特异性靶向癌细胞的输送系统及其使用方法

特异性靶向癌细胞的输送系统及其使用方法
【专利摘要】公开用于预防、治疗或抑制受试者的癌细胞的生长或转移的多种方法。其中一种方法包括向受试者施用治疗有效量的肿瘤相关抗原结合配体包覆的含有细胞毒性剂的行星球磨（PBM）纳米颗粒的步骤。
【专利说明】特异性靶向癌细胞的输送系统及其使用方法
[〇〇〇1] 本申请要求2011年8月15日提交的第61/523,626号临时申请的优先权。该临 时申请的全部内容通过引用并入到本发明中。 【技术领域】
[0002] 本申请总体上涉及输送系统和癌症的治疗。特别地，本申请涉及使用纳米颗粒的 细胞毒性剂的运输。 【背景技术】
[0003] 全身性毒性是与破坏细胞的分裂和复制的能力的许多细胞毒性药物相关联的主 要问题。例如，尽管有一些益处，基于钼的药物(例如卡钼、顺钼、奥沙利钼、沙钼、三钼替群 妥英（triplatin tetranin)等)、天然酚类(例如小豆蘧、姜黄素、高良姜、生姜、内亚胡椒、 姜黄等)，植物碱和紫杉烷类(例如喜树碱、多西他赛、紫杉醇、长春碱、长春新碱、长春瑞滨、 长春新碱等)、其它的烷基化剂(例如六甲蜜胺、白消安、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、 达卡巴嗪、乙撑亚胺、六甲蜜胺、肼、异环磷酰胺、洛莫司汀、氮芥、美法仑、亚硝基脲、胡椒 碱、丙卡巴肼、链佐星、替莫唑胺、塞替派、三嗪等)、肿瘤抗生素和蒽环类抗生素(例如博莱 霉素、色霉素、更生霉素、道诺红霉素、阿霉素、表柔比星、伊达比星、丝裂霉素、米托蒽醌、普 卡霉素等)、拓扑异构酶抑制剂(例如安吖啶、依托泊苷、伊立替康、替尼泊苷、托泊替康等)、 抗代谢物（5-氟尿嘧啶、6-硫鸟嘌呤、6-巯基嘌呤、腺苷脱氨酶抑制剂、卡培他滨、克拉屈 滨、阿糖胞苷、氟尿苷、氟达拉滨、吉西他滨、甲氨蝶呤、奈拉滨、喷司他丁有丝分裂抑制剂、 嘌呤拮抗剂、嘧啶拮抗剂等）以及各种抗肿瘤药(例如天门冬酰胺酶、贝沙罗汀、雌莫司汀、 羟基脲、异维甲酸、米托坦、培加帕酶、类维生素 A、维生素 A酸等）在抑制癌细胞中是非常 有效的。然而，它们的效用仍不确定，存在复杂性和问题。例如，基于钼的药物不是治疗癌 症的首选，因为这些药物容易被健康组织吸收，且只有少于1 %的施用药物到达细胞内靶标 (例如肿瘤细胞的细胞核/DNA)。结果，基于钼的和其他癌症药物可能对健康组织毒性极高。 因此，需要一种输送系统，专门针对癌细胞的细胞毒性剂的递送。
【发明内容】

[0004] 本申请的一个方面涉及一种用于特异性地靶向癌细胞的系统，其包含用高亲和力 和选择性的肿瘤细胞配体涂覆并含有细胞毒性剂的行星球磨（PBM)纳米颗粒。
[0005] 本申请的另一个方面涉及一种用于在需要的受试者中治疗癌症的方法，包括对所 述受试者施用有效量的用于特异性地靶向癌细胞的系统，其包含用高亲和力和选择性的肿 瘤细胞配体涂覆并含有细胞毒性剂的行星球磨（PBM)纳米颗粒。
[0006] 本申请的另一个方面涉及在需要的受试者中抑制癌转移，包括对所述受试者施用 有效量的用于特异性地靶向癌细胞的系统，其包含用高亲和力和选择性的肿瘤细胞配体涂 覆并含有细胞毒性剂的行星球磨（PBM)纳米颗粒。
[0007] 本申请的另一个方面涉及在需要的受试者中诱导调节性T (Treg)细胞的细胞凋 亡,包括对所述受试者施用有效量的用高亲和力和选择性的肿瘤细胞配体涂覆并含有对 Treg细胞有细胞毒性的药剂的行星球磨（PBM)纳米颗粒。 【专利附图】

【附图说明】
[0008] 图1示出了用于制造可生物降解的行星球磨（PBM)纳米颗粒的示例性方法。
[0009] 图2是由姜黄素调节的分子靶标的图。
[〇〇1〇] 图3示出了通过乳腺癌组织和细胞系的叶酸受体的表达。
[0011] 图4示出了乳腺癌（BrCa)细胞的PBM纳米颗粒介导的细胞凋亡。
[0012] 图5示出了在MDA-MB-231-Luc异种移植中PBM纳米颗粒介导的肿瘤消退。
[0013] 图6示出了 CD4+CD25*FoxP3+ (Treg)细胞的PBM纳米颗粒介导的细胞凋亡。
[0014] 图7示出了叶酸受体（FRs)由PC3和PTEN-CaP2肿瘤表达，而不是由细胞系或正 常细胞表达。
[0015] 图8示出了在体外顺钼负载的叶酸包覆的PBM纳米颗粒介导的PC3细胞的破坏。
[0016] 图9示出了接受顺钼溶液（8mg/kg/周）或包含顺钼的叶酸涂覆的XP包层纳米颗 粒的移植有PC3-luc瘤的小鼠的肿瘤消退。
[0017] 图10示出了涂覆和未涂覆的PBM纳米颗粒的粒径分布。
[0018] 图11示出了涂覆有表面结合叶酸的聚己内酯的PBM纳米颗粒。
[0019] 图12示出了前列腺肿瘤特异性PBM颗粒的ζ电势。
[0020] 图13示出了叶酸受体由前列腺细胞系和肿瘤的表达。
[0021] 图14示出了负载ΡΒΜ纳米颗粒的姜黄素孵育的PC3细胞的凋亡。
[0022] 图15示出了制造 ΡΒΜ纳米颗粒的示例性的图。
[0023] 图16示出了心室内和骨内（intratibialy)注入PC3肿瘤细胞的老鼠。
[0024] 图17示出了前列腺肿瘤特异性PBM纳米颗粒的粒度分布。
[0025] 图18示出了前列腺肿瘤特异性PBM纳米颗粒的ζ电势。
[0026] 图19示出了 ΡΒΜ纳米颗粒处理过的前列腺癌细胞的TUNEL和DRAQ5染色。
[0027] 图20显示ΡΒΜ纳米颗粒介导的癌细胞与正常细胞的凋亡。
[0028] 图21显示ΡΒΜ纳米颗粒运输到细胞核和TUNEL染色。 【具体实施方式】
[0029] 陈述以下的详细描述以使所属领域的任何技术人员能够制造和使用本发明。为了 解释的目的，阐述具体的术语以提供对于本发明的完全理解。然而，对于本领域技术人员来 讲，显而易见的是这些具体的描述不是实施本发明必需的。具体应用的描述仅作为典型的 实例。本发明并不试图限定于所示实施例，而是使与本发明所公开的原理和特征与尽可能 广泛的范围相一致。
[0030] 除非另有限定，否则所使用的与本发明相关的科学和技术术语应该具有由本领域 的普通技术人员通常理解的含义。此外，除非上下文另有要求，单数术语应包括复数，复数 术语应包括单数。
[0031] 释义
[0032] 当在本发明中使用时，下列术语具有以下含义：
[0033] 当用于本发明中时，术语"癌症（cancer)"指的是恶性新生物或恶性赘生物，是一 组细胞显示出不受控制的生长，侵入和破坏邻近组织，有时通过淋巴或血液转移或扩散到 身体的其他部位的一类疾病。癌症的这三种恶性与不侵入或转移的良性肿瘤区分开来。术 语"癌症"在此包括"癌"、"肉瘤"、"淋巴瘤"、"白血病"、"黑色素瘤"、"胚细胞瘤"和"母细胞 瘤"。
[〇〇34] 当用于本发明中时，术语"肿瘤"指的是由细胞的异常生长而形成的肿瘤或固体病 变。肿瘤可以是良性的、恶性前的或恶性的。
[0035] 当用于本发明中时，术语"癌（carcinoma)"是指一种侵入性恶性肿瘤，包括转化的 上皮细胞或未知组织来源的转化细胞，但它们具有与上皮细胞相关的特定的分子的或组织 学的特征，例如细胞角蛋白或细胞间桥的产生。本发明的典型的癌包括黑色素瘤、卵巢癌、 阴道癌、宫颈癌、子宫癌、前列腺癌、肛门癌、直肠癌、结肠癌、胃癌、胰腺癌、胰岛细胞瘤、腺 癌、腺鳞癌、神经内分泌肿瘤、乳腺癌、肺癌、食道癌、口腔癌、脑癌、成神经管细胞瘤、神经外 胚层瘤、神经胶质瘤、垂体癌和骨癌。
[0036] 当用于本发明中时，术语"肉瘤"是指由结缔组织产生的癌症，例如骨、软骨、月旨 肪和神经组织，每一种从起源于骨髓外的间充质细胞中的细胞发育而来，即一种由在从 胚胎的中胚层发育的许多组织中的一种组织中的转化细胞产生的癌症。因此，肉瘤包括 骨、软骨、脂肪、肌肉、血管和造血组织的肿瘤。例如，骨肉瘤来自骨，软骨肉瘤来自软骨， 脂肪肉瘤来自脂肪，平滑肌肉瘤来自平滑肌。典型的肉瘤包括:Askin肿瘤、葡萄状肉瘤 (botryodies)、软骨肉瘤、Ewing' s-PNET、恶性血管内皮瘤、恶性神经鞘瘤、骨肉瘤、软组织 肉瘤。软组织肉瘤的次级分类包括：腺泡状软组织肉瘤、血管肉瘤、叶状囊肉瘤、皮肤纤维 肉瘤、硬纤维瘤、促纤维增生性小圆细胞瘤、上皮样肉瘤骨外软骨肉瘤、骨外骨肉瘤、纤维肉 瘤、血管外皮细胞瘤、血管肉瘤、Kaposi肉瘤、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴肉 瘤、恶性纤维组织细胞瘤、神经纤维肉瘤、横纹肌肉瘤和滑膜肉瘤。
[0037] 当用于本发明中时，术语"淋巴瘤"是指由离开骨髓并在淋巴结中成熟的造血细胞 所产生的免疫系统的淋巴细胞的癌症。淋巴瘤通常呈现为实体瘤。典型的淋巴瘤包括：小 淋巴细胞淋巴瘤、淋巴楽细胞性淋巴瘤、Waldenstrom巨球蛋白血症、脾边缘区淋巴瘤、楽 细胞瘤、结外边缘区B细胞淋巴瘤、MALT淋巴瘤、结节性边缘区B细胞淋巴瘤（NMZL)、滤泡 性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、纵隔(胸腺)大B细胞淋巴瘤、血管内大B 细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、B细胞慢性淋巴细胞性淋巴瘤、典型霍 奇金淋巴瘤、结节性淋巴细胞为主型霍奇金淋巴瘤、成人T细胞淋巴瘤、鼻型结外NK/T细胞 淋巴瘤、肠病型T细胞淋巴瘤、肝脾T细胞淋巴瘤、母细胞性NK细胞淋巴瘤、蕈样霉菌病、塞 泽里综合征（sezary syndrome)、原发性皮肤⑶30-阳性T细胞淋巴增生性疾病、原发性皮 肤间变性大细胞淋巴瘤、淋巴瘤样丘疹病、血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤、非指定外周T 细胞淋巴瘤和间变性大细胞淋巴瘤。典型霍奇金淋巴瘤的代表形式包括：结节性硬化、混合 细胞性、富淋巴细胞、淋巴细胞耗尽或非耗尽。
