一种用于抗氧化的组合物及其制备方法和用途
【专利摘要】本发明公开了一种用于抗氧化的组合物，它是由下述原料制备而成的制剂：虎杖提取物、姜黄提取物、绿茶提取物、α-硫辛酸和辅酶Q10。本发明还公开了前述组合物的制备方法和用途。本发明将虎杖提取物、姜黄提取物、绿茶提取物、α-硫辛酸、辅酶Q10组合使用，具有明显抗氧化作用，能有效抑制氧自由基的生成，可用于治疗和/或预防缺血再灌注损伤。
【专利说明】一种用于抗氧化的组合物及其制备方法和用途
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及一种用于抗氧化的组合物。
【背景技术】
[0002]氧在生物体内通过单电子还原产生化学性质活泼的物质称为活性氧，包括超氧负离子自由基、过氧化氢、和羟基自由基等。氧自由基可以与DNA、蛋白质和多元不饱和脂肪酸作用，造成DNA链断裂和氧化性损伤、蛋白与蛋白及蛋白与DNA间发生交联和脂质过氧化。脂质过氧化是造成生物体氧化损伤的主要原因。脂质过氧化造成生物膜结构和功能的破坏，从而引起癌症、衰老、心血管疾病等一系列慢性疾病。因此，抗氧化对健康有着极其重要的作用，日益引起人们的关注。
[0003]虎杖为寥科植物虎杖的根茎和根。虎杖的主要化学成分有:游离蒽醌和蒽醌苷，主要为大黄素、大黄素甲醚、大黄酚、蒽苷、迷人醇等；芪类化合物，如白藜芦醇、白藜芦醇苷；原儿茶酸等。白藜芦醇是一种天然活性成分，它能以游离态(顺式、反式)和糖苷结合态(顺式、反式)2种形式在植物药材(虎杖)中分布，其中反式异构体的生物活性强于顺式。大量实验表明，白藜芦醇具有较强的抗氧化作用，能明显降低组织中的丙二醛含量，提高超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶活性，对机体缺血和组织损伤有保护作用(薛岚，中药虎杖的药理研究进展[J].中国中药杂志，2000，25(11):651-653.)。
[0004]姜黄为姜科植物姜黄的干燥根茎。已分离出的姜黄的活性成分有40多种，主要为挥发油和姜黄素类。其中姜黄素是中药姜黄的主要活性成分成分。姜黄素能清除氧自由基而发挥抗氧化活性。姜黄素可提高大鼠心肌耐缺氧能力，对大鼠心肌的缺血性损伤具有一定的保护作用，并推测该作用可能主要与抗自由基的活性有关，此外，其稳定细胞膜，提高超氧化物歧化酶活性等可能也起一定作`用(韩婷等，姜黄的化学成分及药理活性研究进展[J].解放军药学学报，2001，17(2):95-97)。
[0005]绿茶是未经发酵制成的茶，较多的保留了鲜叶的天然物质。茶多酚(teatolyphenols)是绿茶药效的主要活性成分，占茶叶干重的15%_20%，其主要组分为儿茶素(catechins)。茶多酚具有消除自由基、抗氧化等生物活性，在抑菌、抗病毒、防治心血管疾病、保肝等方面都有良好的功效。实验研究证明，茶多酚可以明显减轻CC14和酒精等引起的肝损伤(饶光宇等，茶多酚对小鼠实验性肝损伤的保护作用[J].中国中药杂志，2001,26(3):191-193;周晓蓉等，绿茶多酚对实验性酒精性肝损伤大鼠的治疗作用[J].世界华人消化杂志，2006，14(1):51-56.)。
[0006]α-硫辛酸(Alpha Lipoic Acid)是一种既具水溶性又具脂溶性的维生素类的物质。α -硫辛酸含有双硫五元环结构，电子密度很高，具有显著的亲电子性和与自由基反应的能力，因此它具有抗氧化性，此外，硫辛酸的巯基很容易进行氧化还原反应，故可保护巯基酶免受重金属离子的毒害。有实验研究证实，α -硫辛酸对肝脏缺血再灌注损伤以及CCl4所致的小鼠急性肝损伤有明显保护作用(齐崧旭等，α-硫辛酸预处理对大鼠肝脏缺血再灌注损伤的实验研究.中外医学研究，2011年29期；杨国宇等，α-硫辛酸对CC14致小鼠急性肝损伤的保护作用.兽药与饲料添加剂，2002年6期)。
