一种自噬抑制剂与精氨酸酶药物复合物及其用途
【专利摘要】本发明涉及生物制药领域，提供一种新的治疗肿瘤的药物复合物，具体涉及一种自噬抑制剂与精氨酸酶药物复合物及其用途；该药物复合物用于治疗肿瘤。该药物复合物能在体外显著增强精氨酸酶的抗肿瘤活性；能减少人重组精氨酸酶的免疫原性，延长精氨酸酶在体内的半衰期。本发明提供了多聚唾液酸修饰的精氨酸酶，该多聚唾液酸修饰的精氨酸酶由活化的多聚唾液酸在氰基硼氢化钠存在的情况下与精氨酸酶反应成偶联物；本发明的药物复合物可增强精氨酸酶对肿瘤的杀伤作用，增强精氨酸酶的疗效，尤其是治疗黑色素瘤和乳腺癌的疗效。
【专利说明】一种自噬抑制剂与精氨酸酶药物复合物及其用途
【技术领域】
[0001]本发明属医药【技术领域】，涉及新的治疗肿瘤的药物复合物；具体涉及一种自噬抑制剂与精氨酸酶药物复合物及其用途；该药物复合物用于治疗肿瘤，尤其治疗黑色素瘤和肝癌。
【背景技术】
[0002]精氨酸酶是哺乳动物肝脏中参与尿素循环的一种关键酶，在尿素循环中将精氨酸转化为鸟氨酸和尿素。现有技术公开了精氨酸是维持部分肿瘤细胞生长的必需氨基酸，肿瘤细胞内精氨酸水平低于一定值后，将导致细胞死亡。精氨酸酶能在体内外特异高效的降解精氨酸。精氨酸在人体的正常生理功能中具有重要作用，是一种半必须氨基酸，正常体细胞能够通过尿素循环将其他氨基酸转化为精氨酸，从而抵消外源性精氨酸缺乏；然而，对于部分精氨酸依赖的肿瘤细胞，由于缺乏尿素循环过程中的关键酶，在外源性精氨酸剥夺时，无法自身合成精氨酸，最终导致细胞死亡。精氨酸酶能够在体内外降解精氨酸，导致精氨酸依赖的肿瘤细胞死亡，而对正常细胞无影响。有研究在体外试验中，发现精氨酸酶能显著杀伤肝癌细胞、黑色素瘤细胞、胰腺癌细胞以及白血病细胞等[① Lam TL, Wong GK, Chong HC, Cheng PN, Choi SC, Chow TL, et al.Recombinant humanarginase inhibits proliferat1n of human hepatocellular carcinoma by inducingcell cycle arrest.Cancer letters.2009 ;277:91-100.② Hernandez CP, Morrow K，Lopez-Barcons LA，Zabaleta J，Sierra R，Velasco C，et al.Pegylated arginase I:a potential therapeutic approach in T-ALL.Blood.2010 ；115:5214-21.③ HsuehEC，Knebel SM，Lo WH, Leung YC, Cheng PN, Hsueh CT.Deprivat1n of arginine byrecombinant human arginase in prostate cancer cells.Journal of hematology &oncology.2012 ；5:17.]精氨酸酶治疗肝癌的一期临床结果显示了其良好的成药性能[YauT, Cheng PN, Chan P, Chan ff, Chen L, Yuen J, et al.A phase I dose-escalating studyof pegylated recombinant human arginase I (Peg-rhArgl)in patients with advancedhepatocellular carcinoma.1nvestigat1nal new drugs.2012.]，据了解，精氨酸酶用于肝癌的治疗用研究已经完成二期临床试验，表现出良好的应用前景；皮肤恶性黑素瘤(cutanous malignant melanoma, CMM)发病率呈上升趋势,据美国国家癌症研究中心网上数据表明:美国白人CMM发病率从1973年的7.5/100000上升到2001年的22.5/100000。在我国，黑色素瘤发病率成增高趋势，尽管多数早期患者通过手术能够得到治愈，但对于进展期患者，化疗通常效果不佳，因而寻找新的治疗策略尤为重要。