[0038] 当用于本发明中时，术语"白血病"是指由离开骨髓并在血液中成熟的造血细胞所 产生的癌症。白血病是涵盖广泛疾病的广义术语。反过来，它是称为血液肿瘤的更广泛的 一组疾病的一部分。白血病被细分成各种大类，第一部是介于白血病急性和慢性形式之间。 急性白血病的特征在于，未成熟的血细胞的数量迅速增加。由于这种细胞的聚集，使骨髓无 法产生健康的血细胞。慢性白血病的特征是相对成熟的白血细胞的过度积聚，但仍然不正 常。通常经过几个月或几年的发展，细胞以比正常细胞高得多的速率产生，导致血液中许多 异常的白血细胞。白血病也通过影响血细胞细分。这种区分将白血病划分为淋巴细胞或淋 巴细胞性白血病和髓细胞或骨髓性白血病。在淋巴细胞或淋巴细胞性白血病中，癌性变化 发生在一类通常会形成为淋巴细胞的骨髓细胞中。在骨髓细胞或骨髓性白血病中，癌性变 化发生在一类通常形成为红细胞的骨髓细胞中、某些其它类型的白细胞和血小板中。结合 这两种分类，共提供四种主要类型。在这四个主要类型的每一种中，通常有几种小类。也有 这种分类方法以外的罕见的类型。典型的白血病包括急性淋巴细胞白血病（all)、慢性淋 巴细胞性白血病（CLL)、急性髓性白血病（AML)、慢性髓细胞性白血病（CML)、毛细胞白血病 (HCL)、T-细胞幼淋巴细胞白血病、大颗粒淋巴细胞性白血病、未成熟骨髓单核细胞性白血 病、B细胞幼淋巴细胞白血病、伯基特细胞白血病、成熟T-细胞白血病。
[0039] 当用于本发明中时，术语"黑色素瘤"是一种黑素细胞的癌症或恶性肿瘤。黑素细 胞是产生暗色素、黑色素(负责皮肤的颜色)的细胞。它们主要在皮肤中发生，但在身体的其 他部位也发现过，包括肠和眼睛。黑色素瘤分为以下定型和亚型：恶性雀斑样痣、恶性雀斑 样痣黑素瘤、浅表扩散性黑色素瘤、肢端雀斑样痣黑素瘤、黏膜黑色素瘤、结节性黑色素瘤、 息肉状黑色素瘤、黑色素瘤促纤维增生、无色素性黑色素瘤、软组织恶性黑色素瘤、有小痣 样细胞的黑色素瘤、有斯皮茨痣特征的黑色素瘤和葡萄膜黑色素瘤。
[0040] 当用于本发明中时，术语"生殖细胞肿瘤"是指由生殖或多能干细胞衍生的癌症， 包括存在于睾丸(精原细胞瘤）或卵巢(无性细胞瘤）的那些细胞。生殖细胞肿瘤可以是癌 性或非癌性肿瘤。生殖细胞通常发生在性腺(卵巢和睾丸）内，起源于性腺外的生殖细胞肿 瘤可能是在胚胎发育过程中的错误所导致的出生缺陷。生殖细胞肿瘤大致分为两大类：生 殖细胞瘤的或精原细胞瘤的和非生殖细胞瘤的或非精原细胞瘤的生殖细胞肿瘤。典型的生 殖细胞瘤的或精原细胞瘤的生殖细胞肿瘤包括：生殖细胞瘤、无性细胞瘤和精原细胞瘤。典 型的非生殖细胞瘤的或非精原细胞瘤的生殖细胞肿瘤包括：胚胎癌、内胚窦瘤或卵黄囊瘤 (EST，YST)、绒毛膜癌、成熟性畸胎瘤、皮样囊肿、未成熟畸胎瘤、恶性转化畸胎瘤、多胚瘤、 性腺胚细胞瘤和混合型GCT。
[0041] 当用于本发明中时，术语"胚细胞瘤"是指由未成熟前体细胞或胚胎组织衍生的癌 症。
[0042] 当用于本发明中时，术语"BrCa"指的是乳腺癌。在这里使用的术语"PCa"是指前 列腺癌。
[〇〇43] 当用于本发明中时，术语"转移"是指癌症或癌从一个器官或部分扩散到另一个非 相邻的器官或部分。
[0044] 当用于本发明中时，术语"抗体"是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白（Ig)分子的免 疫活性部分，即含有与抗原特异性结合(发生免疫反应）的抗原结合位点的分子。术语"抗 体"在最广泛的意义上使用，特别地覆盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、 多特异性抗体(例如双特异性抗体)，以及抗体片段，只要它们表现出期望的生物学活性。由 "特异性结合"或"发生免疫反应"是指该抗体与期望抗原的一个或多个抗原决定簇发生反 应，不与其它多肽发生反应(即结合)或与其它多肽以更低的亲和力结合。术语"抗体"还包 括包含全长抗体的一部分(通常是其抗原结合区或可变区)的抗体片段。抗体片段的实例包 括Fab、Fab'、F (ab'）2和Fv片段；双抗体、线性抗体、单链抗体（scFv)分子；以及由抗体 片段形成的多特异性抗体。在本发明的某些实施方式中，例如，可能理想的是使用抗体片段 而非完整抗体来提高肿瘤穿透。在这种情况下，为了增加其血清半衰期，可能理想的是使用 已通过本领域已知的任何方法修饰的抗体片段。
[0045] 当用于本发明中时，术语"单克隆抗体"指从实质上同质的抗体群获得的抗体，即 除了可能天然发生的少量存在的突变之外，构成群体的各个抗体是相同的。特别地，在本发 明中单克隆抗体包括"嵌合"抗体，以及此类抗体的片段，只要它们表现出期望的生物学活 性，其中，重链和/或轻链的一部分与由特定物种衍生的或属于特定抗体类别和亚类的抗 体中的序列相同或同源，而其余的链是与由其他物种衍生的或属于其他抗体类别和亚类的 抗体中的序列相同或同源。
[0046] 非人抗体的"人源化"形式是含有从非人免疫球蛋白衍生的最小序列的嵌合抗体。 在大多数情况下，人源化抗体是人免疫球蛋白（受体抗体)，其中，来自受体的高变区残基由 来自非人物种(供体抗体)，例如小鼠、大鼠、兔或具有所需特异性、亲和力和/或能力的非人 灵长类动物的高变区残基替换。用于制备人源化的和其它嵌合抗体的方法在本领域中是已 知的。
[0047] "双特异性抗体"是具有对于至少两种不同抗原的结合特异性的抗体。用于制备双 特异性抗体的方法在本领域中是已知的。
[0048] "异源结合抗体（heteroconjugate antibodies)"的使用也在本发明的范围之内。 异源结合抗体由两种共价连接的抗体组成。例如，有人提出此类抗体使免疫系统细胞靶向 不想要的细胞(美国专利号4, 676, 980)。可以设想，可以用合成蛋白质化学中已知的方法 (包括涉及交联剂的方法）在体外制备该抗体。
[0049] 本申请还考虑使用"免疫偶联物（immunoconjugates)"，包含与诸如毒素(例如 细菌、真菌、植物或动物来源的酶促活性毒素，或其片段）或放射性同位素（即放射性偶 联物）的细胞毒性剂结合的抗体。可用的酶活性毒素及其片段包括白喉毒素 A链、白喉 毒素的非结合活性片段、外毒素 A链(来自铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa))、 菌麻毒素 A链（ricin A chain)、相思豆毒蛋白A链（abrin A chain)，蒴莲根毒素 A链 (modeccin A chain)、a -帚曲霉素（alpha-sarcin)、油桐（Aleurites fordii)蛋白、石竹 蛋白（dianthin protein)、美洲商陆（Phytolaca americana)蛋白（PAPI、PAPII 和 PAP-S)、 苦瓜（momordicacharantia)抑制剂、麻疯树毒蛋白（curcin)、巴豆毒素（crotin)、肥阜 草（sapaonaria officinalis)抑制剂、白树毒素（gelonin)、丝林霉素（mitogellin)、局限 曲菌素（restrictocin)、酚霉素（phenomycin)、伊诺霉素（enomycin)和单孢霉烯族毒素 (tricothecenes)。多种放射性核素可用于生成放射性偶联抗体。实例包括 212Bi、131I、131In、 90Υ 和 186Re。
[0050] 为治疗目的的"哺乳动物"是指分类为哺乳动物的任何动物，包括人类、非人类的 灵长类动物、家畜和农畜，以及动物园、运动或宠物动物，例如狗、马、猫、牛等，优选地，所述 哺乳动物是人。
[0051] 当用于本发明中时，术语"治疗（treat、treating或treatment)"是指减轻或消 除疾病和/或其并发症的方法。当用于本发明中时，术语"预防（prevent、preventing或 prevention)"是指限制受试者罹患疾病和/或其并发症的方法。在某些实施方式中，"预防 (prevent、preventing或prevention)"是指降低摧患疾病和/或其并发症的风险的方法。
[0052] 术语"抑制"是相对的术语，相对于参照试剂，如果施用药剂后，反应或状态从数 量上减弱，或者，如果施用药剂后，其被减弱，则药剂抑制反应或状态。类似地，术语"防止" 并不一定意味着药剂完全消除了反应或状态，只要消除了反应或条件中的至少一种特性即 可。因此，可以减少或防止肿瘤生长或反应(例如病理反应)组合物，可以但不必完全消除上 述增长或反应，只要生长或反应可测量地减弱，例如，比在没有药剂的生长或反应或者与参 照药剂相比，减少至少约50%，例如至少约70%、或约80%，或甚至约90% (即至其10%以 下)。
[0053] 术语"提高水平"指的是高于在相关领域中通常限定或使用的正常或对照水平的 更高水平。例如，在组织中免疫染色增加的水平是本领域的普通技术人员认为比在对照组 织中的免疫染色水平更高的水平。
[0054] 当用于本发明中时，术语"生物样品"是指生物来源的材料，其可以是体液或身体 产物，例如血液、血浆、尿液、唾液、脊髓液、粪便、汗液或呼出的空气。生物样品还包括组织 样品和细胞样品。
