聚合物纳米颗粒、其制备方法及疫苗组合物、疫苗制剂及其制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种聚合物纳米颗粒、其制备方法及疫苗组合物、疫苗制剂及其制备方法。该聚合物纳米颗粒包括作为外壳的季胺盐修饰的多糖和作为内核的视黄醛，其中，所述视黄醛通过腙键接枝于所述季胺盐修饰的多糖上。腙键具有pH敏感性，只在特定的pH环境下才会断裂而实现所负载的疫苗的完整释放，不会破坏该疫苗结构，因此该聚合物纳米颗粒具有较高的稳定性；并且，由于视黄醛和季铵盐修饰的多糖本身的特性，在体内能够生物降解或转化成无毒害的物质，使得该聚合物纳米颗粒具有较高的生物相容性。
【专利说明】聚合物纳米颗粒、其制备方法及疫苗组合物、疫苗制剂及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及高分子纳米材料【技术领域】，特别是涉及一种聚合物纳米颗粒、其制备方法及疫苗组合物、疫苗制剂及其制备方法。
【背景技术】
[0002]近几年来随着纳米技术的快速发展，一系列安全可降解的纳米材料(如脂质体、聚合物纳米颗粒、纳米凝胶等)为疫苗和免疫佐剂的研制提供了全新的思路。纳米材料的作用主要包括以下几方面:1、负载多种理化性质不同的抗原，保护抗原不被降解；2、促进树突状细胞(dendritic cell, DC)等抗原呈递细胞对抗原疫苗的摄取和呈递；3、调控抗原在细胞和组织中的输运和释放；4、部分纳米材料还能诱导DC等抗原呈递细胞活化。
[0003]聚合物物纳米颗粒具有较大的比表面积，能够较好地负载疫苗而发挥疫苗的免疫效力。因此，基于纳米材料尤其是聚合物纳米颗粒的新型疫苗载体系将成为突破瓶颈的重要技术手段，推动肿瘤疫苗和肿瘤免疫治疗的发展与革新。
[0004]然而，现有的聚合物纳米颗粒仍然存在许多不足，如稳定性较差，生物相容性不是非常良好，不能在体内完全降解和代谢，制备方法较为复杂且不能很好的控制聚合物纳米颗粒的粒径大小，从而不能有效地促进疫苗的免疫效力，这些缺点的存在很大程度上限制了聚合物纳米颗粒的产业转化和应用。
【发明内容】
[0005]基于此，有必要提供一种生物相容性较好、稳定性较好的聚合物纳米颗粒。
[0006]进一步，提供一种聚合物纳米颗粒的制备方法。
[0007]进一步，还提供一种疫苗组合物、疫苗制剂及其制备方法。
[0008]一种聚合物纳米颗粒，包括作为外壳的季胺盐修饰的多糖和作为内核的视黄醛，其中，所述视黄醛通过腙键接枝于所述季胺盐修饰的多糖上。
[0009]在其中一个实施例中，所述季胺盐修饰的多糖和视黄醛的质量比为10?100:20 ?500。
[0010]在其中一个实施例中，所述季胺盐修饰的多糖为季胺盐修饰的葡聚糖、季胺盐修饰的海藻酸钠、季胺盐修饰的透明质酸、季胺盐修饰的肝素、季胺盐修饰的硫酸软骨素、季胺盐修饰的支链淀粉、季胺盐修饰的果胶、季胺盐修饰的直链淀粉或季胺盐修饰的环糊精。
[0011]在其中一个实施例中，所述视黄醛为全反式视黄醛或11-顺视黄醛。
[0012]在其中一个实施例中，所述聚合物纳米颗粒的水合粒径为90纳米?120纳米。
[0013]一种聚合物纳米颗粒的制备方法，包括如下步骤:
[0014]在多糖的羟基上连上联肼得到连上联肼的多糖，将视黄醛和所述连上联肼的多糖溶于有机溶剂中，于常温反应12?48小时，透析后得到含有多糖-视黄醛两亲性聚合物的水溶液；及
[0015]向所述含有多糖-视黄醛两亲性聚合物的水溶液中加入季胺盐，混合均匀后于室温下反应24?48小时，分离纯化得到所述聚合物纳米颗粒。
[0016]在其中一个实施例中，所述在多糖的羟基上连上联肼得到连上联肼的多糖的步骤包括:
[0017]将所述多糖溶于第一溶剂中，然后加入吡啶和氯甲酸对硝基苯酯，并加入催化剂，在冰浴条件下反应4?24小时，分离纯化并干燥后得到中间产物 '及
[0018]将所述中间产物溶于第二溶剂中，加入水合肼，反应12?48小时，分离纯化并干燥后得到所述连上联肼的多糖。
[0019]一种疫苗组合物，包括上述聚合物纳米颗粒和负载于所述聚合物纳米颗粒上的疫苗。
[0020]在其中一个实施例中，所述疫苗为蛋白质疫苗、多肽疫苗或基因疫苗。
[0021]在其中一个实施例中，所述聚合物纳米颗粒和疫苗的质量比为I?100:1?20。
[0022]一种疫苗制剂，包括超纯水和溶解于所述超纯水中的上述任一项所述的疫苗组合物。
[0023]在其中一个实施例中，所述疫苗的浓度为5?20微克/毫升。
[0024]一种疫苗制剂的制备方法，包括如下步骤:
[0025]将上述聚合物纳米颗粒溶于超纯水中，然后加入疫苗，混合均匀后于37°C下孵育30分钟得到所述疫苗制剂。
[0026]上述聚合物纳米颗粒的视黄醛通过腙键接枝于季铵盐修饰的多糖上，腙键具有pH敏感性，只在特定的PH环境下才会断裂而实现所负载的疫苗或药物的完整释放，不会破坏该疫苗和药物结构，因此该聚合物纳米颗粒具有较高的稳定性；并且，由于视黄醛和季铵盐修饰的多糖本身的特性，在体内能够生物降解或转化成无毒害的物质，使得该聚合物纳米颗粒具有较高的生物相容性。
【专利附图】
【附图说明】
[0027]图1为一实施方式的聚合物纳米颗粒的结构示意图；
[0028]图2为一实施方式的聚合物纳米颗粒的制备方法的流程图；
[0029]图3为图2所示的聚合物纳米颗粒的制备方法的示意图；
[0030]图4为一实施方式的疫苗组合物的结构示意图；
[0031]图5为一实施方式的疫苗制剂的制备方法的示意图；
[0032]图6为实施例1制备的聚合物纳米颗粒的透射电镜图；
[0033]图7为实施例1制备的聚合物纳米颗粒的毒性检测实验结果图；
[0034]图8为实施例1制备的聚合物纳米颗粒对小鼠骨髓来源的树突状细胞对抗原的摄取的影响实验结果图；
[0035]图9为实施例1制备的聚合物纳米颗粒对对小鼠抗OVA的抗体水平的表达的影响。
【具体实施方式】
[0036]为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的【具体实施方式】做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。
[0037]请参阅图1，一实施方式的聚合物纳米颗粒100，包括多为外壳10的季铵盐修饰的多糖和作为内核30的视黄醛。季铵盐修饰的多糖为亲水性外壳，视黄醛为疏水性内核，视黄醛和季铵盐修饰的多糖形成疏水-亲水两亲性核-壳结构，外壳10和内核30通过腙键20连接。图1中，12表示多糖链，14表示连接于多糖链上的季铵盐。
[0038]多糖为天然多糖。天然多糖具有较高的稳定性、安全、低毒性、亲水性、易于化学修饰和可生物降解等特性。季铵盐修饰的多糖是指将季铵盐连接在多糖的羟基上得到的经修饰的多糖。季铵盐修饰的多糖带有很强的正电荷，能够较好地负载带负电荷的生物大分子，如蛋白质、多妝、基因、siRNA等物质。
[0039]季铵盐优选为氯化缩水甘油三甲基铵、乙二胺氢溴酸盐或者溴乙胺氢溴酸盐。
[0040]优选地，季铵盐修饰的多糖为季铵盐修饰的葡聚糖(Dextran)、季铵盐修饰的海藻酸钠(Alginate)、季铵盐修饰的透明质酸(Hyaluronic acid)、季铵盐修饰的肝素(Heparin)、季铵盐修饰的硫酸软骨素(Chondroitin sulphate)、季铵盐修饰的支链淀粉(Pullulan)、季铵盐修饰的果胶(Pectin)、季铵盐修饰的直链淀粉(Amylose)或季铵盐修饰的环糊精(Cyclodextr in)。