[0003]但精氨酸酶在体内低亲和力和较短的半衰期等因素影响了药物的抗肿瘤疗效。因此，进一步提高精氨酸酶体内的抗肿瘤活性将有助于其抗肿瘤应用。
[0004]多聚唾液酸是N-乙酰神经氨酸通过N-连接糖苷键多聚形成的独特碳水化合物，研究发现多聚唾液酸化多肽或蛋白质在保持活性的前提下，修饰后可显著降低肽类化合物水解，延长半衰期，降低免疫原性(Gregoriadis G, Fernandes A, Mital M, McCormack B:Polysialic acids !potential in improving the stability and pharmacokinetics ofproteins and other therapeutics.Cell Mol Life Sci 2000 ;57 (13-14):1964-1969)。Fernandes等利用多聚唾液酸对L-天冬酰胺酶进行修饰，修饰后酶的抗原性和免疫原性均低于天冬酰胺酶，但修饰后酶抗胰蛋白酶的水解能力和体外半衰期明显增强(FernandesAl，Gregoriadis G:The effect of polysialylat1n on the immunogenicity andantigenicity of asparaginase !implicat1n in its pharmacokinetics.1nt JPharm2001 ；217(l-2):215-224);林怡等对铜锌超氧化物歧化酶进行多聚唾液酸修饰，修饰后产物的稳定性实验结果表明，多聚唾液酸修饰可提高铜锌超氧化物歧化酶的酸碱稳定性、热稳定性和抗酶降解能力(Wu JR, Lin Y，Zheng ZY，Lin CC, Zhan XB, Shen YQ:Improvement of the CuZn-superoxide dismutase enzyme activity and stability asa therapeutic agent by modificat1n with polysialic acids.B1technol Lett2010 ；32(12):1939-1945) 0此外多聚唾液酸通过改变神经系统神经黏附分子的黏附性调节神经细胞发育，对神经细胞功能的维持起重要作用(Weber M，Modemann S，Schipper P，Trauer H， Franke H， Illes P， Geiger KD, Hengstler JG, Kleemann WJ-1ncreasedpolysialic acid neural cell adhes1n molecule express1n in human hippocampusof heroin addicts.Neuroscience2006 ；138(4): 1215-1223 ;Angata K，Huckaby V，Ranscht B,Terskikh A,Marth JD,Fukuda M:Polysialic acid-directed migrat1n anddifferentiat1n of neural precursors are essential for mouse brain development.Mol Cel I B1l2007 ；27(19):6659-6668)。
[0005]细胞自嗷(autophagy)又叫 II 型程序性死亡(type II programmed celldeath)，是真核生物体内常见的“自我消化” (cellular degradat1n)的现象，能分解细胞内受损或多余的细胞器和蛋白产生核苷酸，氨基酸等小分子物质供细胞合成新的蛋白质，并能维持细胞内微环境的稳定。研究发现其与多种疾病，尤其是肿瘤的发展关系密切。根据细胞内底物运送到溶酶体腔内方式的不同，哺乳动物细胞自噬可分为三种方式:大自嗷(macroautophagy)、小自嗷(microautophagy)和分子伴侣介导的自嗷(chaperone-mediated autophagy，CM) ?