[0055] 在本发明中，范围可以表示为从"约"一个特定值，和/或到"约"另一个特定值。 当表达这样的范围时，另一种实施方式包括从一个特定值和/或到另一个特定值。类似地， 当数值表示为近似值时，通过使用先行词"约"，可以理解的是，该特定值形成另一种实施方 式。可以进一步理解为，每个范围的端点相对于另一端点是显著的，并且独立于另一端点。 也可以理解的是，本发明中公开了一些值，并且除了该值本身，每个值在本发明中也以"约" 的特定值公开。例如，如果公开了"10"的值，那么"约10"也被公开。正如本领域技术人员 的适当理解，还应当理解的是，当以"小于或等于"某值公开该值时，"大于或等于该值"以及 数值间可能的范围也被公开。例如，如果公开了"10"的值，则"小于或等于10"以及"大于 或等于10"也被公开。
[0056] 在本申请的上下文中，"有效量"是指足以实现有益的或期望的结果的组合物的 量，例如，预防或治疗疾病的有效量。"疾病"指会受益于抗体治疗的任何状态，包括癌和化 学抗性。这包括慢性和急性疾病，或包括使哺乳动物易于罹患所讨论的疾病的那些病理状 态的疾病。
[0057] 携带特异性靶向癌细胞的纳米颗粒的药物
[0058] 本申请的一个方面涉及携带特异性靶向特定细胞的纳米颗粒的药物，例如肿瘤细 胞和调节性T细胞（Treg细胞)。在一些实施方式中，携带纳米颗粒的药物包括一个行星球 磨纳米颗粒核，一种或多种细胞毒性剂，以及一种或多种细胞靶向剂。在某些实施方式中， 所述一种或多种细胞毒性剂包括姜黄素，所述一种或多种细胞靶向剂包括叶酸。在某些其 它实施方式中，一种或多种细胞毒性剂包含姜黄素和一种或多种其他细胞毒性剂。本申请 的携带药物的纳米颗粒允许使用较低剂量的细胞毒性药物，降低不良反应，提高疗效，并减 少药物被迅速从靶标肿瘤或癌细胞清除的可能性。例如，本申请的携带药物的纳米颗粒能 够靶向并由乳腺或前列腺癌细胞吸收，从而有效地将化学治疗剂运送到癌细胞中的细胞内 靶标，并携带充足的药物以完成细胞凋亡过程来限制化学抗性和全身毒性的可能性。
[0059] 行星球磨（PBM)纳米颗粒
[0060] 如在本发明中所用，术语" PBM纳米颗粒"和" XPc 1 ad纳米颗粒"是相同的，可以互 换使用。在一些实施方式中，所述PBM纳米颗粒的直径的范围为0. 1ηπι-60μπι、0. lnm-?μπι、 0· lnm-500nm、0. lnm_200nm、lnm-200nm、5nm_60 μ m、5nm-30nm、30nm-80nm、30nm-180nm、 80nm_l μ m、180nm_l μ m、200nm_l μ m、1 μ m_6 μ m、4 μ m_12 μ m 和 10 μ m_60 μ m。在其它实施 方式中，所述PBM纳米颗粒可以是生物可降解的纳米颗粒。可以使用一种新配方的方法来 产生大小均匀，100%的疏水性或亲水性药物负载效率，含有用于靶向递送的后续涂层并控 制用于全身性、口服或皮肤运送的表面的logP (用于亲脂性：亲水性分布的度量）的颗粒， 以制造 PBM纳米颗粒。
[0061] 本申请中描述的PBM纳米颗粒表示使用行星球磨机以产生均匀尺寸的，100 %的 疏水性或亲水性药物负载效率，含有用于靶向递送的后续涂层并控制用于全身性、口服或 皮肤运送的表面的logP的颗粒的新型纳米颗粒制剂方法。这些是通过以RES设计表面特 性靶向乳腺肿瘤的FR1和无间隙的FR4表达Treg细胞的均匀大小的颗粒得到的PBM纳米 颗粒的首次研究。
[0062] 在一些实施方式中，所述PBM纳米颗粒包括纳米基质芯，包括一种或多种可生物 降解的聚合物或多糖，例如藻酸盐、纤维素、胶原蛋白和淀粉。其它合适的可生物降解的 聚合物包括但不限于聚乙二醇（PEG)、聚乙醇酸（PGA)、聚乳酸（PLA)、乳酸-乙醇酸共聚物 (PLGA)、聚羟基脂肪酸酯（PHA)、聚羟基丁酸酯-戊酸酯（PHBV)、聚乙烯醇（PVA)、聚对苯二 甲酸乙酯（PET)、聚乙交酯-丙交酯、聚己内酯（PCL)、乳酸-ε-己内酯共聚物（PLCL)、聚二 噁烷酮（PD0)、聚三亚甲基碳酸酯（PTMC)、聚（氨基酸)、聚二噁烷酮、聚草酸酯、聚酐、聚（磷 酸酯)、聚原酸酯以及它们的共聚物。在某些实施方式中，所述纳米颗粒核心的基质包括PEG 和选自藻酸盐、纤维素、胶原蛋白和淀粉的聚合物或多糖的混合物。细胞毒性剂的分子截留 在纳米颗粒核基质中。在一些实施方式中，细胞毒性剂在基质芯的形成过程中与生物可降 解聚合物和多糖混合。在其他实施方式中，首先形成基质芯，在随后的阶段中加载细胞毒性 剂。
[0063] 在一些实施方式中，所述基质的核心是通过将生物聚合物(例如藻酸盐、纤维素、 胶原蛋白和淀粉）溶解在水中以形成水溶液，将细胞毒性剂加入到该水溶液中以形成生物 聚合物/细胞毒性剂的混合物，并任选地将另一种聚合物(例如PEG)加入到该生物聚合物/ 细胞毒性剂的混合物中以形成最终混合物。将该最终混合物干燥为颗粒或片剂的形式，然 后在受控的温度（<37°C)下使用行星式球磨机研磨。可以通过行星球磨的速度和时间控制 纳米颗粒的尺寸。在一些实施方式中，所述纳米颗粒的尺寸范围为〇· 1至5nm、5至30nm、30 至 80nm、30 至 180nm、180 至 lOOOnm 或 200 至 lOOOnm。研磨速度范围为 100-600rmp,优选 200-400rmp〇
[0064] 在其它实施方式中，所述PBM纳米颗粒进一步用释放控制聚合物涂覆以控制内含 物释放的时间、提高颗粒的机械强度和/或稳定PBM纳米颗粒中的活性成分。适合的用于 释放控制涂层的聚合物包括但不限于聚己内酯（PCL)和聚乙二醇。在其它实施方式中，所 述PBM纳米颗粒可以被进一步涂布，与肿瘤特异性或细胞/组织特异性的祀向剂结合或修 饰。所述肿瘤特异性或细胞/组织特异性的靶向剂的实例包括但不限于赖氨酸、多肽、抗体 和叶酸。
[0065] 如图1所示，由于PEG-涂层和具有负的LogP值，可生物降解的行星球磨（PBM)纳 米颗粒具有提高的包封药物的血清半衰期。
[0066]目前有几种用于药物递送的纳米载体：聚合物、胶束、树枝状聚合物、脂质体、白蛋 白、病毒、碳纳米管以及氧化硅/金属。然而这些纳米颗粒存在一定的限制（即非均匀的尺 寸、难以制造和/或缺乏靶向），降低了它们的实用性。
[〇〇67] 在一些实施方式中，通过涂布口服抗癌剂(包括但不限于沙钼、卡培他滨、厄洛替 尼）配制成用于口服递送的PBM纳米颗粒。用于口服递送的纳米颗粒调节：用于肠道吸收 的表面logP值，在首过效应中水解的共聚物的添加，通过肝脏胆道系统无肝毒性地转运， 对原发或转移性肿瘤(包括乳腺癌和前列腺肿瘤)的靶向-全身性传递。也可制成制剂以包 括用于检测微转移灶和活化处理的基板。
[0068] 细胞毒性药剂
[〇〇69] 具有不同的胞内靶标的各种细胞毒性药剂可以诱导细胞凋亡的相同表型。这意味 着细胞毒性药剂的细胞毒素活性不是完全依赖于特定的药物-靶标相互作用，而且还依赖 于癌细胞的凋亡(细胞信号传导)系统的活性。细胞毒性药剂的实例包括但不限于基于钼的 药物(例如卡钼、顺钼、奥沙利钼、沙钼、三钼替群妥英和卡钼等)、天然的酚类(例如小豆蘧、 姜黄、高良姜、生姜、内亚胡椒、姜黄等)、植物生物碱和紫杉烷类(例如喜树碱、多西他赛、紫 杉醇、长春碱、长春新碱、长春瑞滨、长春新碱等)、其它的烷基化剂(例如六甲蜜胺、白消安、 卡莫司汀、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、达卡巴嗪、乙撑亚胺、六甲蜜胺、肼、异环磷酰胺、洛莫司 汀、氮芥、美法仑、亚硝基脲、胡椒碱、丙卡巴肼、链佐星、替莫唑胺、塞替派、三嗪等)、肿瘤抗 生素和蒽环类抗生素(例如博莱霉素、色霉素、更生霉素、柔红霉素、多柔比星、表柔比星、伊 达比星、丝裂霉素、米托蒽醌、普卡霉素等)、拓扑异构酶抑制剂(例如安吖啶、依托泊苷、伊 立替康、替尼泊苷、托泊替康等)、抗代谢物(例如5-氟尿嘧啶、6-硫鸟嘌呤、6-巯基嘌呤、腺 苷脱氨酶抑制剂、卡培他滨、克拉屈滨、阿糖胞苷、氟尿苷、氟达拉滨、吉西他滨、甲氨蝶呤、 奈拉滨、喷司他丁有丝分裂抑制剂、嘌呤拮抗剂、嘧啶拮抗剂等）以及杂抗肿瘤药(例如天 冬酰胺酶、贝沙罗汀、雌莫司汀、羟基脲、异维甲酸、米托坦、培门冬酶、类视黄酸、维A酸，等 等)。
[0070] 基于钼类的治疗法广泛使用，通过破坏DNA和通过细胞色素 C释放及随后的半胱 天冬酶激活来诱导细胞凋亡而发挥功能。许多化疗耐药的细胞系对于基于钼的药物(例如 多西紫杉醇和卡钼）更敏感。但是，这些药物有许多副作用，包括但不限于：嗜中性白血球 减少症、肝功能障碍、贫血（70%)、恶心（40%)、感染（20%)、神经肌肉功能障碍（15%)、肾 功能衰竭，以及可能的心脏毒性-接受此种治疗的患者死亡率上升为1. 7%。这些副作用意 味着需要创新方法，从而克服或规避药物疗效的内在机理、耐药性、毒性以及同时阻碍早期 原发性或预发性(例如，转移性三重阴性）疾病。
[0071] 尽管以多西他赛进行了广泛的临床试验，对于其功效和毒性仍有较高水平的不可 预测性，这限制了其应用。多西他赛由CYP3-介导的氧化进行代谢，，这导致具有降低了的 细胞毒性的代谢产物。这种排除途径部分是由药物外排转运体ABCB1支配，但在ABCB1基 因中的C1236T多态性显著地降低多西他赛清除率。也有证据表明，在编码的DNA修复基因 中的多态性(例如NER和BER)和代谢灭活酶可能有助于在抗肿瘤功效以及卡钼毒性方面的 个体差异。几种机制说明，赋予毒性，降低敏感性和对于卡钼(包括外排泵(例如ABCB1))的 耐受性，提高解毒酶，分别与NER和BER相关。在以基于钼类的疗法的背景下，这些多态性 可以减少NER/BERd的功能和钼-DNA损伤的修复。
[0072] 在一种具体的实施方式中，所述细胞毒性剂是姜黄素。在另一种实施方式中，所述 细胞毒性剂包含姜黄素和一种或多种其他细胞毒性剂。