[0041]更优选地，季铵盐修饰的多糖为季铵盐修饰的葡聚糖。葡萄糖作为一种水溶性且分子量均一的多糖，是形成聚合物纳米颗粒的最佳候选材料之一。葡聚糖为葡萄糖通过1，6-糖苷键形成的多聚糖，具有较好的生物相容性、生物可降解性和水溶性，且其降解产物为内源性物质，不会对人体产生任何不良影响。季铵盐修饰的多糖选用季铵盐修饰的葡聚糖使得该聚合物纳米颗粒100具有较高的生物相容性。
[0042]并且，季铵盐修饰的葡聚糖能够克服肿瘤耐药细胞的耐药性，可避免血清蛋白的吸附和内皮网状系统的清除效应，从而延长聚合物纳米颗粒100的体内循环时间。因而，将上述聚合物纳米颗粒100负载抗肿瘤药物用于治疗癌症时，能够延长抗肿瘤药物的作用时间，提高疗效。将该聚合物物纳米颗粒100负载疫苗，有利于促进疫苗的免疫调节作用。
[0043]视黄醛为全反式视黄醛或11-顺视黄醛。
[0044]视黄醛通过腙键20接枝在多糖上。腙键20具有pH敏感性，在细胞浆的弱酸环境下，腙键20就会断裂,使该聚合物纳米颗粒100解体，从而释放该聚合物纳米颗粒100负载的药物或疫苗，该药物或疫苗会从聚合物纳米颗粒100上脱落下来仍然能保持原来的结构不变，不会破坏药物的活性官能团或疫苗的活性。但是这种体系在正常生理PH条件下是稳定的，因而能够在细胞衆中定点释放。
[0045]同时，在细胞浆的弱酸环境下，视黄醛能完整地从季胺盐修饰的多糖上脱落下来，并在体内转化成视黄酸。视黄酸是多功能的细胞功能调节物，其调节范围非常广泛，包括细胞分化、细胞生长、细胞增殖和细胞凋亡等。由视黄醛转化而来的视黄酸能够进一步抑制肿瘤细胞的生长。
[0046]全反式视磺酸对多种肿瘤有抑制作用，例如结肠癌、白血病、消化道肿瘤、肺癌等。并且,全反式视磺酸能够提高肿瘤细胞对抗肿瘤药物的敏感性,有利于提高疗效。此外,全反式视黄酸还能诱导树突状细胞的分化，并且有效地促进机体产生特异性免疫应答。因此，视黄醛优选为全反式视黄醛，以在体内转化为全反式视黄酸。
[0047]优选地，季铵盐修饰的多糖和视黄醛的质量比为10?100:20?500，以较好地综合季铵盐修饰的多糖和视黄醛的作用，使该聚合物纳米颗粒100在获得较高的生物相容性和较高的稳定性的同时，能够延长用该聚合物纳米颗粒100负载的药物、疫苗的作用时间，并使全反式视黄酸与药物、疫苗的协同作用，提高疗效。
[0048]上述聚合物纳米颗粒的100的水合粒径为90纳米?120纳米，粒径均一性较好。
[0049]上述聚合物纳米颗粒100的内核30-视黄醛通过腙键20接枝于外壳10-季铵盐修饰的多糖上，腙键20具有pH敏感性，只在特定的pH环境下才会断裂而实现所负载的药物或疫苗的完整释放，不会破坏该药物的活性基团和疫苗的结构，因此该聚合物纳米颗粒100具有较高的稳定性；并且，由于视黄醛和季铵盐修饰的多糖本身的特性，视黄醛在体内转化成能够抑制肿瘤细胞生长和促进机体产生特异性免疫应答的视黄酸，季铵盐修饰的多糖在体内的降解产物为内源性物质，使得该聚合物纳米颗粒100具有较高的生物相容性。
[0050]由于该聚合物纳米颗粒100具有较高的稳定性，其腙键30只在特定的pH环境下才会断裂，有利于该聚合物纳米颗粒100负载的抗肿瘤药物的定点、靶向释放，可通过实体瘤的高通透性和滞留效应(EPR效应)将聚合物纳米颗粒100被动靶向肿瘤细胞，实现药物在肿瘤部位的有效聚集，提高对肿瘤组织的杀伤力，并降低对正常组织的损害。
[0051]由于腙键30只在特定的pH环境下才会断裂，能够实现蛋白质疫苗、多肽疫苗、基因疫苗等的溶酶体逃逸，促进抗原或基因在胞浆中的快速释放。
[0052]因此，上述聚合物纳米颗粒100是一种非常安全高效的载体，可广泛应用于负载抗肿瘤药物、疫苗等物质。
[0053]用该聚合物纳米颗粒100可同时负载疏水性抗肿瘤药物和疫苗，能够发挥抗肿瘤作用和免疫调控作用，具有较好的疗效。