主要概述的大自嗷(以下简称自嗷)与肿瘤发展及治疗关系最为密切 ΓSridhar S, Botbol Y，Macian F，et al.Autophagy and disease:always two sides to a problem.J Pathol.2012:226 (2):255-73.]。自嗷是胞衆大分子物质和细胞器在双层膜包囊泡中大量降解的生物学过程。现有技术其中的过程大致能分为4个阶段「Martinez-Borra J, Lopez-Larrea C.Autophagy and self-defense.Adv Exa MedB1l.2012 ；738:169-84.]。自噬能对细胞对外部环境改变及各种剌激产生应激反应。细胞在生长条件下能发生较低水平的自噬，称基础自噬。然而，一旦受到外界的剌激，如饥饿、缺氧、高温、高细胞密度或是生长因子剥夺等，细胞自噬的水平将会迅速上调。如在营养物质缺乏的情况下，细胞自噬能分解体内坏死细胞器产生氨基酶等供细胞合成新的蛋白质，维持细胞的存活 Γ ① Piacentini M，D’ Eletto M，Falasca L，et al.Transglutaminase2atthe crossroads between cell death and survival.Adv Enzymol Relat Areas MolB1l.2011 ；78:197-246:(? Cook KL, Shaiahan AN, Clarke R.Autophagy and endocrineresistance in breast cancer.ExnertRev Anticancer Ther.2011:11(8):1283-94.；③ Wirawan E，Vanden Berghe T，Lippens S，et al.Autophagy:for better or forworse.Cell Res.2012:22 (I):43-61.]。
[0006]研究揭示自噬能降解折叠错误的蛋白质、损伤的细胞器等，延缓机体衰老的发生。集体衰老相关疾病一神经退行性疾病可以被归类为蛋白构象错误疾病，一般是由于大量折叠错误的蛋白质在细胞内堆积从而引发细胞毒性而造成的。研究表明，大量衰老性疾病，力口神经退行性疾病和恶件肿瘤都与细胞自曬密切相关[(I) Martinez-Borra T, Lopez-LarreaC.Autophagy and self-defense.Adv Exp Med B1l.2012 ；738: 169-84.；② CaballeroB, Coto-Montes A.An insight into the role of autophagy in cell responses inthe aging and neurodegenerative brain.Histol Histopathol.2012:27 (3):263-75.；(? Mendelsohn AR, Larrick Tff.Rapamycin as an antiaging therapeutic ?:targetingmammalian target of rapamycin to treat Hutchinson-Gilford progeria andneurodegenerative diseases.Rejuvenat1n Res.2011:14(4):437-41.]。
[0007]据报道，自噬基因缺失或者突变的线虫生长发育缺陷、衰老加速并缩短寿命；并且自噬也参与果蝇变态的发生。此外自噬在哺乳动物成年个体组织器官发育和分化中也起了重要作用「Mizushima N, Komatsu M.Autophagy:renovat1n of cells and tissues.Cell.2011 ；147(4):728-41.]。此外作为程序性细胞死亡的一种，细胞自噬能通过多种途径直接或是间接导致细胞死亡。「Denton P, Nicolson S, Kumar S.Cell death byautophagy:facts and apparent artefacts.Cell Death Differ.2012: 19 (I):87-95.]。研究表明，肿瘤的发生与发展和自噬的关系极为密切。
