重组胰高血糖素样肽-1受体激动剂的注射用药物组合物的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种含有重组胰高血糖素样肽-1受体激动剂的注射用药物组合物，其中重组胰高血糖素样肽-1受体激动剂由大肠杆菌表达纯化制得，具有如SeqIDNo.2所示的序列，注射用药物组合物含有重组胰高血糖素样肽-1受体激动剂、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲盐及多元醇。本发明进一步涉及含有重组胰高血糖素样肽-1受体激动剂的注射液及冻干粉针剂。本发明涉及的重组胰高血糖素样肽-1受体激动剂注射用药物组合物具有安全、稳定、便于运输及存放等优点，适于工业化生产。
【专利说明】重组胰高血糖素样肽-1受体激动剂的注射用药物组合物
【技术领域】
[0001] 本发明属于药物制剂领域，具体涉及一种重组胰高血糖素样肽-1受体激动剂的 注射用药物组合物。
【背景技术】
[0002] 天然的胰高血糖素样肽-1受体激动剂（Exendin-4)是南美洲大毒蜥的唾液 中分离出来的一种由39个氨基酸残基组成的生物活性多肽（Eng，J等，J. Biol. Chem.， 267:7402-05,1992)。其氨基酸序列如下[SEQ. ID. NO. 1]: His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala- Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pr〇-Ser-Ser-Gly-Ala-Pr〇-Pr〇-P r〇-Ser-NH2〇
[0003] Exendin-4与人体内的胰高血糖素样肽-1 (GLP-1)有53%的同源性（Goke等， J. Biol Chem.，268: 19650-55,1993)，研究发现，Exendin-4 在动物和人体内产生与 GLP-1 相似的生物学活性，并且Exendin-4的作用时间较GLP-1明显延长（Eng J.，exendin-4对 db/db小鼠高血糖的作用延长，Diabetes，45(增刊2):152A(摘要 554)，1996)，显示出促 胰岛素活性，US5424286提出Exendin-4用于治疗糖尿病及防止高血糖的用途。
[0004] 安米林公司和礼来公司合作开发了化学合成的Exendin-4注射液，2005年FDA批 准其在美国上市，商品名为Byetta，用于对单独使用二甲双胍、磺脲类药物或二甲双胍和磺 脲类药物联用治疗未能获得良好控制的II型糖尿病。
[0005] 重组胰高血糖素样肽-1受体激动剂（rExendin-4,简写为rE4)是利用基因工程手 段生产的多肽，分子量为4187Da，其氨基酸序列如下[SEQ. ID. N0. 2]: His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala- Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pr〇-Ser-Ser-Gly-Ala-Pr〇-Pr〇-P r〇-Ser〇
[0006] 利用基因工程技术制备重组胰高血糖素样肽-1受体激动剂（rE4)可以满足规 模化大生产的需求，同时可以极大程度的降低成本，CN1693459、CN1635117、CN1455001、 CN102618552A等申请均公开了利用基因工程技术制备rE4的方法，该方法具有操作简单、 成本低廉、环境友好等优点。
[0007] 基因工程技术生产rE4可能残留大肠杆菌菌体蛋白等杂蛋白及外源残留DNA，rE4 制剂的稳定性受到以上因素影响，不同于化学合成法制备E4的制剂。现有技术中的E4制 剂组方不能满足rE4制剂的稳定性、安全性等需求。注射液具有使用方便等优点；冻干粉针 剂具有易于运输、储存等优点，稳定性较好；均可作为rE4的剂型进行研究开发。