[0054]请参阅图2，一实施方式聚合物纳米颗粒的制备方法，包括如下步骤:
[0055]步骤SllO:在多糖的羟基上连上联肼得到连上联肼的多糖，将视黄醛和连上联肼的多糖溶于有机溶剂中，于常温反应12?48小时，透析后得到含有多糖-视黄醛两亲性聚合物的水溶液。
[0056]在多糖的羟基上连上联肼得到连上联肼的多糖的步骤包括下述步骤S210和步骤S220。
[0057]步骤S210:将多糖溶于第一溶剂中，然后加入吡啶和氯甲酸对硝基苯酯，并加入催化剂，在冰浴条件下反应4?24小时，分离纯化并干燥后得到中间产物。
[0058]第一溶剂为能够溶解多糖、吡啶、氯甲酸对硝基苯酯和催化剂的溶剂，优选为二甲基亚讽。
[0059]优选地，多糖在第一溶剂中的浓度为50?100mg/mL。
[0060]吡啶的作用是提供碱性环境有利于反应的进行。优选地，吡啶与第一溶剂的体积相等。
[0061]氯甲酸对硝基苯酯作为反应物。优选地，氯甲酸对硝基苯酯的浓度为30?60mg/
mLo
[0062]催化剂为能够催化多糖和氯甲酸对硝基苯酯反应的催化剂，优选为4-( 二甲氨基)吡啶。优选地，催化剂与多糖的质量比为37.2:1000。
[0063]优选地，分离纯化的方法具体为:用乙醇沉淀反应物，再用乙醇洗涤3?4次，然后用乙醚洗涤2次。
[0064]可以理解，分离纯化的方法不限于此，任何可以将上述中间产物提纯的方法均可以用来提纯该中间产物。
[0065]步骤S220:将中间产物溶于第二溶剂中，加入水合肼，反应12?48小时，分离纯化并干燥后得到连上联肼的多糖。
[0066]第二溶剂为能够溶解上述中间产物和水合肼的溶剂，优选为水。
[0067]水合肼过量，以利于反应进行。优选地，中间产物与水合肼的质量比为5:3。
[0068]优选地，分离纯化的方法具体为:用3500截留分子量的透析袋在超纯水中透析3天。
[0069]可以理解，分离纯化的方法不限于此，任何可以将上述连上联肼的多糖提纯的方法均可以采用。
[0070]干燥采用真空冷冻干燥。
[0071]将视黄醛和上述步骤S220得到的连上联肼的多糖溶于有机溶剂中，于常温反应12?48小时，视黄醛通过腙键连接到多糖上，透析后得到含有多糖-视黄醛两亲性聚合物的水溶液。
[0072]有机溶剂为能够溶解视黄醛和连上联肼的多糖的溶剂，优选二甲基亚砜。
[0073]透析的步骤优选为将视黄醛和连上联肼的多糖反应物在二甲基亚砜中透析2?5天，以除去未反应的视黄醛，然后在超纯水中透析2?5天，得到纯净的含有多糖-视黄醛两亲性聚合物的水溶液。
[0074]如图3所示，多糖-视黄醛两亲性聚合物在水溶液中自组装成多糖-视黄醛两亲性聚合物纳米颗粒100’。图3中，12表示多糖-视黄醛两亲性聚合物中的多糖，20表示腙键，30表示视黄醛。
[0075]步骤S120:向含有多糖-视黄醛两亲性聚合物的水溶液中加入季铵盐，混合均匀后于室温下反应24?48小时，分离纯化得到聚合物纳米颗粒。
[0076]季铵盐优选为氯化缩水甘油三甲基铵(GTMAC)、乙二胺氢溴酸盐或者溴乙胺氢溴酸盐。
[0077]季铵盐过量，以利于反应的进行。
[0078]首先向含有多糖-视黄醛两亲性聚合物的水溶液中加入一定量的氢氧化钠，然后加入过量的季铵盐，混合均匀后于室温下反应24?48小时，将季铵盐连接在多糖的羟基上，然后用超纯水透析2?5天，真空冷冻干燥得到聚合物纳米颗粒。
[0079]其中，氢氧化钠在该混合体系中的浓度为2mg/mL。加入氢氧化钠的作用是条件反应体系为碱性，以利于反应的进行。
[0080]如图3所示，含有多糖-视黄醛两亲性聚合物纳米颗粒100’与季铵盐14反应，在多糖链上连接上季铵盐14，生成聚合物纳米颗粒100。