[0008]一般来说，由于细胞自噬有利于细胞的存活，但是自噬对肿瘤细胞的发生发展目前尚没有定论。自噬初期可以作为肿瘤发生的一种抑制因素，一些已知的肿瘤抑制因子，例如PTEN、TSCl和TSC2能激活自嗤，并且对自噬的抑制可使蛋白降解减少，合成代谢增加，最终导致原癌细胞持续增殖。大多数肿瘤细胞(如肝、胰腺、乳腺癌等)尽管癌变前自噬能力各有不同，但是在癌变之后其自噬能力均减弱。自噬缺乏可引起自噬底物P62积聚通过NF-K B信号涂径引起肿瘤形成「Trocoli A,P iavaher1-Mergny M.The complex interplaybetween autophagy and NF-κ B signaling pathways in cancer cells.Am I CancerRes^2011 ；1(5):629-49.]。然而在肿瘤生长到一定程度时，尤其是当肿瘤内还没有形成足够的血管为其扩增提供营养时，肿瘤细胞也可以通过自噬来克服营养缺乏和低氧的环境得以生存。研究表明，在缺乏血清或氨基酸的情况下约3h，HeLa细胞中的自噬部分从4%上升到37%。这也说明了在营养缺乏等条件下自噬也是肿瘤细胞的一种自我保护的机制「Baldwin AS.Regulat1n of cell death and autophagy by IKK and NF-κ B:criticalmechanisms in immune funct1n and cancer.Tmmunol Rev.201 2:246⑴:327-45.]。
[0009]另有研究公开了，抗肿瘤药物诱导的肿瘤细胞自噬所体现的作用大致可以概括为两种:大部分情况下是对肿瘤细胞的保护，某些情况下也能对肿瘤细胞进行杀伤。研究表明化疗药物5-FU以及单克隆抗体药物曲妥珠单抗(Trastuzumab)和西妥昔单抗(Cetuximab)均能显著地诱导细胞自噬，且抑制由这3种药物产生的细胞自噬能显著增加肿瘤细胞对治疗的敏感性，[① Vazquez-Martin A, Oliveras-Ferraros C, MenendezJA.Autophagy Facilitates the Development of Breast Cancer Resistance to theAnt1-HER2Monoc1naI Antibody Trastuzumab.PLoS One.2009 ；4 (7):e6251.1，Hou N, Faried A, Tsutsumi S, et al.1nhibit1n of Autophagy by3-MA Enhances theEffect of5-FU_Induced Apoptosis in Colon Cancer Cells.Ann Surg Oncol.2009 ；16(3):761-771 ；
[0010]迄今为止，尚未见有人重组精氨酸酶诱导肿瘤细胞自噬以及细胞自噬抑制剂与人重组精氨酸酶联合治疗肿瘤的相关报道。
【发明内容】
[0011]本发明的目的是提供一种新的治疗肿瘤的药物复合物，具体涉及一种自噬抑制剂与精氨酸酶药物复合物及其用途；该药物复合物用于治疗肿瘤，尤其治疗黑色素瘤和肝癌。该药物复合物能在体外显著增强精氨酸酶的抗肿瘤活性；能减少人重组精氨酸酶的免疫原性，延长精氨酸酶在体内的半衰期。
[0012]本发明基于目前主要用于肿瘤治疗的化疗药物大多会产生耐药性及有较强的副作用；其中，虽然精氨酸酶的抗肿瘤作用得到了广泛的论证，但其体内亲和力较低，起效剂量较大，存在一些潜在的毒副作用，因此，本发明提供一种自噬抑制剂与精氨酸酶药物复合物；该药物复合物可加强精氨酸酶活性从而降低其用量和毒副作用；该药物复合物可通过使用一种或者几种自噬抑制剂与精氨酸酶制成复方药物或是组合物，进行联合给药或是序贯给药，加强精氨酸酶的抗肿瘤疗效。