[0073] 在另一种【具体实施方式】中，所述细胞毒性剂选自化疗剂、放射性偶联物、抗体、 siRNA、反义寡核苷酸、三链形成寡核苷酸以及对癌细胞有细胞毒性的任何其他药剂。
[0074] 在另一种实施方式中，所述化疗剂选自基于钼的药物、天然酚、植物生物碱和紫杉 烷类、其他烷化剂、肿瘤抗生素和蒽环类、拓扑异构酶抑制剂、抗代谢物以及各种抗肿瘤药 物。
[0075] 在又一种实施方式中，所述放射性偶联物包含选自212Bi、131I、 131In、9°Y、188Tu和 186Re的放射性同位素。
[0076] 在又一种实施方式中，所述抗体能够与选自以下的肿瘤相关抗原结合：腺苷受体、 α νβ 3整合素、氨肽酶Ρ、α -胎儿蛋白、癌抗原125、癌胚胎抗原、小窝蛋白1、趋化因子受 体、丛生蛋白、癌胚抗原、⑶20、上皮性肿瘤抗原、黑色素瘤相关抗原、Ras、Ρ53、Her2/Neu、 ErbB2、ErbB3、ErbB4、叶酸受体、前列腺特异性膜抗原、前列腺特异性抗原、嘌呤受体、辐射 诱导的细胞表面受体、丝氨酸蛋白酶抑制剂B3、丝氨酸蛋白酶抑制剂M、鳞状细胞癌抗原、 血小板反应蛋白、肿瘤抗原4、肿瘤相关糖蛋白72、酪氨酸酶和酪氨酸激酶。
[〇〇77] 在又一种实施方式中，所述对于癌细胞有细胞毒性的药剂选自白喉A链、白喉毒 素的非结合活性片段、外毒素 A链(来自铜绿假单胞菌)、蓖麻毒蛋白A链、相思豆毒蛋白 A链、蒴莲根毒素 A、α -帚曲霉素、油桐蛋白、石竹素蛋白、美洲商陆蛋白（PAPI、PAPII和 PAP-S)、苦瓜抑制剂、麻疯树毒蛋白、巴豆毒素、肥皂草抑制剂、白树毒素、丝林霉素、局限曲 霉素、酚霉素、依诺霉素、单端孢子菌霉菌毒素以及它们的片段。
[0078] 姜黄素
[0079] 姜黄素(姜黄素 diferuloylmethane)是一种来源于植物姜黄的多酚，通常称为姜 黄。其在印度草药学中保持高度地位，众所周知的作为"具有抗氧化剂、抗炎、抗致癌、抗增 殖和抗血管生成特性的身体清洁剂"的疏水性天然化合物。然而姜黄素的疏水性导致其生 物利用性差，这阻碍了姜黄素的功效和作为抗癌剂的有效作用。因此，关键的挑战是将姜黄 素直接递送到肿瘤细胞以提高其效用，并诱导癌细胞的死亡，同时防止损害正常细胞。
[0080] 能够克服姜黄素较差的生物利用性并避免网状内皮系统（RES)间隙的长循环纳米 颗粒会导致具有增加的通透性和有缺陷的淋巴引流(即增强通透性和保留EPR效应)的肿瘤 的聚集。这些纳米尺寸的媒介的吸收有许多优点，包括由于靶向给药而显著地减少全身毒 性。这些纳米颗粒防止化学抗性的出现也是合理的。纳米颗粒能够靶向并由前列腺肿瘤吸 收，会有效地递送姜黄素以扰乱细胞内的靶标，并在生物利用上充分地诱导肿瘤细胞的凋 亡过程。
[0081] 释放控制聚合物涂层
[0082] 所述释放控制聚合物涂层控制释放内含物的时间，增加涂层PBM纳米颗粒的机械 强度，和/或稳定PBM纳米颗粒的活性成分。适合的释放控制涂层的聚合物包括但不限于 聚乙二醇、聚己内酯（PCL)、化学改性PCL和它们的混合物。在一些实施方式中，所述控制释 放聚合物涂层PBM纳米颗粒进一步以针对特异性祀标(例如，肿瘤细胞或Treg细胞)的细胞 靶向药剂涂布、结合或修饰。
[0083] 细胞靶向药剂
[0084] 细胞靶向药剂允许含药物的纳米颗粒靶向附加物中的细胞的特定类型。细胞靶向 药剂的实例包括但不限于结合到或靶向肿瘤相关抗原的小分子(例如叶酸、腺苷、嘌呤）和 大分子(例如肽或抗体)。肿瘤相关抗原的实例包括但不限于腺苷受体、αΥβ 3、氨肽酶P、 α-胎儿蛋白、癌抗原125、癌胚胎抗原、小窝蛋白-1、趋化因子受体、丛生蛋白、癌胚抗原、 CD20、上皮性肿瘤抗原、黑色素瘤相关抗原、Ras、Ρ53、HER2/neu、ErbB2、ErbB3、ErbB4、叶酸 受体、前列腺特异性膜抗原、前列腺特异性抗原、嘌呤受体、辐射诱导的细胞表面受体、丝氨 酸蛋白酶抑制剂B3、丝氨酸蛋白酶抑制剂M、鳞状细胞癌抗原、血小板反应蛋白、肿瘤抗原 4、肿瘤相关糖蛋白72、酪氨酸酶以及和酪氨酸激酶。在一些实施方式中，细胞靶向药剂是与 叶酸受体（FRs)特异性结合的叶酸或叶酸衍生物。
[0085] 所述还原性叶酸载体（RFC)是低亲和力、高容量系统，其介导还原性叶酸在药理 (μ M)浓度下吸收到癌细胞中。生理叶酸的浓度在5至50nM的范围内。因此，存在高亲和 力的人FRs并由一个家族基因编码，其同源产物称为FRa、β、 Υ、δ型，其也分别描述为 FR1、FR2、FR3、FR4。膜同种型FR1、FR2和FR4可以结合并运输叶酸或叶酸衍生物进入细胞 内，而FR3缺少膜锚定点并从细胞中分泌。FR1和FR2分别以类似但不同的亲和力结合叶酸 和6S5-甲酰四氢叶酸（即亚叶酸钙)，亲和力L5nM对0·35ηΜ (叶酸）以及和800nM对7nM (亚叶酸钙)。6S5-甲基四氢叶酸是在血液中占主导地位的叶酸，并对于FR1和FR2具有相 似的亲和力，分别为55nM和InM。而PC3人前列腺癌细胞在培养基中不显著表达FR (例如 FR1 )，FRs是由PC3肿瘤表达。FRs还通过BrCa细胞表达，与不良后果或通过这些受体运输 叶酸(不管对于甲氨蝶呤的抗性）有关。
[0086] 大多数非增殖性组织缺乏功能性FR表达。在增殖性正常组织中的FR表达仅限于 某些上皮细胞的腔表面，从而无法进入循环。然而，在恶性肿瘤和白血病中存在的高水平的 FR2 (高亲和力受体）暴露于循环中，使得它们成为用于肿瘤特异性疗法的有吸引力的候选 者。肾脏(其中FR1 (中度亲和力受体）的表达在近端小管）由排除肾小球滤过的FR-靶向 性治疗来保护。进一步保护是肾叶酸保护机制的结果，其中，通过肾小管细胞的FR-介导的 内吞后，还有叶酸的迅速分解和运输穿过基底膜进入血液。
[〇〇87] 癌细胞的氨甲喋呤抗性主要依赖于在二氢叶酸还原酶基因中的变化，降低的细胞 内聚谷氨酸、增加的经由RFC流出和运输；由于这种治疗是通过FR结合和运输，仅仅适度地 影响甲氨蝶呤耐药肿瘤的作用，因此，不太可能存在对本申请的生物降解的行星球磨（PBM) 纳米颗粒的抗性。
[0088] 在PBM纳米颗粒中叶酸作为靶向剂的应用还允许肿瘤细胞和调节性T (Treg)细 胞。广泛认可的是，大量的Treg细胞抑制肿瘤的免疫力。具体而言，Treg细胞抑制(外部 和自身）反应性T细胞，而不是通过接触-依赖或细胞因子(例如IL-KKTGF-β等）分泌杀 死它们。FR4在Treg细胞中选择性地上调。已经表明FR4的抗体阻断耗尽Treg细胞并引 起荷瘤小鼠的肿瘤免疫。因此，携带细胞毒性剂的叶酸-涂层PBM纳米颗粒将吸收用于其 破裂的FR-表达细胞，其包括直接（即BrCa细胞）和间接（S卩乳腺肿瘤相关及周边Treg细 胞）抑制肿瘤发展。
[0089] 在另一种实施方式中，所述靶向剂是能够结合肿瘤相关抗原的选自但不限于以下 各项的抗体或肽：腺苷受体、ανβ 3、氨肽酶Ρ、α-胎儿蛋白、癌抗原125、癌胚胎抗原、小 窝蛋白-1、趋化因子受体、丛生蛋白、癌胚抗原、CD20、上皮性肿瘤抗原、黑色素瘤相关抗原、 RAS、P53、HER2/neu、ErbB2、ErbB3、ErbB4、叶酸受体、前列腺特异性膜抗原、前列腺特异性 抗原、嘌呤受体、辐射诱导的细胞表面受体、丝氨酸蛋白酶抑制剂B3、丝氨酸蛋白酶抑制剂 B4、鳞状细胞癌抗原、血小板反应蛋白、肿瘤抗原4、肿瘤相关糖蛋白72、酪氨酸酶、酪氨酸 激酶等。
[0090] 治疗方法
[0091] 本申请的另一个方面涉及用于在所需要受试者中治疗癌症的方法，其包括给所述 受试者施用有效量的包括含有细胞毒性剂和细胞祀向剂的行星球磨（PBM)纳米颗粒的药物 组合物。在一些实施方式中，所述细胞靶向剂是叶酸或叶酸衍生物。
[0092] 含有药物的PBM纳米颗粒是能够抗巨噬细胞的吞噬作用并避免网状内皮系统 (RES)间隙的长循环纳米颗粒，这反过来，将导致具有增加的透气性和有缺陷的淋巴引流 (即增强通透性和保留-EPR效应)的肿瘤积聚。这些纳米尺寸的载体的吸收有许多益处。由 于靶向递送，本申请的含药物的PBM纳米颗粒显著地减少全身毒性。
[0093] 在其它实施方式中，本申请的含药物的PBM纳米颗粒防止耐药性的出现。耐药性 通过两个主要机制介导：（i)足够量的细胞毒性药物未到达所述祀向细胞(和胞内作用位 点)和（ii)细胞凋亡机制的诱导后未能完成细胞死亡。能够靶向并由乳腺肿瘤吸收的纳米 颗粒有效地递送化学治疗剂和细胞内的靶标，并携带足够的药物以完成细胞凋亡过程。
[0094] 在一些实施方式中，所述癌症选自癌、肉瘤、淋巴瘤、白血病、生殖细胞肿瘤和生殖 细胞瘤。
[0095] 在另一种实施方式中，所述癌是前列腺癌。在一些其它实施方式中，所述癌症是前 列腺癌并且本申请的药物组合物有效量的维生素 D结合施用。在一些男性的极低的维生素 D状态也在PCa过程中显示。此外，抗癌药物相关的低钙血症通常是温和的，但如果患者有 预先存在维生素 D缺乏，则可能是严重的。由于基于钼类的癌症治疗和调节NER基因的靶 标以调节DNA修复(这有助于前列腺癌的发展和对药物的反应)，维生素 D能有效防止肾毒 性。
[0096] 在又一种实施方式中，所述癌是乳腺癌。
[0097] 在另一种【具体实施方式】中，所述细胞毒性剂是姜黄素。
[〇〇98] 在另一种【具体实施方式】中，所述细胞毒性剂选自化疗剂、放射性偶联物、抗体、 siRNA、反义寡核苷酸、三链形成寡核苷酸以及对癌细胞有细胞毒性的任何其他药剂。
[0099] 在另一种实施方式中，所述化疗剂选自基于钼的药物、天然酚、植物生物碱和紫杉 烷类、其他烷化剂、肿瘤抗生素和蒽环类、拓扑异构酶抑制剂、抗代谢物以及各种抗肿瘤药 物。
[0100] 在又一种实施方式中，所述放射性偶联物包含选自212Bi、131I、 131In、9°Y、188Tu和 186Re的放射性同位素。