[0008] 安米林药品公司的专利CN1384755A公开了 一种药用制剂，它包含exendin或 exendin激动剂肽，缓冲剂、等重量克分子渗透浓度调节剂，所述药用制剂的pH为约 3. 0-7. 0。液体和冻干多剂量制剂还包含0. 005%-1. 0%的防腐剂，该防腐剂选自间甲酚、酚、 苄醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯和对羟基苯甲酸丁酯，缓冲剂为醋酸盐、磷酸 盐、柠檬酸盐或谷氨酸盐。等重量克分子渗透剂为碳水化合物或多元醇，碳水化合物选自半 乳糖、阿拉伯糖和乳糖，多元醇选自山梨醇、甘露醇、肌醇、甘油、木糖醇和聚乙二醇。该专利 的药物制剂含有防腐剂，将该专利组方应用于重组胰高血糖素样肽-1受体激动剂制剂，其 注射液放置时偶见rE4聚集并原纤化，从而在若干小时可变粘或混浊，因而变得不适于注 射。而将其制备为冻干剂时，辅料或防腐剂可能与杂蛋白或外源DNA发生物理化学反应，随 后在溶于水形成注射液的过程中发生沉淀，影响制剂稳定性。
[0009] CN101444618A公开了一种含有艾塞那肽的药物制剂，其特征在于：所述的药物制 剂含有艾塞那肽、能够维持制剂在水溶液状态下pH值为3. 0-7. 0的缓冲液及增强艾塞那肽 稳定性的辅料，所述的辅料可任选自葡萄糖、蔗糖、甲硫氨酸、甘露醇或甘氨酸的一种或几 种。所述缓冲液可任选自磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、磷酸缓冲液、醋酸缓冲液、巴比妥缓 冲液或柠檬酸缓冲液。可制备成为冻干粉针剂。该方案侧重低剂量E4制剂，且在研究中发 现，其所用辅料应用于rE4制剂时偶见析出沉淀的现象，影响制剂稳定性。
【发明内容】
[0010] 利用基因工程技术制备重组胰高血糖素样肽-1受体激动剂（rE4)的方法具有操 作简单、成本低廉、环境友好等优点，可以广泛的应用在rE4的工业化大生产当中。由于基 因工程技术制备的rE4中杂质组分与化学合成的艾塞那肽不同，大肠杆菌表达的rE4产品 经纯化后可能存在少量杂蛋白、外源残留DNA，影响制剂稳定性。现有技术的含有艾塞那肽 的药物制剂不能够满足重组胰高血糖素样肽-1受体激动剂制剂安全性、稳定性的需求，从 而限制了 rE4相关制剂的上市。
[0011] 本发明的发明人通过大量的试验，尝试各种缓冲体系及共溶剂处方，筛选了一种 适用于大肠杆菌表达的重组胰高血糖素样肽-1受体激动剂（rE4)的注射用药物组合物，该 组合物具有良好的安全性和稳定性，适于规模生产和后期储存运输。
[0012] 本发明提供一种含有重组胰高血糖素样肽-1受体激动剂的注射用药物组合物， 其中重组胰高血糖素样肽-1受体激动剂由大肠杆菌表达纯化制得，具有如Seq ID No. 2所 示的序列，其特征在于含有重组胰高血糖素样肽-1受体激动剂、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲盐 及多元醇。
[0013] 生物制品一般具有复杂的结构，需要选择合适的缓冲体系，并严格控制缓冲液的 pH值，确保生物制品的浓度、纯度及活性不会因为外界环境的变化而发生改变。本发明的发 明人在研究初期分别对大量的缓冲体系进行了筛选，通过大量稳定性试验发现，柠檬酸缓 冲体系能够较大程度的保持rE4的稳定性。
[0014] 本发明所述注射用药物组合物在配置过程中柠檬酸-柠檬酸钠缓冲盐浓度可选 10?30禮，优选20mM。
[0015] 本发明的发明人在研究中发现，柠檬酸缓冲盐浓度对于rE4注射用药物组合物的 稳定性亦具有一定影响，通过缓冲盐浓度试验，证实缓冲液为柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，浓 度为20mM时rE4药物组合物在溶液状态下的稳定性得到最优化。
[0016] 本发明所述注射用药物组合物中多元醇为山梨醇、甘露醇中的一种或其组合。
[0017] 糖类、多元醇、氨基酸及其衍生物、无机盐、甘油、多聚物如聚乙二醇（PEG)等一般 被称为蛋白质的共溶剂(分离纯化中蛋白质的不稳定性及其对策，冯小黎等，生物工程进 展，2000，V〇1. 20,67~71)。糖和多元醇可以增加蛋白质药物在水中的稳定性，常用的糖类包 括蔗糖、葡萄糖、海藻糖和麦芽糖，而常用的多元醇有甘油、甘露醇、山梨醇、PEG和肌醇等。 一些氨基酸如甘氨酸、精氨酸、天冬氨酸和谷氨胺酰等，可以增加蛋白质药物在给定pH下 的溶解度，并可提高其稳定性，亦可作为多肽类药物的稳定剂。本发明的发明人发现多元醇 的加入能够提高rE4的稳定性，大量试验发现山梨醇或甘露醇的加入可以提高rE4注射液 的稳定性；同时，山梨醇或甘露醇的加入可以防止温度升高或冻干复溶过程中rE4的变性。
