一种姜黄素长循环脂质体的制备方法
【专利摘要】一种姜黄素长循环脂质体的制备方法，所述方法包括：称取质量之比为1﹕30~50﹕3~5﹕1~3的姜黄素、大豆卵磷脂、胆固醇和聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺，溶于乙醇中作为有机相；以pH6~7的磷酸盐缓冲盐液作为水相；在1000~1500r·min-1的转速下，将有机相匀速缓慢滴入40~50℃保温的水相中，滴毕，继续搅拌2~3h，挥发有机溶剂，得到所述姜黄素长循环脂质体的溶液。本发明的有益效果主要体现在：本发明以乙醇注入法制备Cur-LCL，工艺简单，包封率较高，粒径较小，体外释放缓慢，体内药动学数据显示其血浆清除率明显降低，半衰期显著延长，有一定长循环作用。
【专利说明】一种姜黄素长循环脂质体的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种姜黄素长循环脂质体的制备方法。
【背景技术】
[0002]姜黄素(Curcumin，Cur)是中药姜黄的主要活性成分，属于多酚类化合物，现代研究已经明确证明其具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化等多种药理作用，且毒副作用小，临床应用前景良好。但由于姜黄素水溶性差，易被氧化，体内代谢迅速，生物利用度低的缺陷限制了姜黄素的推广发展。脂质体(Liposomes)作为药物新型给药系统具有靶向性，缓释性，降低药物毒性和提高药物稳定性的优点。但是作为药物载体普通脂质体作用时间仍然不理想，且长期储存易聚集稳定性欠佳。
【发明内容】
[0003]为了提高姜黄素稳定性降低其在血浆内的消除速率，本发明提供了一种姜黄素长循环脂质体的制备方法。
[0004]本发明采用的技术方案是:一种姜黄素长循环脂质体的制备方法，所述方法包括:称取质量之比为1: 30-50: 3飞:f3的姜黄素、大豆卵磷脂、胆固醇和聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺，溶于乙醇中作为有机相；以pH6~7的磷酸盐缓冲盐液作为水相；在100(Tl50 0 r ^mirT1的转速下，将有机相匀速缓慢滴入4(T50°C保温的水相中，滴毕，继续搅拌2~3h，挥发有机溶剂，得到所述姜黄素长循环脂质体的溶液。
[0005]本发明采用聚乙二醇(PEG)修饰的长循环脂质体，能够提高脂质体的亲水性，减弱血浆蛋白的调理作用，逃避网状内皮系统对其的识别，降低与单核吞噬细胞的亲和力，可在循环系统中稳定存在并使半衰期延长，增加肿瘤组织对它的摄取。
[0006]优选的，所得姜黄素长循环脂质体的溶液进一步在_80°C预冻IOh后真空冷冻干燥，得姜黄素长循环脂质体冻干粉，冷冻保存备用。
[0007]优选的，所述姜黄素、大豆卵磷脂、胆固醇和聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺质量用量之比为3: 100: 10: 5，有机相中姜黄素浓度为1.5mg/mL。
[0008]本发明的有益效果主要体现在:本发明以乙醇注入法制备Cur-LCL，工艺简单，包封率较高，粒径较小，体外释放缓慢，体内药动学数据显示其血浆清除率明显降低，半衰期显著延长，有一定长循环作用。
【专利附图】
【附图说明】
[0009]图1为Cur-LCL的透射电镜照片(X 60000)。
[0010]图2为Cur-LCL的粒径分布。
[0011]图3为Cur-LCL的Zeta电位分布。
[0012]图4为Cur原药、Cur脂质体、Cur长循环脂质体的体外释药曲线(n=3)。
[0013]图5为空白大鼠血浆(A)、空白大鼠血浆加Cur内标物(B )、尾静脉给药Cur-LCL后大鼠血浆样品加内标后(C )的高效液相色谱图。
[0014]图6为大鼠尾静脉给药Cur原药、Cur脂质体混悬液、Cur长循环脂质体混悬液后的药时曲线。
【具体实施方式】
[0015]下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此:
实施例1:
1.仪器与材料 1.1.仪器
CP225D电子天平(德国赛多利斯公司)；UV-1700紫外分光光度计(日本岛津公司)；Agilent 1200高效液相色谱仪(美国Agilent公司);HJ_6B多头磁力加热搅拌机(金坛市金伟实验仪器厂);SCIENTZ-1I D超声波细胞粉碎机(宁波新芝生物科技股份有限公司);pH酸度计(瑞士梅特勒托利多)；Optima超速低温离心机(美国Beckman公司)；Labconco冷冻干燥机(美国Labconco公司),Marvern measurement粒度测定仪(英国马尔文仪器有限公司)，JEM-1200EX透射电子显微镜(日本JEOL公司)。