[〇1〇1] 在又一种实施方式中，所述能够结合肿瘤相关抗原的抗体或肽包括但不限于以下 各项：腺苷受体、ανβ 3、氨肽酶Ρ、α-胎儿蛋白、癌抗原125、癌胚胎抗原、小窝蛋白-1、 趋化因子受体、丛生蛋白、癌胚抗原、⑶20、上皮性肿瘤抗原、黑色素瘤相关抗原、RAS、Ρ53、 HER2/neu、ErbB2、ErbB3、ErbB4、叶酸受体、前列腺特异性膜抗原、前列腺特异性抗原、嘌呤 受体、辐射诱导的细胞表面受体、丝氨酸蛋白酶抑制剂B3、丝氨酸蛋白酶抑制剂M、鳞状细 胞癌抗原、血小板反应蛋白、肿瘤抗原4、肿瘤相关糖蛋白72、酪氨酸酶、酪氨酸激酶等。
[0102] 在又一种实施方式中，对癌细胞有细胞毒性的试剂选自白喉毒素 A链、白喉毒素 的非结合活性片段、外毒素 A链(来自铜绿假单胞菌)、蓖麻毒素 A链、相思豆毒蛋白A链，蒴 莲根毒素 A链、α -帚曲霉素、油桐蛋白、石竹蛋白、美洲商陆蛋白（PAPI、PAPII和PAP-S)、 苦瓜抑制剂、麻疯树毒蛋白、巴豆毒素、肥皂草抑制剂、白树毒素、丝林霉素、局限曲菌素、酚 霉素、伊诺霉素和单孢霉烯族毒素，以及它们的片段。
[0103] 在另一种【具体实施方式】中，所述细胞毒性剂包括天然苯酚和选自化学治疗剂、放 射性偶联物、抗体、肽、siRNA、反义寡核苷酸、三链形成寡核苷酸以及对癌细胞有细胞毒性 的任何其他药剂中的一种或多种其他细胞毒性剂。
[0104] 本申请的另一个方面涉及在需要的受试者中抑制癌转移，包括对所述受试者施用 有效量的包括含有细胞毒性剂和细胞靶向剂的行星球磨（PBM)纳米颗粒的药物组合物。在 一些实施方式中，所述细胞靶向剂是叶酸或叶酸衍生物。
[0105] 在一种【具体实施方式】中，所述癌症选自癌、肉瘤、淋巴瘤、白血病、生殖细胞肿瘤和 胚细胞瘤。
[0106] 在另一种实施方式中，所述癌是前列腺癌。
[0107] 在又一种实施方式中，所述癌是乳腺癌。
[0108] 在另一种【具体实施方式】中，所述细胞毒性剂是姜黄素。
[0109] 在另一种【具体实施方式】中，所述所述细胞毒性剂选自化学治疗剂、放射性偶联物、 抗体、肽、siRNA、反义寡核苷酸、三链形成寡核苷酸以及对癌细胞有细胞毒性的任何其他药 剂。
[〇11〇] 在另一实施方式中，所述化疗剂选自基于钼的药物、天然酚、植物生物碱和紫杉烷 类、其他烷化剂、肿瘤抗生素和蒽环类、拓扑异构酶抑制剂、抗代谢物以及各种抗肿瘤药物。
[0111] 在又一种实施方式中，所述放射性偶联物包含选自212Bi、131I、 131In、9°Y、188Tu和 186Re的放射性同位素。
[0112] 在又一种实施方式中，所述能够结合肿瘤相关抗原的抗体或肽包括但不限于以下 各项：腺苷受体、ανβ 3、氨肽酶Ρ、α-胎儿蛋白、癌抗原125、癌胚胎抗原、小窝蛋白-1、 趋化因子受体、丛生蛋白、癌胚抗原、⑶20、上皮性肿瘤抗原、黑色素瘤相关抗原、RAS、Ρ53、 HER2/neu、ErbB2、ErbB3、ErbB4、叶酸受体、前列腺特异性膜抗原、前列腺特异性抗原、嘌呤 受体、辐射诱导的细胞表面受体、丝氨酸蛋白酶抑制剂B3、丝氨酸蛋白酶抑制剂M、鳞状细 胞癌抗原、血小板反应蛋白、肿瘤抗原4、肿瘤相关糖蛋白72、酪氨酸酶、酪氨酸激酶等。
[0113] 在又一种实施方式中，对癌细胞有细胞毒性的试剂选自白喉毒素 A链、白喉毒素 的非结合活性片段、外毒素 A链(来自铜绿假单胞菌)、蓖麻毒素 A链、相思豆毒蛋白A链，蒴 莲根毒素 A链、α -帚曲霉素、油桐蛋白、石竹蛋白、美洲商陆蛋白（PAPI、PAPII和PAP-S)、 苦瓜抑制剂、麻疯树毒蛋白、巴豆毒素、肥皂草抑制剂、白树毒素、丝林霉素、局限曲菌素、酚 霉素、伊诺霉素和单孢霉烯族毒素，以及它们的片段。
[0114] 在另一种【具体实施方式】中，所述细胞毒性剂包括姜黄素和选自化学治疗剂、放射 性偶联物、抗体、肽、siRNA、反义寡核苷酸、三链形成寡核苷酸以及对癌细胞有细胞毒性的 任何其他药剂中的一种或多种其他细胞毒性剂。
[0115] 在另一种【具体实施方式】中，靶向配体包括能够与以下肿瘤相关抗原结合的抗体或 肽，但不限于此：腺苷受体、ανβ3、氨肽酶Ρ、α-胎儿蛋白、癌抗原125、癌胚胎抗原、小窝 蛋白-1、趋化因子受体、丛生蛋白、癌胚抗原、CD20、上皮性肿瘤抗原、黑色素瘤相关抗原、 RAS、P53、HER2/neu、ErbB2、ErbB3、ErbB4、叶酸受体、前列腺特异性膜抗原、前列腺特异性 抗原、嘌呤受体、辐射诱导的细胞表面受体、丝氨酸蛋白酶抑制剂B3、丝氨酸蛋白酶抑制剂 B4、鳞状细胞癌抗原、血小板反应蛋白、肿瘤抗原4、肿瘤相关糖蛋白72、酪氨酸酶、酪氨酸 激酶等。
[0116] 本申请的另一个方面涉及在需要的受试者中诱导调节性T (Treg)细胞的细胞 凋亡，其包括：对所述受试者施用有效量的包括含有细胞毒性剂和细胞靶向剂的行星球磨 (PBM)纳米颗粒的药物组合物。在一些实施方式中，所述细胞靶向剂是叶酸或叶酸衍生物。
[0117] 本发明的另一个方面涉及含有一种以上的化学治疗剂的叶酸涂层的可生物降解 的PBM纳米颗粒在治疗癌症的发展中的应用。负载多西紫杉醇或卡钼的叶酸涂覆PBM纳米 颗粒增强了对肿瘤的治疗效果，降低毒性，并通过靶向和诱导BrCa细胞和Treg细胞的细胞 凋亡以增加肿瘤免疫力。
[0118] 本申请的另一个具体方面涉及涂布有叶酸的负载姜黄素的PBM纳米颗粒的靶向 递送以增强体内效力并改进现有的化学预防癌症的策略。
[0119] 本发明的另一个方面是与受试者预先的治疗结合，给受试者用含有细胞毒性剂的 PBM纳米颗粒治疗，同时或之后，用至少一种治疗有效量的其它治疗剂(包括但不限于不包 含在PBM纳米颗粒的姜黄素或化疗剂)。在一些实施方式中，所述不包含在PBM纳米颗粒中 的化学治疗剂选自卡钼、顺钼、多西他赛和奥沙利钼。
[0120] 本申请的药物组合物可以用已知的方法对受试者给药，例如作为推注的或通过连 续输注一段时间的静脉内给药、通过肌内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、 口服、局部或吸入途径。在某些实施方式中，本申请的药物组合物直接给药至肿瘤或癌组 织，包括在侵入性手术中直接给药至肿瘤床。本申请的药物组合物也可以放置在固体支持 物(例如海绵或纱布)上施加到受感染的组织中。本申请的含有细胞毒性剂的PBM纳米颗粒 可以以通常接受的药学上可接受的载体来施用。可接受的载体包括但不限于生理盐水、缓 冲盐水和生理盐水中的葡萄糖。
[0121] 例如，适当剂量("治疗有效量"）的本申请的药物组合物取决于待治疗的疾病、病 情的严重程度和状态进程、本申请的药物组合物给药是用于预防还是治疗目的、先前的疗 法、患者的临床史、对包含在所述药物组合物中的细胞毒性剂的反应、所使用的细胞毒性剂 的种类以及主治医师的诊断。本申请的药物组合物可以适当地一次或在一系列治疗中施用 给患者，并且可以在自诊断起的任何时间施用给患者。本申请的药物组合物可以作为单独 治疗或者与对于所讨论的治疗状态中有用的其他药物或疗法相结合来给药。
[0122] 在一些实施方式中，本申请的药物组合物含有姜黄素，以0. lmg/kg至100mg/kg、 0· 5mg/kg 至 100mg/kg、0. lmg/kg 至 50mg/kg、0. 5mg/kg 至 50mg/kg、l. Omg/kg 至 20mg/kg、 2. 5mg/kg至50mg/kg、2. 5mg/kg至20mg/kg以及5mg/kg至lOmg/kg的日姜黄素剂量范围给 药。含姜黄素的PBM纳米颗粒可以连续给药，每小时，每天4次，每天3次，每天2次，每天 一次，或者每2、3、4、5、6和7天一次，或者每1、2、3或4周一次。
[0123] 作为一般的建议，无论是通过一次或多次给药，包含在PBM纳米颗粒中的治疗有 效量的每种细胞毒剂(例如姜黄素或顺钼)，以约lng/kg体重/天至约100mg/kg体重/天 的范围给药。在一种【具体实施方式】中，包含在PBM纳米颗粒中的每种细胞毒剂以以下范围 给药：从约lng/kg体重/天至约lOmg/kg体重/天、约lng/kg体重/天至约lmg/kg体重 /天、约lng/kg体重/天至约100 μ g/kg体重/天、约lng/kg体重/天至约10 μ g/kg体重 /天、约lng/kg体重/天至约1 μ g/kg体重/天、约lng/kg体重/天至约100ng/kg体重/ 天、约lng/kg体重/天至大约10ng/kg体重/天、约10ng/kg体重/天至约100mg/kg体重 /天、约l〇ng/kg体重/天至约10mg/kg体重/天、约10ng/kg体重/天至约lmg/kg体重/ 天、约10ng/kg体重/天至约100 μ g/kg体重/天、约10ng/kg体重/天至大约10 μ g/kg 体重/天、约l〇ng/kg体重/天至约1 μ g/kg体重/天、10ng/kg体重/天至约100ng/kg体 重/天、约l〇〇ng/kg体重/天至约100mg/kg体重/天、约100ng/kg体重/天至约10mg/kg 体重/天、约l〇〇ng/kg体重/天至约lmg/kg体重/天、约100ng/kg体重/天至约100 μ g/ kg体重/天、约l〇〇ng/kg体重/天至约10μ g/kg体重/天、约100ng/kg体重/天至约 1 U g/kg体重/天、约1 μ g/kg体重/天至约100mg/kg体重/天、约1 μ g/kg体重/天至约 10mg/kg体重/天、约1 μ g/kg体重/天至约lmg/kg体重/天、约1 μ g/kg体重/天至约 100 μ g/kg体重/天、约1 μ g/kg体重/天至约10 μ g/kg体重/天、约10 μ g/kg体重/天 至约100mg/kg体重/天、约10 μ g/kg体重/天至约10mg/kg体重/天、约10 μ g/kg体重/ 天至约lmg/kg体重/天、约10 μ g/kg体重/天至约100 μ g/kg体重/天、约100 μ g/kg体 重/天至约l〇〇mg/kg体重/天、约100 μ g/kg体重/天至约10mg/kg体重/天、约100 μ g/ kg体重/天至约lmg/kg体重/天、约lmg/kg体重/天至约100mg/kg体重/天，约lmg/kg 体重/天至约l〇mg/kg体重/天、约10mg/kg体重/天至约100mg/kg体重/天。
