，并显示了 rH-铁蛋白可以有效地竞争结合位点，而脾铁蛋白不可以。从BRECs的竞争曲线确定Kd和Bmax，得到的Kd为2.0nM且Bmax为235.lfmol/mg 蛋白质。RBMVs 相应的值为 Kd=3.4nM 且 Bmax=304.6fmol/mg 蛋白质。对于BRECs和RBMVs，拟合(fit)的R2值>0.95。用于计算数据的两种方法无显著差异。
[0163]H-铁蛋白、Tim-2的特异性受体已被识别，其在脑、肝、肾和免疫细胞中已被发现(Todorich,等人，J.Neurocheml07:1495-1505，2008; Chen,等人，J.Exp.Med.202:955-965，2005; Chakravarti,等人 ，J.Exp.Med.202:437-444，2005)。为了确定该受体是否也存在于肠中，使用对H-铁蛋白受体特异性的抗体来定位在大鼠肠中的H-铁蛋白受体。将成年雌性大鼠的十二指肠冷冻，并制备ΙΟμπι厚切片用于免疫细胞化学。切片与一级抗体(兔抗-Tim-2)在4°C孵育过夜。清洗切片，并在室温下将切片与FITC-标记的IgG 二级抗体培养I小时。细胞核用DAPI染色。用荧光显微镜检查切片。图15是显示细胞核(a)、H-铁蛋白受体(b)和在大鼠十二指肠中的双重染色(c)的照片图。H-铁蛋白受体存在于肠绒毛上，参与受体介导的吸收，这证明了 H-铁蛋白可以被完整地从肠吸收。
[0164]讨论
[0165]该研究的结果揭示了铁蛋白可以将铁递送到多种器官，包括肠和脑。此外，对大多数器官而言，除了肝以外，当通过H-铁蛋白而不通过L-铁蛋白递送铁时，通过铁蛋白递送的铁的量增大。当铁的储存能力受损时，会改变由细胞摄取的H-铁蛋白铁的量，如在H-铁蛋白缺乏的小鼠中所证实的，然而由L-铁蛋白来递送铁在该模型中不受明显的影响。这些结果表明了 H-铁蛋白的反馈系统。因此，我们已识别了向脑递送铁的新的转运系统，与转铁蛋白相比(最大值为2个Fe原子)，该系统可以被给予非常高量的铁(高达4500个Fe原子)，所述铁可以被负载在单个铁蛋白分子中。非转铁蛋白依赖性的向脑递送铁的系统的识别与我们之前的报道相一致，该报道显示在不存在血清转铁蛋白的情况下向脑递送铁(Malecki,等人，J Neurosci Res.56:113-122，1999)。
[0166]在脑中，除了结合到受体之外，铁蛋白必须经转胞吞作用来穿过BBB。我们证实了铁蛋白可以转运穿过BBB的细胞培养物模型。在该细胞培养物模型中，铁蛋白的转运是依赖网格蛋白的并经受体介导的，并且强烈地偏好H-铁蛋白。优选进行H-铁蛋白结合是与转运数据相一致的。在大鼠脑的微血管上也证实了铁蛋白的结合，并且这种结合类似于细胞培养物模型，也强烈地偏好H-亚基。结合和转运数据与铁摄取的数据相一致，所述铁摄取的数据揭示了相对于脾(富含L)铁蛋白，如果铁与H-铁蛋白相关联，向脑的递送增加。
[0167]假设结合BBB和其它器官上受体的铁蛋白的来源为血清。充分确定了血清中存在铁蛋白，但传统上认为血清铁蛋白主要是L-铁蛋白。该富含L的血清铁蛋白的来源主要来自溶解的巨噬细胞(McGowan S.E.,等人，J.Lab.Clin.Med.1ll:611-617, 1988)。然而，我们令人惊奇地表明了铁蛋白与受体的结合、铁蛋白的转运和铁向脑的递送都强烈地偏好富含H的铁蛋白。
[0168]实施例2H-铁蛋白的膳食递送