[0016]药品与试剂
姜黄素(成都普思生物技术有限公司，含量>98%，批号12041502);姜黄素对照品(中国食品药品检定研究院，含量98.8%，批号110823-201004);注射用大豆卵磷脂(PC>95%，购自上海太伟药业)；胆固醇(美国Avanti Polar Lipids,纯度>99%);聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(PEG-DSPE，美国Avanti Polar Lipids,纯度>99%);甲醇(色谱纯，美国Honeywell Burdick&Jackson公司，批号10071753);其他试剂均为国产分析纯。
[0017]实验动物
清洁级SD大鼠，雌雄兼用，体重(200±10)g (浙江中医药大学实验动物中心，合格证号:SCXK浙2008-0036);所有动物实验均按照浙江大学动物饲养和使用指南进行。
[0018]方法
2.1姜黄素长循环脂质体的制备
采用乙醇注入法:精密称取姜黄素3.0mg,大豆卵磷脂100.0 mg,胆固醇10.0 mg,DSPE-PEG 5.0 mg溶于2.0mL乙醇作为有机相，pH6.5浓度为0.01 mol.L—1的磷酸盐缓冲盐液作为水相，在1200 r ^mirT1的转速下，将有机相匀速缓慢滴入50 °C保温水相中，滴毕，继续1200 r.mirT1搅拌2 h，挥发有机溶剂，得姜黄素长循环脂质体的溶液，将其在_80°C预冻10 h后真空冷冻干燥，即得姜黄素长循环脂质体冻干粉。
[0019]称取15mg Cur原药于容量瓶中，用2mL的乙醇超声溶解,用10%的轻丙基-β-环糊精稀释至刻度，得Cur原药混悬液。
[0020]称取适量姜黄素脂质体(除原料中无DSPE-PEG外，制备方法与Cur-LCL相同)和姜黄素长循环脂质体冻干粉各300mg，复溶于4mL的生理盐水中，得姜黄素脂质体混悬液和姜黄素长循环脂质体混悬液。
[0021]2.2形态、粒径和Zeia电位
取适量姜黄素长循环脂质体混悬液滴于铜网上，静置10 min后用滤纸片吸干，再滴加2.0% (w/w)磷钨酸溶液于铜网上负染I min，自然挥干，用透射电子显微镜观察形态并摄制照片；取姜黄素长循环脂质体混悬液，适量蒸馏水稀释后，采用激光粒度测定仪测定平均粒径、粒径分布和Zeia电位。
[0022]2.3包封率和载药量的测定
2.3.1色谱条件
色谱柱:Agilent Extend_C18 柱(250 mmX4.6 mm, 5 μ m);流动相:乙腈-2%醋酸的水(53:47);检测波长:420 nm ;流速:1.0 mL.mirT1 ;柱温:35°C ;进样体积:20 μ L。 [0023]2.3.2线性关系考察
精密称取Cur标准品适量，置50 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，得质量浓度为100.0 yg -mr1的Cur对照品储备液。分别精密量取储备液适量于10 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，得浓度分别为1.0,2.0,4.0,8.0、16.0,32.0,64.0 μg.mL—1的系列对照品溶液，按“2.3.1”项下Cur色谱条件测定，以峰面积积分值(A)对质量浓度(C)进行线性回归，得回归方程乂二 86.089C - 8.7642 Cr 二 7)，表明 Cur 在 1.0 ~64.0 μ g.mL-1 内峰面积与药物浓度呈良好的线性关系。
[0024]2.3.3包封率和载药量测定
精密量取姜黄素长循环脂质体混悬液1.5mL，置于具塞离心管中，40 000 r ^mirT1离心40 min，取上清液I mL于10 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，经0.22 μπι微孔滤膜滤过，取续滤液按“2.3.1”项下色谱条件分别测定游离Cur含量；另取姜黄素长循环脂质体混悬液I mL于10 mL容量瓶中，用甲醇破乳并稀释至刻度，经0.22 μπι微孔滤膜滤过，续滤液按“2.3.1”项下色谱条件分别测定姜黄素长循环脂质体中总的Cur含量；按下列公式分别计算脂质体中Cur的包封率(EE %)和载药量(DL %)。