[0081]上述聚合物纳米颗粒的制备方法工艺简单，反应条件温和，能耗低，制备成本低。冻干的聚合物纳米颗粒具有很好的复溶性，在常温下稳定性好便于长期保存。
[0082]并且，这种聚合物纳米颗粒的制备方法所制备的聚合物纳米颗粒粒径可控，重复性好。
[0083]请参阅图4，一实施方式的疫苗组合物200，包括上述聚合物纳米颗粒100和负载于聚合物纳米颗粒100上的疫苗40。
[0084]疫苗40为蛋白质疫苗、多肽疫苗或基因疫苗。
[0085]其中，蛋白质疫苗为病毒、细菌、其他微生物或组织细胞的蛋白质抗原提取物或重组的蛋白抗原。
[0086]多肽疫苗为重组多肽抗原。
[0087]基因疫苗的为DNA、RNA> siRNA和microRNA中的至少一种。
[0088]优选地,聚合物纳米颗粒100和疫苗40的质量比为I?100:1?20。在该质量配比下，能够较好地发挥疫苗40和由视黄醛转化而来的视黄酸的协同作用，提高疗效。
[0089]上述疫苗组合物200使用上述聚合物纳米颗粒100作为载体，该聚合物纳米颗粒100具有pH响应功能，其腙键20能够在溶菌体弱酸环境下断裂，视黄醛脱落而释放疫苗40，使疫苗40能够实现溶酶体逃逸，从而实现疫苗40在细胞浆快速、定点、靶向释放。并且，由于上述聚合物纳米颗粒100具有较高的生物相容性和较低的细胞毒性，使得该疫苗组合物200对人体的毒性比较小，能够广泛应用于临床。
[0090]优选地，上述疫苗组合物200还包括被视黄醛内核30包裹的疏水性抗肿瘤药物(图4未示)。疏水性抗肿瘤药物优选为阿霉素、紫杉醇、多烯紫杉醇、氟尿嘧啶、长春新碱、顺钼、卡钼或视黄酸。
[0091]优选地，疏水性抗肿瘤药物与聚合物颗粒100的质量比为I?20:1?100。
[0092]疫苗、疏水性抗肿瘤药物和由视黄醛转化而来的视黄酸的协同作用，使得该疫苗组合物200能够发挥抗肿瘤和免疫调控作用，提高疗效。
[0093]上述疫苗组合物200使用上述聚合物纳米颗粒100作为载体，该聚合物纳米颗粒100的腙键20能够在溶酶体弱酸环境下断裂而释放疫苗40，该疫苗40的结构没有受到破坏，能够实现疫苗40的快速、定点释放。并且，由于上述聚合物纳米颗粒100具有较高的生物相容性和较低的细胞毒性，使得该疫苗组合物200对人体的毒性比较小，能够广泛应用于临床。
[0094]一实施方式的疫苗制剂，包括超纯水和溶解于超纯水中的上述疫苗组合物200。超纯水和疫苗组合物200形成水溶液针剂。
[0095]优选地，该疫苗组合物200中的疫苗40在超纯水中浓度为5?20 μ g/mL。
[0096]该疫苗制剂的Zeta电位大小约为30?50mv。
[0097]使用这疫苗制剂进行免疫调控治疗肿瘤或感染性疾病，该制剂中的疫苗能够实现溶酶体逃逸，从而实现在胞浆中的快速释放，从而较好地发挥抗肿瘤和免疫调控作用；并且，该制剂对人体的毒性较小，能够在有效进行免疫调控、治疗肿瘤或感染性疾病的同时，极大地减少对人体产生的副作用。
[0098]该疫苗制剂主要用于预防或治疗感染性疾病或恶性肿瘤。应用时，采用皮内注射、皮下注射、肌肉注射或静脉注射进行给药。
[0099]一实施方式的疫苗制剂的制备方法，包括如下步骤:
[0100]将上述聚合物纳米颗粒溶于超纯水中，然后加入疫苗，混合均匀后于37°C下孵育30分钟得到疫苗制剂。
[0101]优选地,聚合纳米颗粒与疫苗的质量比为I?100:1?20。
[0102]请参阅图5，将聚合物纳米颗粒100溶于超纯水中，加入疫苗40，涡旋振荡2分钟，以使聚合物纳米颗粒100和疫苗40充分混合均匀，然后于37°C下孵育30分钟，使疫苗40通过正电荷和负电荷吸引而负载于聚合纳米颗粒100上，形成溶解于超纯水中的疫苗组合物200，得到疫苗制剂。