[0169]我们已设计了使用重组酵母递送作为膳食补充剂的rH-铁蛋白的机制，在所述重组酵母中，H-铁蛋白基因被整合到酵母基因组中。最初，将酵母转化以表达人H-铁蛋白基因，所述人H-铁蛋白基因可以被翻译成H-铁蛋白蛋白质。在图7中显示的免疫印迹证实了通过酵母产生的rH-铁蛋白蛋白质和H-铁蛋白抗体不与L-铁蛋白交叉反应。进行了培养基中的铁浓度对在转化的酵母中rH-铁蛋白的铁含量的影响的研究。酵母在含有标准量铁的YEro培养基中和在铁补充的培养基中(YEro加上6mMFeS04)生长。结果显示在图8中。在图8的泳道3中的样品的重组酵母在富含铁的培养基中生长，而泳道4中的样品的酵母在标准铁的条件下生长。来自在富含铁的培养基中生长的酵母的铁蛋白呈现出含有为来自在标准培养基中生长的酵母的铁蛋白的2-3倍的铁。
[0170]方法
[0171]重组酵母的构建
[0172]在图16中显示了用于酿酒酵母(S.cerevisiae)的H-铁蛋白表达盒,该表达盒在酵母组成型TDH3转录启动子控制下表达人H-铁蛋白，通过PCR由质粒RLK/pL5659产生，所述质粒 RLK/pL5659 由 pAG426GPD_ccdB (AddGene, Cambridge, MA)通过插入 H-铁蛋白编码序列和URA3基因得到。将所述PCR产物转化到酵母菌株BY4741中，并允许使用标准方法整合成酵母染色体中，例如，如在Hinnen等人的PNAS USA75:1929-1933, 1978.中所描述的。含有表达盒的酵母转化体由可选择的标记物回收，并在50mM Tris-HCl (pH7.4)、150mM NaCl中使用玻璃珠制备转化酵母的溶菌产物。通过DC Protein Assay (Bio-Rad)确定的25 μ g的总蛋白通过SDS-PAGE分离并转移至硝化纤维素过滤器。用1:2000 (CovancePAl 192)稀释的H-铁蛋白多克隆抗体探测印迹。二级抗体为1:5000 (GE Amersham)稀释的抗-兔IgG,并使用Western Lightning-ECL(Perkin Elmer)检测信号。显示在图17中的结果表明重组H-铁蛋白表达的量依赖于染色体整合的位点。含有染色体整合的H-铁蛋白表达盒的重组菌株RLK3190，与其它染色体位点的整合相比，出乎意料地表达显著更高水平的人H-铁蛋白。这个水平比得上或超过由菌株RLK3177产生的H-铁蛋白的量，所述菌株RLK3177含有具有多个H-铁蛋白表达盒拷贝的额外的染色体质粒。在RLK3190中，基于在表达盒上的TDH3启动子与染色体基因之间的同源性，表达盒通过同源重组整合在染色体的TDH3位置。使用本领域中的标准技术可以容易地通过基因工程改造这个盒和其它的盒在这个位点的插入。
[0173]在RLK3190菌株中的表达盒当其被整合到酵母染色体的TDH3基因座中时，以高水平结构性地产生人H-铁蛋白。当酵母转化体在富含铁的培养基(例如，6mM FeSO4)中生长时，它们获得对治疗功效足够高浓度的至少50，OOOppm干细胞重的细胞铁含量。
[0174]讲食研究:
[0175]使用铁缺乏的标准的临床前动物模型，我们证明了铁蛋白表达、补充铁的酵母比给予硫酸亚铁治疗铁缺乏的标准方法更好。
[0176]使用得到良好确认的大鼠模型基于大鼠进行进食试验。设计研究以直接对比铁蛋白丰富的酵母与铁补充的标准，硫酸亚铁的功效。将20日龄的大鼠每I只关在一个笼子并进食铁缺乏的膳食(ID;3ppm铁)。所有的大鼠在控制温度(23 ±2°C)和湿度(40%)的房间随意接受食物和去离子蒸馏水，所述房间保持12:12小时光/暗循环(从6:00am至6:00pm为光)。依照美国营养学会(AIN) -93G膳食的食谱制备ID膳食，玉米淀粉作为碳水化合物的唯一来源。在用硝酸湿消化后使用原子吸收分光光度法证实膳食的铁水平。