[0013]本发明还基于细胞自噬与多种疾病，尤其是肿瘤的发展关系密切，本发明的研究中显现细胞自噬在精氨酸酶对黑色素瘤和乳腺癌的治疗过程中对人重组精氨酸酶有抵抗作用；并且使用自噬抑制剂能加强人重组精氨酸酶对黑色素瘤、肺癌、脑瘤、乳腺癌、淋巴瘤、白血病、和骨髓瘤，尤其是黑色素和乳腺癌的疗效。
[0014]具体而言，本发明的自噬抑制剂与精氨酸酶药物复合物，其特征在于，由一种或多种自噬抑制剂和精氨酸酶组成；
[0015]本发明中，细胞自卩遼抑制剂包括但不限于:3_MA (3-Methyladenine)、渥曼青霉素(wortmannin)、LY294002、放线菌酮、巴法洛霉素 Al (Bafilomycin Al)、NH4C1、氯喹(Chloroquine)和轻基氯喹(hydroxychloroquine);本发明的实施例中，优选细胞自卩遼抑制剂为:3_MA (3-Methyladenine)、氯喹(Chloroquine)和轻基氯喹(hydroxychloroquine)。
[0016]本发明中所述的精氨酸酶包括求不限于鼠源精氨酸酶、人重组精氨酸酶以及各种长效化修饰的精氨酸酶，包括但不限于聚乙二醇修饰的人重组精氨酸酶、多聚唾液酸修饰的人重组精氨酸酶。
[0017]本发明中，采用活化的多聚唾液酸对精氨酸酶进行化学修饰，本发明的实施例中，由活化的多聚唾液酸末端第7位的单醛基与精氨酸酶的氨基进行反应获得化学修饰长效精氨酸酶。
[0018]本发明中，所述的细胞自噬抑制剂与所述的精氨酸酶可制成药物复合物、复方药物或序贯使用，用于治疗恶性肿瘤；其中，通过抑制精氨酸酶诱导的细胞自噬而抵消肿瘤由于细胞自噬而引起的对精氨酸酶治疗的拮抗作用，从而显著增强精氨酸酶对肿瘤的治疗效果O
[0019]本发明中，所述的肿瘤包括但不限于黑色素瘤、乳腺癌、淋巴瘤、白血病、肝癌、肺癌和骨髓瘤，本发明的实施例中优选黑色素瘤和乳腺癌；
[0020]所述精氨酸酶通过诱导黑色素瘤凋亡和细胞周期阻滞杀伤肿瘤细胞；所述精氨酸酶通过诱导乳腺癌细胞凋亡杀伤肿瘤细胞。
[0021]本发明所述的药物可进一步选自以下形式进行配方:
[0022]本发明所述的药物复合物中，进一步选自下述的形式进行配制，包括:片剂、溶液、分散剂、胶束、乳剂、脂质体、纳米微球等。
[0023]本发明进行了细胞实验,实验结果显示,在精氨酸脱亚胺酶(argininedeiminase)杀伤肿瘤细胞时，细胞自噬能保护肿瘤细胞免于细胞死亡，从而降低了药物的疗效；所述药物复合物中的人重组精氨酸酶也能显著诱导黑色素瘤细胞和乳腺癌细胞发生细胞自噬，而细胞自噬则会部分抵消精氨酸酶的抗肿瘤效果，通过使用细胞自噬抑制剂抑制细胞自噬能增加黑色素瘤细胞和乳腺癌细胞对人重组精氨酸酶的敏感性，从而增强人重组精氨酸酶的疗效
[0024]本发明中，采用一种或多种自噬抑制剂与人重组精氨酸酶制成复方药物、组合物联合给药或是序贯给药，用于治疗恶性肿瘤，可增强人重组精氨酸酶对肿瘤的杀伤作用，增强人重组精氨酸酶的疗效。
[0025]本发明的突出的有益效果在于:解决了在延长精氨酸酶的体内半衰期的同时保持精氨酸酶的活性、降低其免疫原性的关键技术问题，尤其是提供了多聚唾液酸修饰的精氨酸酶，该多聚唾液酸修饰的精氨酸酶由活化的多聚唾液酸在氰基硼氢化钠存在的情况下与精氨酸酶反应成偶联物；本发明本发明的自噬抑制剂与精氨酸酶药物复合物可增强精氨酸酶对肿瘤的杀伤作用，增强精氨酸酶的疗效，尤其是治疗黑色素瘤和乳腺癌的疗效。
【专利附图】
【附图说明】
[0026]图1A，B:显示了 A375细胞透射电子显微镜下细胞亚显微结构图；
[0027]图1C，D显示了 A375细胞经过不同时间或不同浓度人重组精氨酸酶处理后细胞亚显微结构图。
[0028]图2A、2B、2C显示，精氨酸酶处理72h显著地抑制了 A375、MDA-MB_231、MCF_7细胞的增殖。
[0029]图3A、B是细胞A375和MDA-MB-231的电泳图。
[0030]图4显示:经过人重组精氨酸酶处理的A375细胞的LC3II的表达量高于对照组。