[0007]辅酶QlO又名癸烯醌、泛醌，是一种脂溶性醌类化合物，在动植物、微生物细胞内广泛存在。辅酶QlO作为呼吸链中的重要递氢体，是生物体细胞能量生成和细胞代谢的重要因子。辅酶QlO是生物体内最重要的抗氧化剂之一，能清除自由基，防止蛋白质、脂类、DNA等大分子物质被氧化，还能使生育酚的抗氧能力增强(桑艳双等，辅酶QlO的生化作用机理和药物临床应用进展[J].中国医药导刊，2005，7 (5):371-373; SiemieniukE，et al.Coenzyme QlO:its biosynthesis and biological significance in animalorganisms and in humans.Postepy Hig Med Doswj 2005,18(59):150-159)o
[0008]现未见将虎杖提取物、姜黄提取物、绿茶提取物、α -硫辛酸和辅酶QlO配合用于抗化的报道。
【发明内容】
[0009]本发明的目的是提供了一种用于抗氧化的组合物。本发明的另一目的是提供了该组合物的制备方法和用途。
[0010]本发明抗氧化的组合物，是含有下述原料制备而成的制剂:虎杖提取物、姜黄提取物、绿茶提取物、α-硫辛酸和辅酶Q10。
[0011]优选地，所述组合物是含有下述重量配比的原料制备而成的制剂:
[0012]虎杖提取物2~12份、姜黄提取物I~8份、绿茶提取物I~5份、α -硫辛酸I份、辅酶QlO 1份。
[0013]更一步优选地，它是由下述重量配比的原料制备而成的制剂:
[0014]虎杖提取物5份、姜黄提取物4份、绿茶提取物4份、α -硫辛酸1份、辅酶QlO I份。
[0015]所述的虎杖提取物中白藜芦醇含量为15~68%w/w ;所述的姜黄提取物中姜黄素含量为4~35%w/w ;绿茶提取物中绿茶多酚含量为10~40%w/w。
[0016]其中，所述的虎杖提取物中白藜芦醇含量为50% (w/w);所述的姜黄提取物中姜黄素含量为20% (w/w);绿茶提取物中绿茶多酚含量为40% (w/w) ； α -硫辛酸纯度> 98%，所述的辅酶QlO纯度≥98%。
[0017]本发明组合物是由虎杖提取物、姜黄提取物、绿茶提取物、α-硫辛酸、辅酶QlO为活性成分，加上药学或食品中可接受的辅料或辅助性成分制备而成的制剂。
[0018]其中，所述的制剂是口服制剂，包括微乳口服剂、胶囊剂、软胶囊剂、片剂或丸剂。
[0019]本发明还提供了一种制备所述的组合物的方法，它包括如下步骤:
[0020]a、按照前述重量配比，称取各原料；
[0021]b、加上药学或食品中可接受的辅料或辅助性成分制备成常用的制剂。
[0022]本发明还提供了所述的组合物在制备抗氧化药物或保健食品中的用途。
[0023]其中，所述的药物或保健食品是治疗和/或预防缺血再灌注损伤的药物或保健食品。优选地，所述的药物或保健食品治疗和/或预防心肌缺血再灌注损伤的药物或保健食
品O
[0024]缺血再灌注损伤:在缺血的基础上恢复血流后，过量自由基造成的组织器官受损伤。[0025]本发明将虎杖提取物、姜黄提取物、绿茶提取物、α -硫辛酸、辅酶QlO为活性成分组合使用，具有明显抗氧化作用，可用于治疗和预防缺血再灌注导致的氧化损伤，临床应用iu景良好。
[0026]显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
[0027]以下通过实施例形式的【具体实施方式】，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