[0177]在开始ID膳食后每3-4天从每只大鼠中采集总计50 μ I的血液以监测血细胞比容和血红蛋白水平。在进食23天铁缺乏的膳食后(出生后第43天)，平均血红蛋白和血细胞比容水平分别是5.47 + 0.24和21.67 + 0.3%。然后将大鼠随机分配到3个组中(η=4/组):
[0178]与ID膳食(3ppm铁)一起制备各膳食作为基础膳食。向ID膳食加入铁补充的酵母(不表达铁蛋白)或硫酸铁至50ppm以制备对照膳食。大鼠随意进食分配的膳食，并且每3-4天再次测量血红蛋白和血细胞比容水平直到出生后第61天(总计17天)。整个进食阶段测量食物摄取量，并且在组间无差异。在P61使大鼠安乐死，并确定血液学和脑测量值。
[0179]结果显示在图9中 。持续进行ID膳食的动物具有最低水平的血红蛋白(Hb)。接受无铁酵母的动物具有类似于ID动物的Hb水平。在另外的三组中看到了 Hb水平的提高，最快的提高发生在接受铁补充的和用铁蛋白强化的酵母的动物中。即使是接受无铁蛋白的铁补充的酵母的动物也比FeSO4组显示了更好的Hb水平的提高。
[0180]在相同组的动物中也监测了血细胞比容水平。这些数据显示在图10中。这些数据显示了酵母作为铁的载体在存在或不存在H-铁蛋白的情况下在校正血细胞比容上同样有效并且两者都比标准的目前的治疗选择，FeSO4显著更好。在17天的检查过程中持续进行ID膳食的动物和接受无铁补充的酵母的动物在血细胞比容上显示无提高。
[0181]一种显示身体转移铁的能力、间接地测量铁的生物利用度的重要分析是转铁蛋白饱和度水平。转铁蛋白是主要的铁转移蛋白质并且在血清中以高浓度被发现。在贫血病症中转铁蛋白饱和度从30%的正常高到少于10%波动。在我们用于评价铁蛋白强化的铁补充的酵母的功效的动物模型中，转铁蛋白饱和度的分析显示在图11中。这些数据显示了铁蛋白强化的铁补充的酵母导致了转铁蛋白(Tf)饱和度的最大提高，其次是无铁蛋白的铁补充的酵母。这些研究再次证实了与膳食中的FeSO4相比表达铁蛋白的酵母作为铁递送载体的优越性。维持ID膳食或进食对照酵母的(非铁或铁蛋白强化的)动物具有最低的Tf饱和度。这些研究证实了铁蛋白强化的铁补充的酵母比膳食FeSO4在提高血红蛋白水平、血细胞比容和铁生物利用度上高达三倍更加有效，并提供了用于治疗铁缺乏紊乱的优越方法。此外，铁缺乏的动物早在用铁蛋白强化的铁补充的酵母治疗后14天接近于正常的血红蛋白(40-50%)和血细胞比容(13.5-15.5)水平。
[0182]当根据消耗的铁的量测量对血红蛋白、血细胞比容和转铁蛋白饱和度的效果时，铁蛋白强化的铁补充的酵母在治疗铁缺乏症中的令人惊讶的优越性甚至更加显著。如图18所示，基于消耗的铁，铁蛋白强化的铁补充的酵母在提高血红蛋白、血细胞比容和转铁蛋白饱和度的有效性方面比目前的护理标准，FeSO4高2-3倍。这些结果证实了当通过使用H-铁蛋白递送铁来增加铁的生物利用度时，需要消耗更少的铁以恢复正常的血红蛋白和血细胞比容水平。
[0183]对脑中铁的影响
[0184]由于铁缺乏对脑发育具有重大影响，因此在接受不同膳食的动物中监测特定脑区域的铁状态。在图12中，显示了脑的两个发育上重要的区域，中脑腹侧和尾部的铁状态。这些区域注定将随着动物(例如人)成熟变得相对富含铁。这些脑区域涉及运动活性的调节；因此特别是在发育过程中发生铁缺乏时，造成运动技能的损害。在Hb和Hct分析中描述的相同的动物在14日龄时处死，并测量中脑腹侧(VBM)和尾部的铁浓度。接受已由H-铁蛋白强化的且铁补充的酵母的动物在这两个脑区域中具有比其它任何组都更多的铁。这种令人兴奋的发现表明铁蛋白强化的膳食补充可以是限制与铁缺乏有关的神经缺陷的途径。该观察不仅通过提高公共健康而且优化神经功能，对于对抗全球铁缺乏可能具有重大影响。