[0025]EE % = (W0 - W1)/ W0XlOO %
DL % = (W0 - W1)/ WtXlOO %
其中，W。为Cur-LCL中的总药物量J1为脂质体中的游离药物量；Wt =Cur-LCL的总重量。
[0026]2.4体外释药研究
选取含30 % (v/v)乙醇的pH 5.8 PBS溶液为释放介质，考察的体外释药行为。分别精密称取适量Cur原药、姜黄素脂质体(Cur-Lips)和姜黄素长循环脂质体(Cur-LCL)各3份(含Cur均为I mg),分散于2 mL释放介质,置于预先处理过的透析袋(伽=7000 Da)内，排除气泡后密封，置于200 mL释放介质中，于(37 土 0.5 VC恒温水浴振荡(75 r-mm1),于 0.25,0.5,0.75、1、1.5、2、2.5、3、4、5、6、8、12、18、24 h 准确取样 lmL，并立即补加等量同温新鲜释放介质，样品经0.22 μ m微孔滤膜滤过，取续滤液按“2.3.1”项下色谱条件测定释放介质中药物含量，计算累积释药率(Q %)。
[0027]2.5姜黄素长循环脂质体大鼠体内药动学研究
2.5.1血浆样品处理
精密移取血浆样品200 UL置2 mL具塞离心管中定量加入15 μ g.mL—1内标物40μ L,加入0.6mL乙酸乙酯，润旋混合3 min,于10 000 r ?mirT1离心10 min,移取、有机上清液，再加入0.6mL乙酸乙酯萃取重复萃取一次,合并萃取液，30°C真空干燥,残洛用200 μ L甲醇溶解，充分润旋振荡后于10 000 r.mirT1离心10 min,取上清液20 μ L进样分析。[0028]2.5.2血浆中Cur测定方法的建立 标准曲线的制备:
配制浓度为0.2,0.4,0.6,0.8、1、2、4、6、8、10 μδ.mL—1的一系列姜黄素标准品溶液，和浓度为15 μ g -mr1的大黄素标准品储备液。精密吸取不同浓度的姜黄素200 μ L和大黄素标准储备液40 μ L于EP管中，真空干燥后，分别加入空白血浆200 yL，高速涡旋3min，按照“2.5.1”项下方法处理血浆并进样测定，以待测药物的峰面积As与内标物峰面积Ai之比AsAi为纵坐标，以姜黄素浓度(X)为横坐标，进行线性回归，建立标准曲线方程。
[0029]色谱条件:
色谱柱:Agilent Extend_C18 柱(250 mmX4.6 mm, 5 μ m);流动相:乙腈-2%醋酸的水(53:47);检测波长:420 nm ;流速:1.0 mL.min—1 ;柱温:35 V ;进样体积:20 μ L。
[0030]方法专属性考察:
大鼠空白血浆、空白血浆加Cur，空白血浆加大黄素以及大鼠尾静脉注射Cur-LCL后取血按照“2.5.1”处理后的样品，经HPLC分析测定。
[0031]萃取回收率:
将0.2、1、10的低、中、高3种浓度的Cur血浆样品，按“2.3.1”项下方法处理
后进样测定各个浓度Cur及内标物的峰面积，相应浓度的姜黄素和内标物的甲醇溶液进样测定，得峰面积，将经萃取的血浆样品峰面积与其在甲醇中的峰面积相比即得姜黄素内标物在血浆中萃取回收率。
[0032]方法回收率与精密度测定:将0.2、1、10的低、中、高3个质量浓度的血浆样品，按“2.5.1”项下方法处理后进样测定，每个浓度平行测定3次，计算回收率。分别在日内测定5次，连续测定5天(每天I次)，计算日内和日间精密度。
[0033]2.5.3给药方案及血样采集
取健康SD大鼠18只，体重(200 ± IOg)禁食12 h，自由饮水，随机分为3组，每组6只。按Cur 15 mg.kg—1单剂量尾静脉注射分别给予Cur混悬液、Cur脂质体混悬液，Cur长循环脂质体混悬液，给药后分别于5、10、20、30、45、60、90、120、180、240、360、480 min经股动脉取血0.5 mL，置肝素钠预处理的2 mL具塞离心管中，3 000 r.mirT1离心10 min，定量吸取血浆200 μ L，按“2.5.1”项下方法处理。每次取血后立即用注射器给予等量的0.9 %生理盐水。
[0034]3 结果
3.1姜黄素长循环脂质体的性质
透射电镜下观察Cur-LCL呈类圆形，大小及分布较均匀，粒子间未见粘连和聚集(图1)。粒径分布结果显示，平均粒径为(110 ± 3.20 )nm,多分散系数为(0.259 ± 0.007 )(图2 );Zeta电位为(-5.8±0.87)mV (图3)。测得姜黄素包封率为(80.25 ± 1.61)%，载药量为(2.16 ± 0.03)%。