[0031]图5A，B，C，D显示了:抑制自噬增强A375细胞中重组精氨酸酶引起的线粒体膜电位的降低。
[0032]图6显示了重组精氨酸酶诱导A375细胞产生活性氧。
[0033]图7是经多聚唾液酸修饰的重组人精氨酸酶分子量的凝胶电泳分析图。
【具体实施方式】
[0034]实施例1:人重组精氨酸酶的制备。
[0035]采用PCR的方法获得编码人精氨酸酶的编码序列，该基因编码序列全长969bp，带有酶切位点XhoI和EcoRI ;用XhoI和EcoRI内切酶分别双酶切PCR产物和空质粒载体，将目的基因与载体连接后转化氨苄抗性平板，挑取若干个阳性转化子，取其中一个扩增并提取质粒，进行XhoI和EcoRI内切酶双酶切鉴定；提取重组质粒，将重组载体用BglII酶切使线性化，电击转化毕赤酵母；挑取阳性转化子；通过RDB、MM和MD平板筛选，得到表型为his+muts的克隆子，进一步在摇床水平上进行诱导表达，通过SDS-PAGE蛋白电泳检测摇床水平上精氨酸酶的表达情况，从而筛选分泌表达精氨酸酶的重组子；从若干株带有精氨酸酶基因的重组酵母中筛选到分泌表达精氨酸酶的重组子；样品纯化中，将酵母离心后取上清。样品经过超滤浓缩，采用凝胶排阻层析进行精制；选用Sephacryl S-200作为样品的精制层析柱；
[0036]采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和HPLC进行纯度检测，结果显示，获得的重组精氨酸酶纯度约为95%，获得的人重组精氨酸酶保存于4摄氏度冰箱，试验临用前用细胞培养基稀释至使用浓度。
[0037]实施例2:自噬抑制剂药物的配方
[0038](I)氯喹的配制:取适量氯喹溶于纯水配成10mmol/L的储存液，用0.1 μ m的滤器过滤除菌后保存于4°C，体外实验用PRM1-1640培养基稀释500-1000倍用于抑制细胞自嗤；
[0039](2)氯化铵的配制:取适量氯化铵溶于水配成0.4mol/L的储存液，用0.1 μ m的滤器过滤除菌后保存于4°C。体外实验时稀释50-80倍用于抑制细胞自噬；
[0040](3)羟基氯喹的配制:取适量羟基氯喹溶于纯水配成lOmmol/L的储存液，用0.1ym的滤器过滤除菌后保存于4°C，体外实验室稀释500-1000倍用于抑制细胞自噬；
[0041](4) 3-MA的配制:取适量3-MA干粉配制成0.2mol/L的储存液，用0.1 μ m的滤器过滤除菌后保存于_20°C。体外实验时稀释50-200倍用于抑制细胞自噬；
[0042](5) LY294002的配制:取适量LY294002干粉配制成0.2mol/L的储存液，用0.1 μ m的滤器过滤除菌后保存于-20°C。体外实验时稀释50-100倍用于抑制细胞自噬；
[0043](6)巴伐洛霉素Al的配制:取适量巴伐洛霉素Al干粉配制成0.5 μ g/ml的储存液，用0.1 μ m的滤器过滤除菌后保存于-20°C，体外实验时稀释1000倍用于抑制细胞自嗤；
[0044](7)自噬抑制剂与精氨酸酶复合药物用于体内或体外抗肿瘤，自噬抑制剂3-MA的使用浓度范围为Ο-lmol/L，自噬抑制剂CQ的使用浓度范围为0-50mol/L，羟基氯喹的使用浓度范围为0-50mol/L，LY294002的使用浓度范围为Ο-lmol/L，巴伐洛霉素Al的使用浓度范围为O-lOmol/L，精氨酸酶的使用浓度范围为0-100IU/ml。
[0045]实施例3:人重组精氨酸酶能诱导黑色素瘤A375和乳腺癌MDA-MB-231和MCF-7发生细胞自噬
[0046]A375细胞用3.2IU/ml的精氨酸酶处理24h后，进行石蜡包埋、切片、染色，在透射电子显微镜下观察细胞亚显微结构，结果如图1A所示，给药组细胞内有大量的典型的双层膜结构自噬体，而对照组则未发现；将eGFP-LC3质粒转入黑色素瘤A375中，再用3.2IU/ml的精氨酸酶处理24h，随后在激光共聚焦显微镜下观绿色荧光斑点，结果如图1B显示，给药组细胞内有大量的荧光斑点，而对照组较少；