[0124] 在另一种实施方式中，包含在PBM纳米颗粒中的每种细胞毒性剂以以下范围给 药：每个体给药约10ng至约100ng、每个体给药约10ng到约1 μ g、每个体给药约10ng到约 10以8、每个体给药约1〇1^到约100以8、每个体给药约1〇1^到约111^、每个体给药约1〇1^ 到约10mg、每个体给药约10ng至约100mg、每次注射约10ng至约lOOOrng、每个体给药约 l〇ng到约10, OOOrng、每个体给药约100ng至约1 μ g、每个体给药约100ng至约10μ g、每 个体给药约l〇〇ng至约100yg、每个体给药约100ng至约lmg、每个体给药约100ng至约 10mg、每个体给药约100ng至约100mg、每次注射约100ng至约lOOOrng、每个体给药约100ng 至约10,000mg、每个体给药约lyg到约10yg、每个体给药约lyg到约lOOyg、每个体 给药约1 μ g到约lmg、每个体给药约1 μ g到约10mg、每个体给药约1 μ g到约100mg、每 次注射约1 μ g到约l〇〇〇mg、每个体给药约1 μ g到约10, OOOmg、每个体给药约10 μ g到约 100 μ g、每个体给药约10 μ g到约lmg，每个体给药约10 μ g到约10mg、每个体给药约10 μ g 到约100mg、每次注射约10 μ g到约lOOOrng、每个体给药约10 μ g到10, OOOrng、每个体给药 约100 μ g到约lmg、每个体给药约100 μ g至约10mg、每个体给药约100 μ g至约100mg、每 次注射约100 μ g至约l〇〇〇mg、每个体给药约100 μ g至约10, OOOrng、每个体给药约lmg至 约10mg、每个体给药约lmg到约100mg、每次注射约lmg至约lOOOrng、每个体给药约lmg到 约10,000mg、每个体给药约10mg至约100mg、每次注射约10mg至约lOOOrng、每个体给药约 10mg至约10, OOOmg、每次注射约lOOmg至约lOOOmg、每个体给药约lOOmg至约10, OOOmg以 及每个体给药约lOOOmg到约10,000mg。包含在PBM纳米颗粒中的化学治疗剂可以每天、或 每2、3、4、5、6和7天、或每1、2、3或4周给药。
[0125] 在其他的【具体实施方式】中，包含在PBM纳米颗粒中的每种细胞毒性剂的给药量为 或是约为：〇· 〇〇〇6mg/ 天、0· OOlmg/ 天、0· 003mg/ 天、0· 006mg/ 天、0· Olmg/ 天、0· 03mg/ 天、 0· 06mg/天、0· lmg/天、0· 3mg/天、0· 6mg/天、lmg/天、3mg/天、6mg/天、10mg/天、30mg/天、 60mg/天、lOOmg/天、300mg/天、600mg/天、lOOOmg/天、2000mg/天、5000mg/天或 10, OOOmg/ 天。正如预期的那样，所述剂量取决于患者的病情、体重、年龄和状况。正如预期的那样，所 述剂量取决于患者的病情、体重、年龄和状况。
[0126] 所述含有细胞毒性剂的PBM纳米颗粒可以按照适当地或表明的通过丸剂或通过 连续输注的单剂量，或通过丸剂或通过连续输注作为多剂量来给药。例如，多剂量可以每天 多次，每日一次，每2、3、4、5、6或7天，每周，每2、3、4、5或6周或每月一次给药。然而，其 它剂量方案也可利用。此疗法的进程易于通过常规技术来监测。
[0127] 在本发明的【具体实施方式】中，治疗有效量的含有细胞毒性剂的PBM纳米颗粒可以 作为唯一的治疗剂给需要的受试者给药。在【具体实施方式】中，治疗有效量的含有细胞毒性 剂的PBM纳米颗粒杀死肿瘤或癌症细胞或促进其凋亡。在另一种【具体实施方式】中，治疗有 效量的含有细胞毒性剂的PBM纳米颗粒抑制或防止肿瘤或癌的形成。在进一步的具体实施 方式中，治疗有效量的含有细胞毒性剂的PBM纳米颗粒抑制或防止肿瘤或癌细胞从现有的 肿瘤或癌细胞中的迁移或转移。在又一【具体实施方式】中，治疗有效量的含有细胞毒性剂的 PBM纳米颗粒抑制或防止肿瘤或癌症细胞侵入非癌组织。
[0128] 在本发明的【具体实施方式】中，治疗有效量的含有细胞毒性剂的PBM纳米颗粒可以 与一种或多种附加的治疗有效的细胞毒性剂结合以施用给需要的受试者。一种或多种附加 的治疗有效的细胞毒性剂也可以在具有细胞毒性剂的PBM纳米颗粒施用之前、与其同时、 和/或之后来施用。
[0129] 在具体的实施方式中，治疗有效量的含有细胞毒性剂的PBM纳米颗粒增强所述的 一种或多种附加的治疗学上有效的细胞毒性剂杀死肿瘤或癌症细胞的有效性。在一种更具 体的实施方式中，治疗有效量的包含细胞毒性剂的PBM纳米颗粒减少了所述的一种或多种 附加的治疗学上有效的细胞毒性剂用于杀死肿瘤或癌症细胞所需要的量。在一种更具体的 实施方式中，治疗有效量的含有细胞毒性剂的PBM纳米颗粒抑制或防止肿瘤或癌症细胞从 已形成的肿瘤或癌迁移或转移，增强所述的一种或多种附加的治疗学上有的细胞毒性剂杀 死肿瘤或癌症细胞的局部有效性。在又一种【具体实施方式】中，治疗有效量的含有细胞毒性 剂的PBM纳米颗粒抑制或防止肿瘤或癌症细胞向非癌组织侵入，增强所述的一种或多种附 加的治疗学上有效的细胞毒性剂杀死肿瘤或癌症细胞的局部有效性。
[0130] 在另一种实施方式中，所述的PBM纳米颗粒包含对癌细胞具有细胞毒性的药剂。 在一些实施方式中，所述对癌细胞具有细胞毒性的药剂选自白喉毒素 A链、白喉毒素的非 结合活性片段、外毒素 A链(来自铜绿假单胞菌)、蓖麻毒素 A链、相思豆毒蛋白A链、蒴莲 根毒素 A链、α -帚曲霉素、油桐蛋白、石竹蛋白、美洲商陆蛋白（PAPI、PAPII和PAP-S)、苦 瓜抑制剂、麻疯树毒蛋白、巴豆毒素、肥皂草抑制剂、白树毒素、丝林霉素、局限曲菌素、酚霉 素、伊诺霉素和单孢霉烯族毒素，以及它们的片段。
[0131] 本发明通过下面的实施例进一步说明，而不应该解释为限制。本申请引用的所有 参考文献、专利和公开的专利申请，以及图和表的内容，通过引用并入本发明。
[0132] 实施例1 :制各行星球磨纳米颗粒
[0133] 首先，将10%至15% (w/v)的藻酸盐、纤维素、胶原蛋白、淀粉、乳糖、其它生物聚 合物或它们的混合物(赋形剂/生物聚合物)溶解在水中，并使用均化器混合。接着，将10% 至20% (w/v)的蛋白质(例如BSA或IgG)或大分子(例如礼、紫杉醇和顺钼等）（w/v)在 4°C下加入到赋形剂/生物聚合物溶液中。接着，将10% PEG (w/v)加入到生物聚合物-细 胞毒性剂溶液中，并搅拌30分钟。离心后，将溶液倒入约3mm3压片机并干燥。然后在控制 的温度条件下（<37°C)用行星式球磨机研磨上述药片。所得到的颗粒可以单独使用（即未 涂覆的)，或者通过在l〇〇〇rpm的连续搅拌下涂布5%、10%或20%的？(^溶液(在二氯甲烷 中）。最后用水漂洗PCL包衣生物聚合物-PEG颗粒，干燥并以粉末贮存。
[0134] PCL活化和肽偶联：活化PCL以将肽或底物(例如叶酸）连接到其表面上用于 颗粒的靶向递送。首先，将2g的PCL溶解于6ml无水二噁烷中，并在50°C的水浴中 加热2小时以溶解聚合物，然后冷至室温（RT)。2ml的Ν，Ν'-二琥珀酰亚胺基碳酸酯 (Ν, Ν' disuccinimidylcarbonate) (153. 7mg/ml，在无水丙酮中）和 2ml 批陡溶液（4. 745mg/ ml，在无水丙酮中）与PCL悬浮液在室温下连续搅拌下6小时进行混合。然后用具有1 μ m 孔隙尺寸的G2玻璃纤维过滤该混合物以除去沉淀物。用4体积的乙醚将得到的上清液沉 淀。沉淀物在丙酮中再悬浮，用乙醚再次沉淀。然后干燥已活化的或活性的PCL，并于4°C 下贮存。
[0135] 然后将活化的PCL偶联到赖氨酸或来自肽的任何游离胺基。将所需的肽或氨基酸 (例如赖氨酸)溶解在〇. 1M Na.取代.2HP04、0. 1M硼酸，2mg/ml的浓度，pH值为8. 5。接着， 在4°C下将所述溶解在乙腈中的活化的PCL与肽或氨基酸以8:1的比例（活化的PCL :肽或 氨基酸）搅拌混合过夜，用玻璃滤器过滤除去过量的活化未偶联的PCL。
[0136] 颗粒的涂覆：用溶解在二氯甲烷中的各种浓度(例如5%、10%和10%)的PCL或结 合胺的PCL连续搅拌（lOOOrmp)涂布已知量和尺寸的颗粒。通过离心分离后除去上清液， 将所得到的PCL涂覆颗粒从PCL涂布液中分离。所得PCL涂覆的纳米球经过过滤、风干，在 4°C下贮存。
[0137] 热分析：使用珀金埃尔默钻石DSC (PerkinElmer Diamond DSC)进行差示扫描量热 法（DSC)和热重/差热分析。首先，在氮气氛中，以恒定的速率(每分钟10°C )将约lmg颗 粒从30°C加热到250°C。然后完成颗粒的热重曲线。