[0185]为了进一步评价脑中铁状态的区域性变化，对另外两个脑区域一伏隔核(nucleusaccumbens,NA)和前额皮质(prefrontal cortex,PFC)进行检查。这些结果显不在图13中。在该图中，由铁蛋白强化的铁补充的酵母递送的铁的区域特异性是明显的。在NA中，类似于图12中显示的VMB和尾部，相对于铁递送的其它模式铁含量是升高的。然而，在PFC中，由铁蛋白强化的铁补充的酵母递送的铁与在其它组中的发现相似。这些数据表明存在一种不同的机制调节由铁蛋白强化的铁补充的酵母的铁递送，并且与我们在脑微血管上H-铁蛋白受体的发现相一致。
[0186]脑对铁摄取的增加以及可能更重要的是摄取的区域特异性是意料不到的，是与本发明相关的高度重大发现。这些数据表明使用铁蛋白强化的铁补充的酵母会使出生后发育期间与铁缺乏有关的神经、认知和行为缺陷改善。血液学参数的数据无疑是有力的，且表明铁蛋白强化的铁补充的酵母是膳食补铁的优良模式。
[0187]应当理解的是，对本文所述的目前优选的实施方案的各种变化和修饰对于本领域技术人员来说将是显而易见的。可以进行这样的变化和修饰而不背离本发明的精神和范围并且不减少其附带的优势。因此这样的变化和修饰意为被所附权利要求所覆盖。
【权利要求】
1.一种重组酵母，其包含在酵母组成型TDH3转录启动子控制下编码人H-铁蛋白的核酸序列。
2.一种重组酵母，其包含编码人H-铁蛋白的核酸序列，所述编码人H-铁蛋白的核酸序列整合到酵母染色体中的TDH3位点、。
3.—种H-铁蛋白表达盒，所述H-铁蛋白表达盒用于在酵母组成型TDH3转录启动子控制下表达人H-铁蛋白的酿酒酵母(S.cerevisiae)。
4.一种组合物，其包含根据权利要求1或2所述的重组酵母。
5.根据权利要求4所述的组合物，其中所述组合物是药物组合物、医疗食品或营养补充剂。
6.根据权利要求4或5所述的组合物，其包含一种或多种其它的活性化合物。
7.根据权利要求4至6中任一项所述的组合物，其中所述组合物用于口服给药。
8.根据权利要求1或2所述的重组酵母或根据权利要求4至8中任一项所述的组合物，其用于在治疗中使用。
9.根据权利要求1或2所述的重组酵母或根据权利要求4至8中任一项所述的组合物在治疗中的应用。
10.一种用于治疗疾病或紊乱的方法，所述方法包括给予有需要的患者根据权利要求1或2所述的重组酵母或根据权利要求4至8中任一项所述的组合物。
11.根据权利要求1或2所述的重组酵母或根据权利要求4至8中任一项所述的组合物在制备用于治疗疾病或紊乱的药物中的应用。
12.权利要求8所述的重组酵母或组合物或权利要求9所述的应用，其中所述治疗包括铁紊乱的治疗。
13.权利要求12所述的重组酵母、组合物或应用，其中所述铁紊乱选自(i)与脑中铁缺乏相关的铁紊乱，(ii)缺铁性贫血，(iii)神经障碍或神经退行性障碍，(iv)帕金森病、阿尔茨海默病、抑郁症、失眠症、多发性硬化症、不安腿综合征、注意力缺失症或肌萎缩侧索硬化症，(V )与出生后发育过程中铁缺乏相关的神经性的、认知的、行为的或运动的缺陷，(V i )铁过载紊乱，或(Vii)地中海贫血或血色沉着病。
14.根据权利要求10所述的方法或根据权利要求11所述的应用，其中所述疾病或紊乱是铁紊乱。