[0047]将收集到的黑色素瘤A375细胞用PBS洗I次，用RIPA试剂盒裂解细胞，并定量后按照每个泳道20yg进行蛋白电泳后转膜至PVDF膜上，用5%脱脂牛奶封闭lh，加入相应抗体，于4°C孵育12h。TBST洗膜后加入二抗室温孵育1.5h，用ECL显色液显色，A375细胞经过不同时间或不同浓度人重组精氨酸酶处理后,通过Western Blot的检测，结果如图1C和ID所示，与对照组相比，给予人重组精氨酸酶组的A375细胞的LC3II的表达水平增强。
[0048]实施例4:人重组精氨酸酶能抑制A375细胞和乳腺癌细胞的增殖
[0049]将适当浓度的A375、MDA-MB-231、MCF-7细胞种在96孔培养板内，加入不同浓度的精氨酸酶，体系终体积为100 μ L，培养72h，向每孔加入10 μ MTT液，在培养箱内放置4h，之后用含DMSO溶解，570nm下测量光密度值(0.D.)，结果如图2A、2B、2C显示，精氨酸酶处理72h显著地抑制了细胞的增殖。
[0050]实施例5:抑制细胞自噬后细胞内相关蛋白的表达水平检测
[0051 ] 用RIPA裂解液裂解抽取细胞总蛋白，定量后按每孔20 μ g蛋白量上样进行蛋白电泳并转膜进行Western blot，用ECL化学发光试剂盒进行化学发光，结果如图4所示:经过3.2IU/ml人重组精氨酸酶处理的A375细胞的LC3II的表达量高于对照组，经过20 μ M CQ和3.2IU/ml人重组精氨酸酶处理后的A375细胞的LC3II的表达量高于3.2IU/ml人重组精氨酸酶单独处理后的A375细胞。而经过3.2IU/ml人重组精氨酸酶和2mM的3-MA处理后的MDA-MB-231细胞的LC3II的表达量低于3.2IU/ml人重组精氨酸酶处理后的MDA-MB-231细胞；由于3-MA是一种PI3KIII抑制剂，PI3KIII在细胞自噬的调控中起重要的作用，其能与Beciln I等分子结合，参与调控自噬体膜的运输；因此抑制PI3KIII将阻遏自噬体的形成，从而起到抑制细胞自噬的作用；从现象上看，由于自噬体膜的形成与运输受阻，导致ATG8/LC3分子无法通过泛素化在自噬体膜上定位；所以LC3II分子的表达水平会因此下降，Western Blot的结果证明2mM的3-MA能抑制由3.2IU/ml人重组精氨酸酶所诱导的MDA-MB-231细胞诱发的自噬，而CQ是自噬溶酶体的抑制剂，CQ能造成溶酶体的碱化，使溶酶体酶失去活性，从而造成自噬体的堆积，这造成了自噬体无法在溶酶体内进行降解，导致了处于自噬体膜表面的LC3II分子的量增加，Western Blot的结果证明20 μ M的CQ能抑制由3.2IU/ml人重组精氨酸酶诱导的A375细胞的细胞自噬。
[0052]实施例6:抑制自噬能增强人重组精氨酸酶诱导的A375细胞凋亡
[0053]A375细胞经过人重组精氨酸酶和抑制剂处理72小时经过流式细胞检测，将收集到的A375细胞用PBS洗I次，之后加入500μ1结合液和5μ1 Anexin V-FITC，避光室温孵育15min，随即进行流式细胞检测，结果如图4所示，经过3.2IU/ml人重组精氨酸酶处理72h的A375细胞的细胞凋亡率高于对照组，而3.2IU/ml人重组精氨酸酶与20 μ M的CQ联合干预的Α375细胞的细胞凋亡率显著高于3.2IU/ml人重组精氨酸酶单独处理的A375细胞。
[0054]实施例7:抑制自噬增强A375细胞中重组精氨酸酶引起的线粒体膜电位的降低
[0055]A375细胞经过3.2IU/ml人重组精氨酸酶分别处理24h和72h，收集细胞，经JC-1染色，随即进行流式细胞检测，经过3.2IU/ml人重组精氨酸酶处理后的A375细胞与对照组相比，线粒体膜电位明显降低(图5A)，线粒体膜电位抑制剂环孢霉素(CsA)减弱精氨酸酶在A375细胞中诱导的细胞自噬(图5B)，增强精氨酸酶对A375细胞的杀伤作用(图5C)，并且20 μ M CQ增强Α375中3.2IU/ml重组精氨酸酶引起的线粒体膜电位降低(图OT)。
[0056]实施例8:重组精氨酸酶诱导A375细胞产生活性氧