【专利附图】
【附图说明】 [0028]图1实施例1制备微乳剂的粒径分布图
[0029]图2组合物与各单一组分处理后HUVECs细胞二氢乙锭染色结果
[0030]图3各实施例组合物处理后HUVECs细胞二氢乙锭染色结果
[0031]图4左室收缩压恢复率
[0032]图5静脉血浆中的肌酸激酶MB释放水平
【具体实施方式】
[0033]实验材料:
[0034]虎杖提取物，购自西安瑞林生物科技有限公司，其中白藜芦醇含量为50% (w/w)；
[0035]姜黄提取物，购自西安瑞林生物科技有限公司，其中姜黄素含量为20% (w/w)；
[0036]绿茶提取物，按照蒋丽，不同提取方法对茶多酚理化性质的影响，食品科学，2010，31 (14): 136-139所述的超声波提取法提取，具体方法为:称取一定量的茶叶，粉碎，按固液比20:lml/g加入蒸馏水，调pH至5.0，加入纤维素酶至终浓度为200U/g，反应温度为40°C，以600W超声功率进行超声提取20~30min，浓缩提取液，得绿茶提取物，其中，绿茶多酚含量为40% (w/w)；
[0037]α -硫辛酸购自西安金绿生物工程技术有限公司，纯度≥98% ；
[0038]辅酶QlO购自西安金绿生物工程技术有限公司，纯度≥98%。
[0039]实施例1:本发明微乳剂的制备
[0040]组合物配比:(每IOOmL微乳剂中的含量)
[0041]
虎杖提取物400 mg (5份) 姜黄提取物320mg(4份) 绿茶提取物320 mg (4份) α-硫辛酸80 mg (1份) 辅酶 QlO80 mg (I 份)
[0042]将上述比例混合物24g，先加入100ml的PEG400，混合，加入200ml大豆油，于70°C恒温搅拌混匀，然后加入60ml聚山梨酯80、50ml丙三醇以、1500ml的水，再于70°C恒温搅拌得油相，然后搅拌将油相匀速滴入适量水中，通过乳化分散得到微乳制剂，加水调整终体积至2L。微乳制剂的粒径表征如图1所示。
[0043]实施例2:本发明微乳剂的制备
[0044]组合物配比:(每IOOmL微乳剂中的含量)
[0045]
虎杖提取物600 mg (12份) 姜黄提取物400mg(8份) 绿茶提取物100 mg (2份) α-硫辛酸50 mg (1份) 辅酶 QlO50 mg (I 份)
[0046]制备方法同实施例1。
[0047]实施例3:本发明微乳剂的制备
[0048]组合物配比:(每IOOmL微乳剂中的含量)
[0049]
虎杖提取物480 mg (4份)
姜黄提取物240 mg (2份)
绿茶提取物240 mg (2份)
α-硫辛酸120 mg (1份)
辅酶 QlO120 mg (I 份)
[0050]制备方法同实施例1。
[0051]实施例4:本发明微乳剂的制备
[0052]组合物配比:(每IOOmL微乳剂中的含量)
[0053]
虎杖提取物480 mg (8份)
姜黄提取物300 mg (5份)
绿茶提取物300 mg (5份)
α-硫辛酸60 mg (1份)
辅酶 QlO60 mg (I 份)
[0054]制备方法同实施例1。
[0055]实施例5:本发明微乳剂的制备
[0056]组合物配比:(每IOOmL微乳剂中的含量)
[0057]
虎杖提取物400 mg (2份)
姜黄提取物200 mg (1份)
绿茶提取物200 mg (1份)
Ot-硫辛酸200 mg (1份)
辅酶 QlO200 mg (I 份)[0058]制备方法同实施例1。
[0059]实施例6:本发明胶囊剂的制备
[0060]组合物配比:(每粒胶囊剂中的含量)
[0061]
虎杖提取物300 mg (12份)