15.根据权利要求14所述的方法或应用，其中所述铁紊乱选自(i)与脑中铁缺乏相关的铁紊乱，(ii)缺铁性贫血，(iii)神经障碍或神经退行性障碍，(iv)帕金森病、阿尔茨海默病、抑郁症、失眠症、多发性硬化症、不安腿综合征、注意力缺失症或肌萎缩侧索硬化症，(V)与出生后发育过程中铁缺乏相关的神经性的、认知的、行为的或运动的缺陷，(vi )铁过载紊舌L，或(vii)地中海贫血或血色沉着病。
16.用于治疗患者中铁紊乱的方法，所述方法包括给予有需要的患者治疗有效量的铁蛋白-铁复合物。
17.权利要求16所述的方法，其中所述铁蛋白-铁复合物包含H-铁蛋白。
18.权利要求17所述的方法，其中所述H-铁蛋白是哺乳动物H-铁蛋白。
19.权利要求18所述的方法，其中所述哺乳动物H-铁蛋白是人H-铁蛋白或其同源物。
20.权利要求19所述的方法，其中所述同源物与人H-铁蛋白具有至少90%的序列同源性。
21.权利要求17至20中任一项所述的方法，其中所述H-铁蛋白是重组H-铁蛋白。
22.权利要求21所述的方法，其中所述重组H-铁蛋白在酵母、细菌或杆状病毒中产生。
23.权利要求16至22中任一项所述的方法，其中所述铁紊乱是缺铁性贫血。
24.权利要求16至22中任一项所述的方法，其中所述铁紊乱与脑中铁缺乏相关。
25.权利要求16至22中任一项所述的方法，其中所述铁紊乱是神经障碍或神经退行性障碍。
26.权利要求25所述的方法，其中所述铁紊乱选自帕金森病、阿尔茨海默病、抑郁症、失眠症、多发性硬化症、不安腿综合征、注意力缺失症和肌萎缩侧索硬化症。
27.权利要求16至22中任一项所述的方法，其中所述铁紊乱包括与出生后发育过程中铁缺乏相关的神经性的、认知的、行为的或运动的缺陷。
28.权利要求16至22中任一项所述的方法，其中所述铁紊乱是铁过载紊乱。
29.权利要求28所述的方法，其中所述多亚基铁蛋白复合物处于小于100%铁结合能力。
30.权利要求28所述的方法，其中所述多亚基铁蛋白复合物包含哺乳动物H-铁蛋白或其同源物。
31.权利要求28所述的方法，其中所述铁紊乱选自地中海贫血和血色沉着病。
32.权利要求28至31中任一项所述的方法，其中将所述铁蛋白-铁复合物或去铁铁蛋白在血液输注中给予患者。
33.一种用于将治疗有效量的铁递送至脑的方法，所述方法包括给予患者铁蛋白-铁复合物，借以将治疗有效量的铁转运通过血脑屏障并递送至脑。
34.权利要求16至33中任一项所述的方法，其中所述铁蛋白-铁复合物进一步包含靶向部分。
35.权利要求34所述的方法，其中所述靶向部分选自抗体、适配体、受体、配体及其结合片段。
36.权利要求34或35所述的方法，其中所述靶向部分识别脑或血脑屏障特异性标记物。
37.一种使用H-铁蛋白作为靶向部分的方法，其包括将H-铁蛋白连接到脂质体，借以将脂质体靶向脑。
38.一种重组酵母，其包含编码人H-铁蛋白的核酸序列，所述编码人H-铁蛋白的核酸序列整合到酵母染色体中。
39.权利要求38所述的重组酵母，其中所述编码人H-铁蛋白的核酸序列整合到酵母染色体中的TDH3位点。
40.一种用于口服治疗患者中铁紊乱的组合物，其包含权利要求38所述的重组酵母。
41.一种用于口服治疗患者中铁紊乱的组合物，其包含权利要求39所述的重组酵母。
【文档编号】A61K47/42GK103635570SQ201280024378
【公开日】2014年3月12日 申请日期:2012年5月24日 优先权日:2011年5月24日
【发明者】J·R·康纳, R·L·凯尔 申请人:西纳有限责任公司