[0103]上述疫苗制剂的制备方法制备工艺简单，聚合物纳米颗粒100和疫苗40在37 °C下孵育30分钟即能自组装成疫苗组合物200，便于操作、推广。
[0104]当疫苗组合物200还包括疏水性抗肿瘤药物时，制备疫苗制剂同时加入疏水性抗肿瘤药物，聚合物纳米颗粒100、疫苗40和疏水性抗肿瘤药物混合均匀，于37°C下孵育30分钟，疫苗40负载于聚合物纳米颗粒100的外壳10上，疏水性抗肿瘤药物通过疏水作用被疏水内核30包裹，得到含有疫苗40和疏水性抗肿瘤药物的疫苗制剂。
[0105]以下通过具体实施例进一步阐述。
[0106]实施例1
[0107]制备疫苗制剂及其特性研究
[0108](I)制备聚合物纳米颗粒
[0109]将Ig葡聚糖溶于20mL 二甲基亚砜中，待充分溶解后加入20mL吡啶，再加入0.618g的氯甲酸对硝基苯酯和37.2mg4-( 二甲氨基)吡啶，在冰浴条件下反应4小时后用乙醇沉淀，再用乙醇洗涤3次，然后用乙醚洗涤2次，干燥后得到中间产物，将中间产物充分溶解在水中，加入过量水合肼反应24小时，然后采用3500截留分子量的透析袋在超纯水中透析3天，冻干后的得到连上联肼的多糖，将连上联肼的多糖与视黄醛按质量比5:3在二甲基亚砜中反应24小时后，先在二甲基亚砜中透析2天，之后在超纯水中透析3天，得到了含有葡聚糖-视黄醛两亲性聚合物的水溶液，在该水溶液中加入一定量的NaOH(使NaOH的终浓度为2mg/mL)，同时加入过量的氯化缩水甘油三甲基铵，室温反应48小时后，在超纯水中透析3天，真空冷冻干燥后得到具有pH响应的聚合物纳米颗粒，表示为CDR。
[0110]上述的聚合物纳米颗粒的透射电镜图参见图6。由图6可看出，该聚合物纳米颗粒的水合粒径为90纳米?120纳米，且粒径均一性较好。
[0111](2)制备疫苗制剂
[0112]将5质量份上述聚合物纳米颗粒溶于一定量的超纯水中，加入I质量份OVA-FITC疫苗，涡旋振荡2分钟，然后于37°C下孵育30分钟，得到疫苗制剂。该疫苗制剂中，OVA-FITC疫苗的终浓度5 μ g/mL。
[0113](3)聚合纳米颗粒的毒性检测
[0114]首先将人乳腺癌MCF-7细胞以5 X 105/mL接种在96孔板中，每孔100 μ L，培养过夜后加入不同浓度的聚合纳米颗粒的水溶液，依次采用了 0.08,0.4、2、10、50和250 μ g/mL六个不同的剂量，每个孔聚合纳米颗粒的水溶液的体积为100 μ L。于37°C、5%C02条件下培养44小时后，每孔加入10 μ 15mg/mL的噻唑蓝(MTT)继续培养4小时后，然后将培养液吸出，每个孔中加入150 μ L 二甲基亚砜，待结晶紫充分溶解后，读取OD49tl的值，实验结果参见图7。通过分析可看出，上述聚合物纳米颗粒具有很低的细胞毒性。
[0115](4)聚合物纳米颗粒对小鼠骨髓来源的树突状细胞对抗原的摄取的影响
[0116]采用流式细胞仪检测小鼠骨髓来源的树突状细胞对上述疫苗制剂中的OVA-FITC疫苗的摄取情况。
[0117]上述疫苗制剂中，聚合纳米颗粒:OVA-FITC疫苗=5:1 (质量比)。
[0118]1、将分离骨髓中的单核细胞诱导培养成树突状细胞(DC)第6天，此时保持DC细胞的密度为lX106/mL，24孔板中每孔1ml。
[0119]2、将上述疫苗制剂加到DC细胞培养液中，培养I小时后，去掉细胞上清，用PBS缓冲液洗涤3次，重悬于FACS buffer中，上机观察带绿色荧光的阳性细胞比例，以上述聚合物纳米颗粒(CDR)作为对照，统计结果，如图8所示。
[0120]由图8可看出，用上述聚合物纳米颗粒负载OVA-FITC疫苗，能促进DC细胞对OVA-FITC疫苗抗原的摄取。
[0121](5)聚合物纳米颗粒对小鼠抗OVA的抗体水平的表达的影响
[0122]用上述疫苗制剂免疫小鼠后，采用ELISA方法检测，观察其对小鼠特异性抗体水平及细胞因子产生的影响。
