白莲蒿总黄酮的病理学及其新应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种新的治疗类风湿关节炎的药物，其包含白莲蒿总黄酮作为活性成分，疗效显著，原料来源方便，制备方法简单，有很高的临床应用价值。
【专利说明】白莲蒿总黄酮的病理学及其新应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及医学病理学，具体涉及白莲蒿总黄酮在治疗类风湿性关节炎的药物中的应用。 【背景技术】
[0002]类风湿性关节炎(RA)是一种病因尚未明了的慢性全身性炎症性疾病，以慢性、对称性、多滑膜关节炎和关节外病变为主要临床表现，属于自身免疫炎性疾病。患病早期有关节红肿热痛和功能障碍表现，到达晚期时，关节可出现不同程度的僵硬畸形，并伴有骨和骨骼肌的萎缩，极易致残。RA的特征性表现是滑膜增生，在滑膜与软骨-骨交界处有局灶性侵袭的倾向。研究表明，滑膜细胞凋亡减少是RA发病的主要机制之一。由于滑膜细胞的增殖和凋亡之间的不平衡，亦即以滑膜增殖为主导，最终导致RA局部的病变。因此致力于控制关节局部的滑膜病变，已成为改善RA预后的关键所在。
[0003]Caspase家族是细胞凋亡调控重要因子，这些Caspase蛋白分子均以休眠状态的酶原形式存在于正常细胞中，当细胞进入凋亡时被激活，并可促进半胱氨酸蛋白酶家族的其他成员一起促进细胞凋亡。正是由于此家族的激活最终导致内源性核酸酶的激活和细胞骨架重新组合所致的细胞结构解体，形成不可逆的凋亡，在凋亡过程中处于核心地位的Caspase-3很可能参与了这个过程。正常情况下，胞质中Caspase-3以无活性、相对分子量约为32000的前Caspase-3形式存在，当细胞发生凋亡时，通过Asp-28-Ser_29和 Asp-175-Ser-176两个位点酶切变为有活性Caspase-3，其活化可裂解多种细胞内酶，最终诱导细胞凋亡。
[0004]白莲蒿为菊科蒿属植物，别名万年蒿、铁杆蒿。除高寒地区外，几乎遍布全中国， 各地均有分布，资源丰富；日本、朝鲜、蒙古、阿富汗、印度、巴基斯坦、尼泊尔、俄罗斯、克什米尔地区也有。性味苦，辛，平。具有清热解毒、凉血止痛、祛风利湿之功效。我国民间用于治疗急慢性肝炎、小儿惊风、退热、杀虫、阑尾炎、急慢性胃肠炎、妇女内寒证等；又作为止血药，饲料。现有技术公开了数种白莲蒿总黄酮的提取方法，可以参见相关期刊，特别是在 ZL201210157137.9中公开了其微波提取法，在此将其全部引入本文。
[0005]本发明人进行了系统的研究，发现了白莲蒿总黄酮具有较好的抗类风湿性关节炎活性。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供白莲蒿总黄酮在制备治疗类风湿性关节炎药物中的应用。
[0007]在另一个方面，本发明还提供一种药物组合物，包含白莲蒿总黄酮与药用辅料。
[0008]在一个实施方案中，所述药物组合物为片剂、胶囊剂、滴丸、颗粒剂、注射剂或气雾剂等。
[0009]通常，上述制剂可以使用药学载体或稀释剂以常规方式来制备。在治疗包括人的哺乳动物时，本发明的白莲蒿总黄酮的每日剂量在经口给药时为约0.01至250mg / kg体重，在肠胃外给药时为约0.0Ol至250mg / kg体重。活性成分的常用日剂量可以在较大范围内变化，并将取决于各种因素，比如给药途径，患者的年龄、体重和性别，而且可以由医生根据经验来确定。
[0010]本发明的白莲蒿总黄酮可以单独使用，但是通常将以药物制剂的形式给药，其中所述化合物与药学可接受的稀释剂或载体组合。根据给药方式，所述药物制剂可以包括
0.05至99% w / w,例如0.10至80% w / w的活性成分。
[0011]本发明提供了一种新的治疗类风湿关节炎的药物，而且是从中药提取物中制备的药物，克服了现有治疗类风湿关节炎药物的不足之处，疗效显著，副反应少，原料来源方便，制备方法简单，有较大的临床应用价值。
【具体实施方式】
[0012]实施例1动物药效学试验
[0013]1.材料
[0014]动物选用日本大耳白兔48只,雌雄各半,周龄15~17周,适应性饲养I周后用于实验。