[0018] 本发明的发明人在研究过程中对缓冲体系-共溶剂(糖类、多元醇、氨基酸)进行了 正交试验，结果证实使用柠檬酸缓冲体系及山梨醇或甘露醇作为共溶剂的注射用药物组合 物可以最大程度保持rE4制剂的稳定性。
[0019] 本发明提供一种含有重组胰高血糖素样肽-1受体激动剂的注射用药物组合物， 所述注射用药物组合物为注射液，该注射液由以下组分组成： 组分 含量 重组胰高血糖素样肽-1受体激动剂 10(Γ300份 朽1檬酸 860?4130份 柠檬酸钠 1020?5210份 多元醇 10000?50000份 注射用无菌水 适量； 优选地，该注射液由以下组分组成： 组分 含量 重组胰高血糖素样肽-1受体激动剂 250份 梓檬酸 1160份 朽1檬酸钠 4260份 多元醇 30000份 注射用无菌水 适量。
[0020] 具体实施过程中，本发明提供的注射剂可以由以下组份组成：
【权利要求】
1. 一种含有重组胰高血糖素样肽-1受体激动剂的注射用药物组合物，其中重组胰高 血糖素样肽-1受体激动剂由大肠杆菌表达纯化制得，具有如Seq ID No.2所示的序列，其 特征在于含有重组胰高血糖素样肽-1受体激动剂、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲盐及多元醇。
2. 如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于所述多元醇为山梨醇、甘露醇中的一 种或其组合。
3. 如权利要求1或2所述的药物组合物，其特征在于所述药物组合物为注射液，该注射 液由以下组分组成： 组分 含量 重组胰高血糖素样肽-1受体激动剂 10(Γ300份 朽1檬酸 860?4130份 柠檬酸钠 1020?5210份 多元醇 10000?50000份 注射用无菌水 适量； 优选地，该注射液由以下组分组成： 组分 含量 重组胰高血糖素样肽-1受体激动剂 250份 梓檬酸 1160份 朽1檬酸钠 4260份 多元醇 30000份 注射用无菌水 适量。
4. 如权利要求3所述的注射液，其中还含有注射用无菌水，该注射液pH为4. (Γ6. 0,优 选5. (Γ5. 8 ;进一步优选为5. 6。
5. 如权利要求4所述的注射液，其特征在于：注射液中还含有防腐剂，防腐剂为苯酚 2000?3000份，优选的为2500份。
6. 如权利要求1或2所述的药物组合物，其特征在于所述药物组合物为冻干粉针剂，其 特征在于：每支冻干粉针剂由以下组分组成： 组分 含量 重组胰高血糖素样肽-1受体激动剂 5(Γ200份 朽1檬酸 862?4129份 朽1檬酸钠 1015?5206份 多元醇 10000?50000份； 优选地，每支冻干粉针剂由以下组分组成： 组分 含量 重组胰高血糖素样肽-1受体激动剂 120份 朽1檬酸 2450份 朽1檬酸钠 2360份 多元醇 30000份。
7. 如权利要求6所述的药物组合物，其特征在于：所述药物组合物为冻干粉针剂，该冻 干粉针剂在溶液状态下pH为4. (Γ6. 0,优选4. 5~5. 5。
8. -种制备如权利要求1~7任一项所述的药物组合物的方法，其特征在于，包括以下 步骤： ① 分别称取适量柠檬酸、柠檬酸钠、多元醇，用注射用无菌水溶解，配制成稀释缓冲 液； ② 使用稀释缓冲液将检定合格重组胰高血糖素样肽-1受体激动剂原液稀释至终浓 度； ③ 用孔径为〇. 22 μ m的滤膜除菌； ④ 分装； ⑤ 任选地，分装后成品及时冷冻并进行冻干，得到冻干粉针剂，冻干全过程中制品温度 不高于25°C ; 任选地，注射用药物组合物制备为注射液时，可称取适量苯酚加入注射用无菌水中溶 解。
9. 上述权利要求中任一项所述的药物组合物在制备用于治疗II型糖尿病的药物中的 用途。
【文档编号】A61K38/26GK104107422SQ201310131647
【公开日】2014年10月22日 申请日期:2013年4月16日 优先权日:2013年4月16日
【发明者】张锋, 窦燕峰, 解茹, 赵丽艳, 张璇, 贾锴, 盖文丽, 曹卫荣, 王莉芳 申请人:石药集团中奇制药技术（石家庄）有限公司