姜黄提取物200 mg (8份)
绿茶提取物50 mg (2份)
α-硫辛酸25 mg (1份)
辅酶 QlO25 mg (I 份)
[0062]称取上述比例的混合物，加入淀粉、纤维素、硬脂酸制粒，然后加入明胶和二氧化硅装胶囊，即得胶囊剂。
[0063]实施例7:本发明软胶囊的制备
[0064]组合物配比:(每粒软胶囊剂中的含量)
[0065]
虎杖提取物120 mg (4份)
姜黄提取物60 mg (2份) 绿茶提取物60mg (1份)
α-硫辛酸30 mg (1份)
辅酶 QlO30 mg (I 份)
[0066]称取上述比例的混合物与大豆油、大豆卵磷脂等混合基质按1:1.2混合，加热熔溶，混匀后即得软胶囊内容物；胶皮的制备:按明胶冰:甘油1:0.8:0.4的比例，先将明胶和水放入容器中，加热至80°C，不断搅拌使之溶解，然后加入甘油继续搅拌，待完全溶解后停止加热，自然冷却至室温后作软胶囊材；将上述所得的内容物和软胶囊材在软胶囊压制机上压制，经清洗、干燥、灭菌、包装即得软胶囊。
[0067]实施例8:本发明片剂的制备
[0068]组合物配比:(每粒片剂中的含量)
[0069]
虎杖提取物160 mg (8份)
姜黄提取物IOOmg (5份) 绿茶提取物100 mg ( 5份)
α-硫辛酸20mg (1份)
辅酶 QlO20 mg (I 份)
[0070]称取上述比例的混合物，加入适量淀粉浆过筛混匀后制得湿粒，湿粒烘干后再过筛，然后加入0.6~3%的硬脂酸镁压片，即得片剂。
[0071]实施例9:本发明丸剂的制备
[0072]组合物配比:(每粒丸剂中的含量)
[0073]虎杖提取物90 mg (3份) 姜黄提取物60 mg (2份) 绿茶提取物90 mg (3份)
α-硫辛酸30 mg (1份)
辅酶 QlO30 mg (I 份)
[0074]称取上述比例的混合物，充分粉碎后过六至七号筛，混匀，然后加入蒸馏水泛丸，干燥，即得丸剂。
[0075]以下通过具体药效学试验证明本发明的有益效果。
[0076]试验例I本发明组合物对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)缺氧复氧期间产生的氧自由基的作用(组合物与各单一组分比较实验)
[0077]1、实验方法
[0078]人脐静脉内皮细胞(HUVECs)购于四川大学华西医院科研基地细胞库。荧光染料二氢乙锭(DHE)购于sigma公司，临用前先溶于少量DMSO试剂，然后用细胞培养液稀释至lOymol/Lo取HUVECs细胞(3X IO3)接种于96孔板中，用100 μ L DMEM培养24小时后，分为以下7组:
[0079]
广对照组:加入ICK^L生理盐水；虎杖提取物组:加入ΙΟΟμ]:浓度为12 mg/mL的虎杖提取物溶液(白藜芦醇含量50%);姜黄提取物组:加入IOOpL浓度为1`2 mg/mL的姜黄提取物溶液(姜黄J 索含 Φ.:20%);I绿茶提取物组:加入IOOpL浓度为12 mg/mL的绿茶提取物溶液(茶多酚含量40%);a-硫辛酸组:加入IOOpL浓度为12 mg/mL的a-硫辛酸溶液；辅酶QlO组:加入IOOpL浓度为12 mg/mL的辅酶QlO溶液；、组合物组:加入IOOpL实施例1制备的微乳剂。
[0080]完成处理后，各组细胞分别缺氧处理I小时，然后复氧2小时，然后加入100 μ L荧光染料DHE试剂至终浓度5 μ mol/L,孵育20分钟后，用荧光分光光度计于激发波长/发射波长=480/580nm下测定各组荧光强度。
[0081]所有数据都以均数土标准差表示，并行单因素方差分析(SPSS16.0软件)，P<0.05 表示差异有统计学意义。*p〈0.01，**P〈0.001 vs.对照组；fP<0.01，ip<0.001 vs.组合物组。