[0123]实验对象:6?8周C57BL/6雌性小鼠，随机分组，每组5只
[0124]10ug CDR+20ug OVA (每只老鼠剂量)
[0125]150ug CDR+20ug OVA (每只老鼠剂量)
[0126]20ug OVA(每只老鼠剂量)
[0127]检测样品:腹腔注射免疫21天采集的小鼠血清
[0128]检测指标:免疫后第21天血清中OVA特异性抗体IgG的水平
[0129]检测步骤:A、包被:10ug/ml0VA，4°C过夜；
[0130]B、洗板 3 次；
[0131]C、封闭 Ih ;
[0132]D、加样:
[0133]标准品:IgGl:5000 (Poly 1: C免疫35天后老鼠的血清)
[0134]样品:1:5000;
[0135]E、室温孵育2?3h;
[0136]F、洗板 5 次；
[0137]G、加二抗 1:5000;
[0138]H、室温孵育Ih;
[0139]1、洗板 5 次；
[0140]J、加TMB显色液，适时终止；
[0141]上机检测OD45tl。检测结果参见图9。
[0142]以聚合物纳米颗粒作为两组对照。图9中，OVA表示上述疫苗制剂，⑶R-100表示浓度为100 μ g/mL的聚合物纳米颗粒制剂，CDR-150表示浓度为150 μ g/mL的聚合物纳米颗粒制剂。图9显示聚合物纳米颗粒能显著地促进抗OVA的抗体水平的表达。
[0143]综上所述，具有pH响应的阳离子多糖聚合物纳米颗粒CDR，具有很低的细胞毒性，能促进抗原的摄取，具有很好的促进抗原免疫效力的功能，是一种非常安全有效的纳米疫苗载体。
[0144]实施例2
[0145]制备疫苗制剂
[0146](I)制备聚合物纳米颗粒
[0147]将Ig葡聚糖溶于20mL 二甲基亚砜中，待充分溶解后加入20mL吡啶，再加入0.618g的氯甲酸对硝基苯酯和37.2mg4- ( 二甲氨基)吡啶，在冰浴条件下反应24小时后用乙醇沉淀，再用乙醇洗涤4次，然后用乙醚洗涤2次，干燥后得到中间产物，将中间产物充分溶解在水中，加入过量水合肼反应48小时，然后采用3500截留分子量的透析袋在超纯水中透析3天，冻干后的得到连上联肼的多糖，将连上联肼的多糖与视黄醛按质量比5:3在二甲基亚砜中反应12小时后，先在二甲基亚砜中透析3天，之后在超纯水中透析2天，得到了含有葡聚糖-视黄醛两亲性聚合物的水溶液，在该水溶液中加入一定量的NaOH(使NaOH的终浓度为2mg/mL),同时加入过量的乙二胺氢溴酸盐,室温反应48小时后,在超纯水中透析5天，真空冷冻干燥后得到具有PH响应的聚合物纳米颗粒。
[0148](2)制备疫苗制剂
[0149]将20质量份上述聚合物纳米颗粒溶于一定量的超纯水中，加入2质量份OVA-FITC疫苗，涡旋振荡2分钟，然后于37°C下孵育30分钟，得到疫苗制剂。该疫苗制剂中，OVA-FITC疫苗的终浓度为10 μ g/mL。
[0150]实施例3
[0151]制备疫苗制剂
[0152](I)制备聚合物纳米颗粒
[0153]将Ig葡聚糖溶于20mL 二甲基亚砜中，待充分溶解后加入20mL吡啶，再加入0.618g的氯甲酸对硝基苯酯和37.2mg4-( 二甲氨基)吡啶，在冰浴条件下反应16小时后用乙醇沉淀，再用乙醇洗涤4次，然后用乙醚洗涤2次，干燥后得到中间产物，将中间产物充分溶解在水中，加入过量水合肼反应36小时，然后采用3500截留分子量的透析袋在超纯水中透析3天，冻干后的得到连上联肼的多糖，将连上联肼的多糖与视黄醛按质量比5:3在二甲基亚砜中反应30小时后，先在二甲基亚砜中透析3天，之后在超纯水中透析2天，得到了含有葡聚糖-视黄醛两亲性聚合物的水溶液，在该水溶液中加入一定量的NaOH(使NaOH的终浓度为2mg/mL)，同时加入过量的溴乙胺氢溴酸盐，室温反应48小时后，在超纯水中透析4天，真空冷冻干燥后得到具有PH响应的聚合物纳米颗粒。