[0138] 蛋白质负载的量化和表征：在其内含物结合之后，在37°C下，进行了 pH为7. 4的 磷酸盐缓冲盐水中PCL包覆的生物聚合物PEG颗粒的体外释放研究。在37°C下，将约100mg 颗粒在100ml PBS或柠檬酸tris缓冲液中悬浮并消化以确定其释放速率。还使用0. 1、0. 22 或0. 45 μ m的微孔过滤器过滤颗粒。含蛋白质的内含物溶解于PBS或柠檬酸tris缓冲盐 水中，并使用洛瑞蛋白质测定法（Lowry's protein assay)测定释放速率。在聚合物包衣的 微粒的情况下，每48小时收集样品，同时更换PBS以模仿宿主的无限渗透状态。
[0139] 圆二色性光谱分析也用于评价分子组装相比于标准或包封蛋白（例如BSA或IgG) 的规律性。通过测量它们的以△ ε方式表示的圆二色性并将它们与作为标准的未封装的 蛋白质比较以确定释放的蛋白质的分子内结构(例如α-螺旋、β片层等）的构象。
[0140] 颗粒大小、电荷和形态分析：通过使用马尔文颗粒大小和电荷分析仪(激光粒度 仪）对颗粒进行激光衍射分析其粒径。颗粒分散在dH 20中，分析电荷和大小。用扫描电子 显微镜（SEM)表征PCL涂覆的生物聚合物PEG颗粒的表面形态。对于SEM分析，颗粒是通过 将干燥的颗粒分配到粘在铝桩的双面粘合带的一侧来制备。然后使用极化SC S00-喷射涂 布机用金涂覆该桩，至其厚度为20至30nm。然后将样品引入到扫描电子显微镜的样品室， 并检测表面形态。通过首先将lmg样品和lOOmg干燥溴化钾粉末混合以得到的PCL包覆生 物聚合物-PEG颗粒制剂的不同阶段的红外光谱。接着，使用傅里叶变换红外光谱仪测定样 品的红外光谱。
[0141] 对于将纳米颗粒上浆，以下的方向提供指导。在一般情况下，通过使用填充有一 到三个20mm和10至60个10mm的球和待包裹样品和赋形剂的50ml的研磨罐，并使用保 持在200至400rmp的研磨速度，以控制粒度范围为5至30nm、30至180nm、0. 2至1 μ m、1 至6 μ m、4至12 μ m或10至60 μ m。该研磨间隔时间应设置为10分钟，随后进行15分钟 的静止周期。10至25个循环(研磨和静止）允许>99. 5 %的颗粒尺寸范围为5至30nm、30 至180nm、0. 2至Ιμπκ?至6μ m、4至12 μ m或10至60 μ m。当研磨罐的尺寸增大到>50ml (例如125ml、500ml等)，球的数量随罐体积的增加而成比例的增加。
[0142] 通过研磨球和活动-静止周期的颗粒尺寸调节的实例：使用填充有三个20mm和 10个10mm的球和待包裹样品和赋形剂的50ml的研磨罐，并使用保持在400rmp的研磨速 度，可以获得范围为5至30nm的颗粒尺寸。该研磨间隔时间应设置为10分钟，随后进行 15分钟的静止周期。15至25个周期(研磨和静止)导致>99. 5%的颗粒尺寸范围从5nm到 30nm〇
[0143] 使用填充有三个20mm和10个10mm的球和待包裹样品和赋形剂的50ml的研磨罐， 并使用保持在400rmp的研磨速度，可以获得范围为30至180nm的颗粒尺寸。该研磨间隔 时间应设置为10分钟，随后进行15分钟的静止周期。15至20个周期(研磨和静止）导致 >99. 5%的颗粒尺寸范围从30至180nm。
[0144] 使用填充有三个20mm和10个10mm的球和待包裹样品和赋形剂的50ml的研磨罐， 并使用保持在300rmp的研磨速度，可以获得范围为0. 2至1 μ m的颗粒尺寸。该研磨间隔 时间应设置为10分钟，随后进行15分钟的静止周期。15至20个周期(研磨和静止）导致 >99.5%的颗粒尺寸范围从0.2至1以111。
[0145] 使用填充有2个20mm和13个10mm的球和待包裹样品和赋形剂的50ml的研磨 罐，并使用保持在300rmp的研磨速度，可以获得范围为1至6 μ m的颗粒尺寸。该研磨间隔 时间应设置为10分钟，随后进行15分钟的静止周期。20至25个周期(研磨和静止）导致 >99. 5%的颗粒尺寸范围从1至6μπι。
[0146] 使用填充有2个20mm和13个10mm的球和待包裹样品和赋形剂的50ml的研磨 罐，并使用保持在250rmp的研磨速度，可以获得范围为4至12 μ m的颗粒尺寸。该研磨间 隔时间应设置为10分钟，随后进行15分钟的静止周期。15至20个周期(研磨和静止）导 致>99. 5%的颗粒尺寸范围从4至12 μ m。
[0147] 使用填充有1个20mm和16个10mm的球和待包裹样品和赋形剂的50ml的研磨罐， 并使用保持在200rmp的研磨速度，可以获得范围为10至60 μ m的颗粒尺寸。该研磨间隔 时间应设置为10分钟，随后进行15分钟的静止周期。10至15个周期(研磨和静止）导致 >99. 5%的颗粒尺寸范围从10至60 μ m。
[0148] 赋形剂/生物聚合物浓度对颗粒特性的影响：用在dH20赋形剂/生物聚合物溶液） 中约10% (w/v)的藻酸钠、约8% (w/v)纤维素或约10% (w/v)淀粉生产具有不同尺寸 的颗粒（5nm至60μπι土平均尺寸的10%)。低于2% (w/v)的藻酸钠、纤维素或淀粉，发现 平均尺寸变化不大于10%的颗粒的产率较低。在大于15%的海藻酸钠或10%的纤维素时， 赋形剂/生物聚合物溶液保持高粘性，不能用于片剂形成和随后的颗粒制备。类似地，淀粉 (赋形剂/生物聚合物）溶液需要加热到50°C维持20分钟，以获得最佳的溶解性和粘度，淀 粉的浓度不能超过12% (w/v)。
[0149] 赋形剂/生物聚合物溶液的粘度也对颗粒的形态具有显著的影响。随着赋形剂/ 生物聚合物溶液浓度（>1 % (w/v))的增加，颗粒变得更光滑和球形的。然而，〈10%的赋形 剂/生物聚合物溶液产生出理想的颗粒尺寸。在藻酸钠、纤维素或淀粉的浓度（w/v)分别 为10%、8%或10%时，对于纳米或微颗粒的产生实现了最佳的产率。因此，在随后的研究 中，准备上述最佳浓度用于研磨成颗粒的3mm 3片剂的产生。
[0150] 研磨速度和行星球的尺寸对于颗粒尺寸的影响：如上面的实例所示，行星球磨装 置的研磨速度（RetschPMlOO)和研磨球的尺寸在控制颗粒大小方面发挥了显著作用。改变 转速从0到lOOrpm进行20分钟，并用10个10mm加3个20mm的球，导致颗粒尺寸范围从 20至50 μ m ;而以速度为100至200rpm的转速进行20分钟，得到10至20 μ m的微粒。调 节速度为200至300rpm的转速进行20分钟，并使用50个5mm加15个10mm球，导致颗粒 尺寸范围从1至5 μ m。增加转速从300到400rpm，并使用100个5mm球，导致颗粒尺寸范 围为〇. 5至1 μ m。
[0151] 先研磨片剂产生-20至50 μ m尺寸的微粒以产生<500nm的颗粒。使用100个3mm 球加500个2mm球在400至600rpm下将所得到的微粒进一步研磨20分，以产生尺寸范围 为5至500nm的纳米颗粒。再进一步增加速度并未对尺寸的减小有任何显著的效果。
[0152] 颗粒蛋白截留和负载效率：BSA负载可以从4至25% (w/v)变化。在>20% (w/ v)负载蛋白时，研磨后形成的产物颗粒积聚且形态异常。在纳米或微颗粒中具有100%的 效率的BSA负载的可以实现的最1?限为约20%。
[0153] 无涂层的和PCL-涂层的生物聚合物-PEG颗粒的形态：由SEM来看，显而易见的 是，与无涂层颗粒相比，通过PCL-涂层修饰的颗粒表面表现平整、均匀。以多种PCL涂布的 颗粒表面特征出现额外的平滑。然而，在体外释放内含物之后，颗粒的表面由光滑球形变为 粗糙的、非球形的，并形成空泡。
[0154] 实施例2 :肿瘤相关抗原配体涂层和负载对乳腺癌细朐的化学治疗剂的PBM纳米 颗粒
[0155] 用于偶联至叶酸的聚己内酯-聚乙二醇共聚物涂布?20nm直径的负载细胞毒性 药物的可生物降解的行星球磨（PBM)纳米颗粒。叶酸涂布的PBM纳米颗粒进一步负载多西 紫杉醇、卡钼或顺钼。使用20 μ Μ的顺钼溶液的初级细胞和细胞系的孵化，导致在24小时 的培养后，81^&细胞（1〇^-7、10^-1^-231和41'1)和正常(初级）乳房上皮细胞的>90%的 细胞死亡。然而，含有10倍以下的化学治疗剂的ΡΒΜ纳米颗粒被吸收，并分别诱导与顺钼、 多西紫杉醇或卡钼溶液相同水平的BrCa细胞凋亡，但不是原发性乳腺上皮细胞。此外，通 过静脉注射接受顺钼溶液（8mg/kg/周）或顺钼包裹叶酸涂布的PBM纳米颗粒(相当于顺钼 剂量=0. 08mg/kg/周）的携带乳腺肿瘤的小鼠产生显著的（以及类似的）肿瘤消退。接受顺 钼溶液的小鼠比天然的或PBM纳米颗粒处理过的小鼠具有显著更高的肾脏和肝脏的毒性。 据了解，类似表达高水平的叶酸受体a (FRa/FRl)的肿瘤细胞，T调节性（Treg)细胞表达 FRY (FR4)，并且FR4阻断增强的肿瘤免疫。因此，本申请的新型PBM纳米颗粒增强BrCa 治疗效果，降低毒性，提高乳腺肿瘤免疫。
[0156] PBM纳米颗粒(含卡钼或紫杉醇）介导的肿瘤消退是具有特征的。纳米颗粒可用 于治疗MDA-MB-231-萤光素酶阳性（LUC)，以及MCF-7-luc的异种移植肿瘤(发展之前和之 后)。在一些实施方式中，Caliper/Xenogen IVIS?生物光子成像系统用于测量乳腺肿瘤的 负载量。使用Aperio Scanscope和Spectrum软件，通过免疫组织化学（IHC)的离体肿瘤的 体外分析和形态分析，确定在乳腺肿瘤中细胞凋亡的变化(半胱天冬酶-3和阳性_9)和增 生（Ki67阳性）的表型。
[0157] 图3示出了高亲和力的叶酸受体（FR)由BrCa肿瘤和细胞系表达。
[0158] 图4示出了负载顺钼、多西紫杉醇或卡钼的叶酸涂布的PBM纳米颗粒选择性地靶 向BrCa细胞和诱导其中的细胞凋亡。