[0015]药物由ZL201210157137.9制备的白莲蒿总黄酮。
[0016]试剂鸡卵蛋白(分子量45000，Ig)，购于上海伯奥生物科技有限公司；弗氏完全佐剂(批号5881，IOmL)，Sigma公司产品。Caspase-3活性检测试剂盒(批号201302)，CytC免疫组化试剂盒(201302)由武汉博士德公司提供。
[0017]2.方法
[0018]2.1模型复制:卵蛋白诱导性兔关节炎模型是通过皮下反复注射抗原致敏，刺激兔体内生成大量抗体，之后在兔关节腔内注入一定剂量的相同抗原，从而产生相应的抗原-抗体复合物沉积在关节滑膜上。此复合物本身不但可以激活补体产生局部炎性反应，而且还可进一步诱导T细胞介导的免疫反应，从而形成慢性滑膜炎、滑膜增生，随后血管增生和炎性细胞浸润逐渐形成血管翳，其覆盖软骨后导致其变性和降解，整个病理过程与人的类风湿性关节炎相似。
[0019]将鸡卵蛋白用无菌生理盐水配制成浓度为20g / L的溶液，取相同体积的弗氏完全佐剂，二者混合数IOmin至混合液完全乳化,制成乳化液最终浓度为10g/L,滴于冰水上5-10min内完全不扩散为合格。从48只日本大耳白兔中随机挑选8只兔作为正常对照组，并将所剩余家兔作为模型诱导组。取上述乳化液ImL在兔肩胛间区分5个部位皮下注射，第2周及第3周分别用相同方法加免疫一次。
[0020]第4周关节炎模型的诱发:将兔固定于手术台上，双膝关节部位剪毛，常规酒精消毒，垂直于皮肤进针1cm，双膝各注射0.5mL鸡卵蛋白溶液(含鸡卵蛋白5mg)，注射后将兔放回原笼自由活动。定期观察家兔的一般状况，四肢关节肿胀、颜色、关节活动情况等变化。
[0021]2.2分组与给药:
[0022]通过观察家兔相继在免疫后出现继发性关节炎症状，四肢出现发红肿胀，检测其膝关节肿胀程度及表面温度。将模型日本大耳白兔随机分为模型对照组、白莲蒿总黄酮低剂量组、白莲蒿总黄酮中剂量组、白莲蒿总黄酮高剂量组、激素组，每组8只。与第5周开始耳缘静脉注射药物。白莲蒿总黄酮低剂量组1.0mg / kg / d、白莲蒿总黄酮中剂量组2.0mg / kg/d、白莲蒿总黄酮高剂量组4.0mg / kg/d,激素组醋酸波尼松龙ImL / d (IOmg), 持续给药2周。
[0023]2.3指标检测
[0024]家兔给药2周后，耳缘静脉空气栓塞处死家兔，耳缘静脉取血，收集家兔关节滑膜组织，滑膜细胞原代培养，将获得滑膜组织采用双酶消化法得到滑膜细胞5% CO2培养箱中孵化0.25%胰蛋白酶消化传代。均采用第3代滑膜细胞用于试验。进行滑膜细胞 Caspase-3, CytC的检测,具体按试剂盒说明书操作。其中CytC阳性细胞数=阳性细胞数/ 计数细胞总数X 100，阳性细胞为光镜下胞质染色呈棕黄色的细胞。
[0025]2.4统计学处理采用SPSS13.0统计软件处理，计量资料用均数土标准差(x土 s) 表示，多组间比较用方差分析，两两比较用q检验，P〈0.05为差异有显著性。
[0026]3.结果
[0027]3.1家兔一般状态的观察
[0028]正常对照组兔随着饲养时间的延长，体重逐渐增加，精神状态好，背毛有光泽，活动自如；而造模兔精神萎靡，活动减少，体重增加缓慢，注射部位出现多处小溃疡，并不断扩大，软组织损伤，最终形成大面积溃烂，活动受限。
[0029]3.2指标检测各组家兔膝关节直径，膝关节表面温度及滑膜细胞Caspase-3、CytC 比较。如表1结果显示:模型组膝关节直径、表面温度均显著升高，与正常组比较由显著性差异(P〈0.01);白莲蒿总黄酮低剂量组，中剂量组，高剂量组均可显著性提高滑膜细胞 Caspase-3、CytC 水平(P〈0.01 或 P〈0.05)。
【权利要求】
1.白莲蒿总黄酮在制备治疗类风湿性关节炎的药物中的应用。
2.一种治疗类风湿性关节炎的药物组合物，包含白莲蒿总黄酮与药用辅料。
3.权利要求2的药 物组合物，其为片剂、胶囊剂、滴丸、颗粒剂、注射剂或气雾剂等。
【文档编号】A61P29/00GK103520241SQ201310478687
【公开日】2014年1月22日 申请日期:2013年10月15日 优先权日:2013年10月15日
【发明者】王敏, 周莉 申请人:王敏, 周莉