[0154](2)制备疫苗制剂
[0155]将100质量份上述聚合物纳米颗粒溶于一定量的超纯水中，加入20质量份OVA-FITC疫苗，涡旋振荡2分钟，然后于37°C下孵育30分钟，得到疫苗制剂。该疫苗制剂中，OVA-FITC疫苗的终浓度为20 μ g/mL。
[0156]以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
【权利要求】
1.一种聚合物纳米颗粒，其特征在于，包括作为外壳的季胺盐修饰的多糖和作为内核的视黄醛，其中，所述视黄醛通过腙键接枝于所述季胺盐修饰的多糖上。
2.根据权利要求1所述的聚合物纳米颗粒，其特征在于，所述季胺盐修饰的多糖和视黄醛的质量比为10?100:20?500。
3.根据权利要求1所述的聚合物纳米颗粒，其特征在于，所述季胺盐修饰的多糖为季胺盐修饰的葡聚糖、季胺盐修饰的海藻酸钠、季胺盐修饰的透明质酸、季胺盐修饰的肝素、季胺盐修饰的硫酸软骨素、季胺盐修饰的支链淀粉、季胺盐修饰的果胶、季胺盐修饰的直链淀粉或季胺盐修饰的环糊精。
4.根据权利要求1所述的聚合物纳米颗粒，其特征在于，所述视黄醛为全反式视黄醛或11-顺视黄醛。
5.根据权利要求1所述的聚合物纳米颗粒，其特征在于，所述聚合物纳米颗粒的水合粒径为90纳米?120纳米。
6.一种聚合物纳米颗粒的制备方法，包括如下步骤: 在多糖的羟基上连上联肼得到连上联肼的多糖，将视黄醛和所述连上联肼的多糖溶于有机溶剂中，于常温反应12?48小时，透析后得到含有多糖-视黄醛两亲性聚合物的水溶液；及 向所述含有多糖-视黄醛两亲性聚合物的水溶液中加入季胺盐，混合均匀后于室温下反应24?48小时，分离纯化得到所述聚合物纳米颗粒。
7.根据权利要求6所述的聚合物纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述在多糖的羟基上连上联肼得到连上联肼的多糖的步骤包括: 将所述多糖溶于第一溶剂中，然后加入吡啶和氯甲酸对硝基苯酯，并加入催化剂，在冰浴条件下反应4?24小时，分离纯化并干燥后得到中间产物 '及 将所述中间产物溶于第二溶剂中，加入水合肼，反应12?48小时，分离纯化并干燥后得到所述连上联肼的多糖。
8.一种疫苗组合物，其特征在于，包括如权利要求1?5任一项所述的聚合物纳米颗粒和负载于所述聚合物纳米颗粒上的疫苗。
9.根据权利要求8所述的疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗为蛋白质疫苗、多肽疫苗或基因疫苗。
10.根据权利要求8所述的疫苗组合物，其特征在于，所述聚合物纳米颗粒和疫苗的质量比为I?100:1?20。
11.一种疫苗制剂，其特征在于，包括超纯水和溶解于所述超纯水中的如权利要求8?10任一项所述的疫苗组合物。
12.根据权利要求11所述的疫苗制剂，其特征在于，所述疫苗的浓度为5?20微克/晕升。
13.一种疫苗制剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤: 将如权利要求1?5任一项所述的聚合物纳米颗粒溶于超纯水中，然后加入疫苗，混合均匀后于37°C下孵育30分钟得到所述疫苗制剂。
【文档编号】A61K39/00GK104436202SQ201310416450
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2013年9月12日 优先权日:2013年9月12日
【发明者】马轶凡, 李萍, 王策, 蔡林涛 申请人:中国科学院深圳先进技术研究院