[0082]2、实验结果
[0083]实验结果如图2所示，用虎杖提取物，姜黄提取物，绿茶提取物，a-硫辛酸或辅酶QlO单独处理HUVECs细胞，二氢乙锭染色后荧光强度比对照组有不同程度降低，而使用本发明所组合物处理后，二氢乙锭染色后荧光强度显著低于单独使用其中组分的任意一种(ρ〈0.01)。
[0084]实验结果说明，本发明组合物可以减少自由基的产生，具有抗氧化作用，并且，与各组分单独使用相比，相同剂量下，本发明药物组合物的抗氧化作用更优(Ρ〈0.01)，说明本发明组合物内各成分发挥了协同增效的作用。
[0085]试验例2本发明组合物对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)缺氧复氧期间产生的氧自由基的作用(组合物最佳配比筛选实验)
[0086]1、实验方法
[0087]人脐静脉内皮细胞(HUVECs)购于四川大学华西医院科研基地细胞库。荧光染料二氢乙锭(DHE)购于sigma公司，临用前先溶于少量DMSO试剂，然后用细胞培养液稀释至lOymol/Lo取HUVECs细胞(3X IO3)接种于96孔板中，用100 μ L DMEM培养24小时后，分为以下6组:
[0088]
「对照组:加入IOOpL生理盐水；
组合物I组:加入ΙΟΟμΕ实施例1制备的组合物溶液；
I组合物2组:加入IOOpL实施例2制备的组合物溶液；
j组合物3组:加入IOOpL实施例3制备的组合物溶液；
组合物4组:加入IOC^L实施例4制备的组合物溶液；
^组合物5组:加入IOOpL实施例5制备的组合物溶液。
[0089]完成处理后，各组细胞分别缺氧处理I小时，然后复氧2小时，然后加入100 μ L荧光染料DHE试剂至终浓度5 μ mol/L,孵育20分钟后，用荧光分光光度计于激发波长/发射波长=480/580nm下测定 各组荧光强度。
[0090]所有数据都以均数土标准差表示，并行单因素方差分析(SPSS16.0软件)，P< 0.05表示差异有统计学意义。**P〈0.0Olvs.对照组。
[0091]2、实验结果
[0092]实验结果如图3所示，实施例1~5制备的组合物处理HUVECs细胞后，二氢乙锭染色荧光强度比对照组均有明显降低(Ρ〈0.001);其中，组合物I组、组合物3组和组合物4组，二氢乙锭染色荧光强度略低于组合物2组和组合物5组，组合物I组的二氢乙锭染色荧光强度最低。
[0093]实验结果说明，本发明实施例1~5制备的组合物均具有良好的抗氧化作用，其中，实施例1、3、4制备的组合物效果相对较优，实施例1制备的组合物效果最优。
[0094]试验例3本发明组合物对大鼠缺血再灌注期间的氧化应激所致的损伤的作用
[0095]1、实验方法
[0096]成年雄性SD大鼠20只(购于成都达硕生物科技有限公司)，250~350克，随机分为对照组和实验组，每组10只，手术前三天每天分别灌胃给予2.5毫升生理盐水和实施例1所制备的微乳剂。
[0097]实验时，动物腹腔注射戊巴比妥钠(30mg/kg)麻醉，然后仰位固定于手术台，打开BL2410生物机能实验系统，连续记录II导心电图。插入气管插管，并与动物呼吸机相连(呼吸频率60~70次/分钟，潮气量8~12毫升，呼吸比为1: 2，呼吸压力110~210kPa)。颈动脉插管，并下探至左心室，连续记录左心收缩压。股静脉插管，用于推注样品和抽取静脉血。完成后，于胸骨左缘第4~5肋间打开胸腔，暴露心脏，剪开心包膜，轻压大鼠腹部，挤出心脏，在肺动脉干与左心耳之间寻找左前降支(LAD)主干，平左心耳下缘Icm处穿入带5/0缝线的弯针，钩绕LAD，于肺动脉圆锥旁出针。稳定30分钟后，结扎LAD30分钟。结扎成功标志:(I)结扎后5分钟内可见心电图J点或ST段抬高或QRS波增高、增宽与T波融合，呈弓背向上单向曲线；(2)肉眼观察左心室前壁心肌颜色先苍白再转为紫绀。