[0159] 图5示出了通过静脉注射接受顺钼溶液（8mg/kg/周）或含顺钼(相当于顺钼剂量 =0. 08mg/kg/周）的叶酸涂布的PBM纳米颗粒的MDA-MD-231-luc的荷瘤小鼠产生显著的肿 瘤消退。通过静脉注射接受顺钼溶液（8mg/kg/周)或含顺钼(相当于顺钼剂量=0. 08mg/kg/ 周）的叶酸涂布的PBM纳米颗粒的MDA-MD-231-luc的荷瘤小鼠产生显著的肿瘤消退。
[0160] 接受顺钼溶液的的荷瘤小鼠具有比天然的或PBM纳米颗粒治疗的小鼠显著更高 的肾脏和肝脏的毒性。荧光素酶表达人类BrCa细胞（MDA-MB-231-luc ;ERNeg PRNeg Her2Neg和 MCF-7-luc ;ERP°S PRp°s Her2p°s)的原位乳腺脂肪垫注射后，描述PBM纳米颗粒(含有卡钼或紫 杉醇）介导的肿瘤消退的特征。肿瘤发展或肿瘤消退之后，含有多紫杉醇、卡钼或不加药物 的texas红染料的叶酸涂布的PBM纳米颗粒递送后，是使用Caliper/Xenogen IVIS-100成 像系统是对荷瘤Nu/Xid小鼠的非侵入性成像。通过免疫组织化学的体外分析确定在乳腺 肿瘤中细胞凋亡(半胱天冬酶-3和阳性_9)的变化和用新型PBM纳米颗粒处理过的肿瘤的 表型。NIH-III小鼠用于移植MDA-MB-231-luc和MCF-7-luc的细胞系。
[0161] PBM纳米颗粒影响肿瘤发展、免疫，分别使用4Tl-LUC_synograft和新型PyMT-luc 小鼠模型来确定自发性肿瘤发展。使用Caliper/Xenogen IVIS-100成像系统对临床相关的 移植（4T1)和自发性（PyMT)乳腺肿瘤的发展进行非侵入性监测。使用Aperio组织学扫描 仪和分析系统进行的免疫组织化学和显微形态分析测量在乳腺肿瘤中细胞凋亡的变化(半 胱天冬酶-3和阳性-9)和增生（Ki67阳性）的表型。此外，描述对于⑶25、FR4、FoxP3的、 IL-10和/或TGF-β 1的表达，和抑制Thl/Th2细胞增殖能力的外周的、淋巴结和肿瘤相关 的T细胞的数量和活性的特征。
[0162] 本申请的PyMT-LUC转基因小鼠是通过首先将小鼠跨越3代交配以创造 F3MMTV-LUC小鼠。随后F3MMTV-LUC小鼠与PyMT小鼠繁殖创造 PyMT-luc小鼠。
[0163] 图6示出PBM纳米颗粒选择性地杀死调节性T细胞（F0XP3+CD25Hi)，但不是T辅 助（FoxP3TD25,细胞。类似于表达高水平FR的癌细胞，T调节性（Treg)细胞表达FRY (FR4)，并且FR4封锁增强的肿瘤免疫；以及（vi)显示我们可以选择性地破坏Treg细胞 (F0XP3+CD25Hi)，但不是T辅助细胞。图3-5提供了生物学和临床基本原理以显示新型负载 多西紫杉醇或卡钼的叶酸涂层PBM纳米颗粒增强对肿瘤的治疗效果，降低毒性，并通过靶 向和诱导BrCa和Treg细胞死亡来增加肿瘤免疫以减少与化疗相关的健康差距。
[0164] 实施例3 :肿瘤细朐靶向和化疗-负载PBM纳米颗粒对前列腺癌细朐的影响
[0165] 用聚己内酯-聚乙二醇共聚物和叶酸涂布?20nm直径的负载细胞毒性药物的可 生物降解的PBM纳米颗粒。使用20 μ Μ顺钼对PCa细胞（PC3和PTEN-CaP2)和正常前列腺 上皮细胞（PrEC和RWPE-1)的处理导致>90%的细胞死亡。含有100倍以下顺钼的PBM纳 米颗粒被吸收，并诱导与顺钼溶液相同的水平的前列腺癌细胞凋亡，但并没有显著影响正 常细胞。接受顺钼溶液（8mg/kg/周)或叶酸包覆的PBM纳米颗粒(含0.08mg/kg/周的等效 剂量顺钼）的荷瘤小鼠产生了显著（以及类似）的肿瘤消退。然而，接受顺钼溶液的小鼠比 天然的或PBM纳米颗粒处理过的小鼠具有显著更高的肾脏和肝脏的毒性。PCa细胞表达高 水平的叶酸受体a (FRa/FRl);类似地，T调节性（Treg)细胞表达FRY (FR4)，并且FR4 阻断增强的肿瘤免疫。尽管有维生素 D缺乏、小窝蛋白1的表达和NER的基因型相关的健 康差距，PBM纳米颗粒增强了肿瘤治疗效果，降低毒性，并提高乳腺肿瘤免疫。
[0166] 图7示出FR是由PC3和PTEN_CaP2肿瘤表达，而不是由细胞系或正常细胞表达。
[0167] 如图8所示，负载顺钼的叶酸涂覆的PBM纳米颗粒选择性地靶向体外PC3细胞的 破坏。
[0168] 如图9所示，通过静脉注射接受顺钼溶液（8mg/kg/周）或叶酸包覆的
【权利要求】
1. 一种用于特异性靶向癌细胞的药物组合物，包括：包含姜黄素的行星球磨（PBM)纳 米颗粒，其中，所述的PBM纳米颗粒涂有叶酸或叶酸衍生物。
2. 如权利要求1所述的药物组合物，其中，所述PBM纳米颗粒进一步包括选自化学治疗 齐U、放射性偶联物、抗体、siRNA、反义寡核苷酸、三链形成寡核苷酸以及细胞毒性剂中的一 种或多种附加的细胞毒性剂。
3. 如权利要求1所述的药物组合物，其中，所述PBM纳米颗粒进一步包含选自基于钼的 药物、天然酚，植物生物碱和紫杉烷类、其他烷化剂、肿瘤抗生素和蒽环类、拓扑异构酶抑制 齐[J、抗代谢物、热休克蛋白拮抗剂和各种抗肿瘤药物中的一种或多种化学治疗剂。
4. 如权利要求1所述的药物组合物，其中，所述PBM纳米颗粒进一步包括来自结合一种 或多种肿瘤相关抗原的肽或抗体的靶向配体。
5. 如权利要求1所述的药物组合物，其中，所述PBM纳米颗粒进一步包括包含选自 212Bi、131I、 131In、9°Y、188Tu和186Re的放射性同位素的放射性偶联物。
6. 如权利要求1所述的药物组合物，其中，所述PBM纳米颗粒进一步包括选自白喉毒 素 A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素 A链(来自铜绿假单胞菌)、蓖麻毒素 A链、相思 豆毒蛋白A链，蒴莲根毒素 A链、α -帚曲霉素、油桐蛋白、石竹蛋白、美洲商陆蛋白（PAPI、 ΡΑΡΙΙ和PAP-S)、苦瓜抑制剂、麻疯树毒蛋白、巴豆毒素、肥皂草抑制剂、白树毒素、丝林霉 素、局限曲菌素、酚霉素、伊诺霉素和单孢霉烯族毒素以及它们的片段中的一种或多种细胞 毒性剂。
7. 如权利要求1所述的药物组合物，其中，所述ΡΒΜ纳米颗粒包括基质芯，其含有选自 藻酸盐、纤维素、胶原蛋白、淀粉和PEG中的一种或多种可生物降解的聚合物和多糖。
8. 如权利要求7所述的药物组合物，其中，所述PBM纳米颗粒包含基质芯，其含有PEG 和选自藻酸盐、纤维素、胶原蛋白和淀粉的其它可生物降解的多糖。
9. 如权利要求7所述的药物组合物，其中，所述PBM纳米颗粒还包括包含选自PEG、PCL 或它们的混合物的可生物降解聚合物的释放控制涂层。
10. 如权利要求9所述的药物组合物，其中，所述叶酸或叶酸衍生物与所述释放控制涂 层结合。
11. 一种用于在有需要的受试者中治疗癌症的方法，其包括给受试者施用一种有效量 的药物组合物，所述药物组合物包含： 包含姜黄素的行星式球磨（PBM)纳米颗粒，其中，所述PBM纳米颗粒涂覆有叶酸、腺苷、 嘌呤、激素、高亲和力肿瘤受体的肽配体或抗肿瘤抗原的抗体或它们的混合物。
12. 如权利要求11所述的方法，其中，所述癌症选自癌、肉瘤、淋巴瘤、白血病、生殖细 胞肿瘤，以及胚细胞瘤。
13. 如权利要求11所述的方法，其中，所述PBM纳米颗粒进一步包括选自化学治疗剂、 放射性偶联物、抗体、siRNA、反义寡核苷酸、三链形成寡核苷酸以及细胞毒性剂中的一种或 多种附加的细胞毒性剂。
14. 如权利要求11所述的方法，其中，所述PBM纳米颗粒进一步包括选自卡钼、顺钼、多 西他赛和奥沙利钼中一种或多种化学治疗剂。
15. 如权利要求11所述的方法，其中，所述PBM纳米颗粒进一步包括放射性偶联物，所 述放射性偶联物包含选自212Bi、 131I、mIn、9°Y、188Tu和186Re的放射性同位素。
16. 如权利要求11所述的方法，其中，所述PBM纳米颗粒进一步包括选自白喉毒素 A 链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素 A链(来自铜绿假单胞菌)、蓖麻毒素 A链、相思豆毒 蛋白A链，蒴莲根毒素 A链、α -帚曲霉素、油桐蛋白、石竹蛋白、美洲商陆蛋白（PAPI、PAPII 和PAP-S)、苦瓜抑制剂、麻疯树毒蛋白、巴豆毒素、肥皂草抑制剂、白树毒素、丝林霉素、局限 曲菌素、酚霉素、伊诺霉素和单孢霉烯族毒素以及它们的片段中的一种或多种细胞毒性剂。
17. 如权利要求11所述的方法，其中，所述PBM纳米颗粒包含基质芯，其含有选自藻酸 盐、纤维素、胶原蛋白、淀粉和PEG中的一种或多种可生物降解的聚合物。
18. 如权利要求11所述的方法，其中，所述PBM纳米颗粒包含基质芯，其含有PEG和选 自藻酸盐、纤维素、胶原蛋白和淀粉的其它可生物降解的聚合物。
19. 如权利要求11所述的方法，其中，所述PBM纳米颗粒进一步包括包含PEG、PCL或 它们的混合物的释放控制涂层。
20. 如权利要求11所述的方法，其中，所述叶酸或叶酸衍生物与所述释放控制涂层结 合。
21. -种用于在有需要的受试者中抑制癌转移的方法，其包括给受试者施用有效量的 药物组合物，所述药物组合物包括：包含姜黄素的行星球磨（PBM)纳米颗粒，其中，所述PBM 纳米颗粒涂覆有叶酸。
22. -种用于在有需要的受试者中诱导调节性T (Treg)细胞的细胞凋亡的方法，其包 括向受试者施用有效量的涂覆有叶酸的并含有对Treg细胞有细胞毒性的药剂的行星球磨 (PBM)纳米颗粒。
【文档编号】A61K9/14GK104066425SQ201280050727
【公开日】2014年9月24日 申请日期:2012年8月8日 优先权日:2011年8月15日
【发明者】詹姆斯·W·利拉德 申请人:詹姆斯·W·利拉德