3.2姜黄素脂质体的体外释药
在pH 5.8 PBS介质(含体积分数30 %乙醇)中Cur体外释药曲线见图4。Cur原药在释放介质中释药较快，2 h累积释药百分率分别为67.5%，4 h时基本释放完全，累积释放百分率为95.96 %。Cur-Lips在4 h时累积释药百分率分别为49.16 %，8 h时累计释放82.48%，12 h累计释放率95.34%，具有缓释特征；而Cur-LCL在第8 h累积释药百分率只有55.48%, 24 h累计释放88.92 %,与Cur原药组和Cur-Lips组相比具有显著缓释特征。
[0035]释放曲线说明，Cur-Lips和Cur-LCL在3 h内释药较快，Cur-Lips有40%药物突释，Cur-LCL有30%的药物突释，可能是脂质体表面吸附的药物释放弓丨起的，之后Cur-LCL表现了更好的缓释性能，主要原因可能是PEG长链在纳米粒表面形成了水化层，可有效阻止药物扩散。结果表明Cur-Lips在12 h基本释放完全，而Cur-LCL在24 h才达到完全释放，说明Cur-LCL缓释特性良好。
[0036]3.3药动学研究
3.3.1方法专属性
空白大鼠血浆、空白大鼠血浆加Cur和内标、及大鼠尾静脉注射给药Cur-LCL后加内标物的血浆样品HPLC色谱图见图5。由图5可知，所建立的方法分离效果好，专属性强，且能与内标物充分分离，血浆中杂质或内源性物质均不干扰测定。
[0037]3.3.2萃取回收率考察
低、中、高3种血浆浓度Cur萃取回收率分别为81.30+3.72%,82.79±5.96%、84.13±4.12%，内标物的萃取回收率为90.27±1.77%，符合方法学要求。
[0038]3.3.3标准曲线与方法学考察结果
血浆中Cur的标准曲线方程为J = 0.5725C + 0.02(r = 0.9995)，表明Cur血浆质量浓度在0.2~10 Pg.mL—1内线性关系关系良好。
[0039]3.3.4精密度、方法回收率、萃取回收率考察
低、中、高3种血浆浓度Cur的方法回收率分别为(91.24±5.69) %、(92.73±2.85) %、(94.85±2.11);日内 RSD 分别为 6.35 %A.32 %、3.15 % ;日间 RSD 分别为 5.71 %Α.62%、4.73 %； 3.3.5血药浓度-时间曲线与药动学参数大鼠尾静脉注射Cur混悬液、Cur-Lips和Cur-LCL混悬液后，平均血药浓度-时间曲线见图6。数据经拟合后符合开放式二室模型，所得主要药动学参数见表1，并对其进行统计学分析。由表1可知，脂质体组(Cur-Lips和Cur-LCL)和原药组相比，血浆消除速率(CL)均显著减慢，t1/2显著延长(ρ〈0.01), AUC显著提高(ρ〈0.01),并且Cur-LCL 的 t1/20 与 Cur-Lips 相比也延长(ρ〈0.05)。说明Cur制成长循环脂质体能显著延缓了药物的消除。
[0040]表1:大鼠尾静脉给药后药动学参数(mean土SD, n=6)
【权利要求】
1.一种姜黄素长循环脂质体的制备方法，所述方法包括:称取质量之比为1: 30-50:3飞:f3的姜黄素、大豆卵磷脂、胆固醇和聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺，溶于乙醇中作为有机相；以pH6~7的磷酸盐缓冲盐液作为水相；在100(Tl500 r.mirT1的转速下，将有机相匀速缓慢滴入4(T50°C保温的水相中，滴毕，继续搅拌2~3h，挥发有机溶剂，得到所述姜黄素长循环脂质体的溶液。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所得姜黄素长循环脂质体的溶液进一步在-80°C预冻IOh后真空冷冻干燥，得姜黄素长循环脂质体冻干粉，冷冻保存备用。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述姜黄素、大豆卵磷脂、胆固醇和聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺质量用量之比为3: 100: 10: 5，有机相中姜黄素浓度为.1.5mg/mL。
【文档编号】A61P39/06GK103637988SQ201310414165
【公开日】2014年3月19日 申请日期:2013年9月11日 优先权日:2013年9月11日
【发明者】李范珠, 尤佳, 王国伟, 魏颖慧, 徐骏军, 郭曼曼 申请人:浙江中医药大学