[0098]缺血完成后开放复灌2小时。收集左室收缩压和静脉血浆中的肌酸激酶MB释放水平。左室收缩压恢复率的组间比较采用重复测量的单因素方差分析；肌酸激酶MB释放水平数据采用t检验比较两两差异，P〈0.05被认为是有显著性差异。
[0099]数据以均数土标准差表示。*P〈0.05vS.对照组。
[0100]2、实验结果
[0101]实验结果如图4~5所示，实验组动物在心脏缺血再灌注期间，左室收缩压的恢复率显著高于对照组(P〈0.05)(如图4)，实验组肌酸激酶MB释放水平显著低于对照组(如图5)。
[0102]实验结果说明，本发明组合物可以抑制缺血再灌注期间的氧化应激，减轻缺血再灌注引起的氧化损伤，治疗和预防心肌缺血再灌注损伤。
[0103]综上，本发明组合物可以减少氧自由基产生，具有良好的抗氧化作用，可用于治疗缺血再灌注损伤，临床应用前景良好。
【权利要求】
1.一种用于抗氧化的组合物，其特征在于:它是由下述原料制备而成的制剂: 虎杖提取物、姜黄提取物、绿茶提取物、α -硫辛酸和辅酶Q10。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于:它是由下述重量配比的原料制备而成的制剂: 虎杖提取物2~12份、姜黄提取物I~8份、绿茶提取物I~5份、α -硫辛酸1份、辅酶QlO 1份。
3.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于:它是由下述重量配比的原料制备而成的制剂: 虎杖提取物5份、姜黄提取物4份、绿茶提取物4份、α -硫辛酸1份、辅酶QlO 1份。
4.根据权利要求1-3任意一项所述的组合物，其特征在于:所述的虎杖提取物中白藜芦醇含量为15~68% (w/w);所述的姜黄提取物中姜黄素含量为4~35% (w/w);绿茶提取物中茶多酚含量为10~40% (w/w);所述α -硫辛酸的纯度> 98% ;所述的辅酶QlO纯度≥ 98%ο
5.根据权利要求1-4任意一项所述的组合物，其特征在于:它是以虎杖提取物、姜黄提取物、绿茶提取物、α -硫辛酸、辅酶QlO为活性成分，加上药学或食品中可接受的辅料或辅助性成分制备而成的制剂。
6.根据权利要求5所述的组合物，其特征在于:所述制剂是口服制剂；优选地，所述口服制剂是微乳剂、胶囊剂、软胶囊剂、片剂或丸剂。
7.一种制备权利要求1-6任意一项所述组合物的方法，它包括如下步骤: a、按权利要求1-6任意一项所述重量配比,称取各原料； b、加上药学或食品中可接受的辅料或辅助性成分制备成常用的制剂。
8.权利要求1-6任意一项所述的组合物在制备抗氧化药物或保健食品中的用途。
9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于:所述的药物或保健食品是治疗和/或预防缺血再灌注损伤的药物或保健食品。
10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于:所述的药物或保健食品治疗和/或预防心肌缺血再灌注损伤的药物或保健食品。
【文档编号】A61K31/122GK103479972SQ201310456671
【公开日】2014年1月1日 申请日期:2013年9月29日 优先权日:2013年9月29日
【发明者】李涛, 杨倩, 张乃月, 冉晓红, 陈艳芳, 刘进 申请人:四川大学华西医院