[0057]A375细胞经过3.2IU/ml人重组精氨酸酶处理72h，收集细胞，经过DCFH-DA标记，随即进行流式细胞检测，经过3.2IU/ml人重组精氨酸酶处理后的A375细胞与对照组相比，活性氧的产生量明显增加(图6)。
[0058]实施例9:多聚唾液酸的活化
[0059](I)将多聚唾液酸按10mg/ml多聚唾液酸与新鲜配制的10mM高碘酸钠混合，置于20°C暗处搅拌5min ；
[0060](2)加入两倍体积的乙二醇中和过量的高碘酸钠，置于20°C暗处继续搅拌30min ；
[0061](3)将氧化的多聚唾液酸置于0.01%碳酸铵缓冲液(ρΗ7.4)中4°C透析24h，透析袋应能截留3.5KDa的分子；
[0062](4)以分子量为8KDa的干燥聚乙二醇覆盖反相透析浓缩多聚唾液酸溶液；
[0063](5)将透析液冻干，置于_40°C保存备用。
[0064]实施例10:多聚唾液酸修饰重组精氨酸酶的反应
[0065](I)将人重组精氨酸酶的缓冲体系置换为pH7.4Tris-Hcl缓冲液；
[0066](2)在4mg/ml氰基硼氢化钠存在的情况下，活化的多聚唾液酸与人重组精氨酸酶摩尔比按50: I进行混合；
[0067](3)将反应容器置于35°C的环境中密闭搅拌反应24h ；
[0068](4)反应结束后用70%硫酸铵沉淀蛋白，4°C搅拌Ih后离心收集沉淀；
[0069](5)将沉淀用pH7.410mM的磷酸盐缓冲液溶解并在相同的缓冲液中4°C透析24h ；
[0070]取活化的多聚唾液酸与纯化的精氨酸酶按摩尔比50: I进行反应，控制氰基硼氢化钠的用量为4mg/ml，蛋白浓度为lmg/ml，反应体系为5ml，35°C密闭搅拌反应48h ;对反应后的产物与1mM PBS pH7.4溶液中透析24h，浓缩反应产物并进行SDS-PAGE凝胶电泳分析，实验结果如图7所示:与未反应的重组人精氨酸酶相比，经多聚唾液酸修饰的重组人精氨酸酶分子量明显增加，一单位的多聚唾液酸的分子量为30KDa，反应后产物的分子量约为65KDa，与预期分子量大小一致(图7)。
【权利要求】
1.一种细胞自噬抑制剂与精氨酸酶药物复合物，其特征在于，由一种或多种自噬抑制剂和精氨酸酶组成； 所述的细胞自噬抑制剂选自3-MA、渥曼青霉素、LY294002、放线菌酮、巴法洛霉素Al、NH4C1、氯喹或羟基氯喹； 所述的精氨酸酶选自鼠源精氨酸酶、人重组精氨酸酶或长效化修饰的精氨酸酶。
2.按权利要求1所述的细胞自噬抑制剂与精氨酸酶药物复合物，其特征在于，所述的细胞自噬抑制剂选自3-MA、氯喹和羟基氯喹中的一种或多种。
3.按权利要求1所述的细胞自噬抑制剂与精氨酸酶药物复合物，其特征在于，所述的精氨酸酶选自聚乙二醇修饰的人重组精氨酸酶或多聚唾液酸修饰的人重组精氨酸酶。
4.按权利要求1所述的细胞自噬抑制剂与精氨酸酶药物复合物，其特征在于，所述的长效化修饰的精氨酸酶是采用活化的多聚唾液酸末端第7位的单醛基与精氨酸酶的氨基进行反应获得化学修饰长效精氨酸酶。
5.按权利要求1所述的细胞自噬抑制剂与精氨酸酶药物复合物，其特征在于，所述的细胞自噬抑制剂与精氨酸酶制成下述剂型的复方药物:片剂、溶液、分散剂、胶束、乳剂、月旨质体或纳米微球。
6.按权利要求1所述的细胞自噬抑制剂与精氨酸酶药物复合物，其特征在于，所述的药物中，细胞自噬抑制剂与精氨酸酶序贯使用。
7.权利要求1所述的细胞自噬抑制剂与精氨酸酶药物复合物在制备治疗肿瘤药物中的用途。
8.按权利要求7所述的用途，其特征在于，所述的肿瘤选自黑色素瘤、乳腺癌、淋巴瘤、白血病、肝癌、肺癌和骨髓瘤。
9.按权利要求7所述的用途，其特征在于，所述的肿瘤选自黑色素瘤或乳腺癌。
10.按权利要求7所述的用途，其特征在于，所述的细胞自噬抑制剂抑制精氨酸酶诱导的细胞自噬，抵消肿瘤由于细胞自噬而引起的对精氨酸酶治疗的拮抗作用。
【文档编号】A61P35/00GK104338134SQ201310334478
【公开日】2015年2月11日 申请日期:2013年8月2日 优先权日:2013年8月2日
【发明者】鞠佃文, 王子玉, 赵舒薇, 李玉彬, 曾贤, 范佳君, 王绍飞, 李力 申请人:复旦大学