一种具有免疫调节活性的重组蛋白asppr及应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种ASP-1蛋白特定片段的重组蛋白ASPPR，所述蛋白具有免疫佐剂活性，适用抗原范围更广，能够与蛋白、多肽以及DNA疫苗配伍，形成具有高效率的疫苗组合物，而且具有较低的自身免疫原性。
【专利说明】—种具有免疫调节活性的重组蛋白ASPPR及应用【技术领域】[0001]本发明涉及一种免疫活性蛋白ASPPR，其表达纯化方法以及其作为免疫调节剂的应用，属于分子生物学和免疫学【技术领域】。【背景技术】[0002]疫苗接种是预防传染病的最有效的途径。现代疫苗已经不仅限于疾病的预防，还广泛用于传染病的治疗及非传染病例如癌症的治疗。传统疫苗主要包括减毒活疫苗和灭活疫苗，新型疫苗包括亚单位疫苗(subunit vaccine)、结合疫苗、合成肽疫苗、基因工程疫苗。新型基因工程疫苗纯度高、特异性强，但分子小，免疫原性相对较差，难以产生有效的免疫应答，需要佐剂来增强其免疫原性或宿主对抗原的保护性应答。由于机体对不同病原体的保护性免疫应答是不同的，研发能诱导针对不同病原保护性应答的疫苗需要不同的佐剂。一直广泛应用于人群疫苗的、美国FDA批准的铝盐佐剂对于许多新型疫苗佐剂活性较差，尤其是其诱导的细胞免疫较弱，对于小分子的抗原无佐剂活性，不能满足新型疫苗发展的需要。因此，新佐剂的研发对于新型疫苗的研发具有重要意义。[0003]新型疫苗佐剂的组成形式多样，来源也不同，主要包括油/水乳剂型、颗粒型、微生物衍生物型佐剂等。迄今为止，已批准上市的新型疫苗佐剂仅有少数几种:MF59、AS04 等。MF59是一种由Chiron公司研发的水包油乳剂，在高压条件下将S烯与Tween-80和 Span85混合后进行微流化，进而形成均一的小滴状乳液，已在欧洲国家批准用于流感亚单位疫苗。该佐剂比铝盐具有更好的免疫效果，但不良反应增加。AS04是2005年2月葛兰素史克公司研发的，是一种乳剂，其新型佐剂系统AS04的乙型肝炎疫苗Fendrix获欧盟批准上市，安全性良好，但临床报道的局部不良反应与其他乙肝疫苗类似，包括注射部位疼痛、头痛和疲乏。这些油/水乳剂型的佐剂都存在着较明显的不良反应，新兴疫苗的研发需要安全有效并适用于蛋白、多肽等多种形式疫苗的佐剂。[0004]活化相关蛋白(activation-associated proteins, ASP)是线虫体内的一种高免疫原性的蛋白，是重要的保护性抗原。研究发现，一种来自盘尾丝虫的Ov-ASP-1作为一种非毒素类的蛋白具有佐剂活性，具有以下特点:(1)使用方便:无需交联，只需与抗原简单混合即可发挥佐剂活性；(2)诱导平衡的免疫应答:能够激发小鼠产生Thl偏倚的、混合的 Thl/Th2免疫应答；(3)适用抗原范围广:不但可以作为蛋白、灭活疫苗的佐剂，而且可以作为多肽抗原的佐剂。[0005]目前有文献报道使用全长为153个氨基酸长度的ASP-1蛋白作为免疫佐剂。但是 ASP-1全长蛋白作为佐剂具有以下缺点:(1)蛋白在大肠杆菌中以包涵体形式表达，复性困难，产量低，导致生产成本增加，限制其作为佐剂应用于疫苗的可行性。蛋白发挥佐剂活性必须形成正确的空间折叠，但是，该蛋白在大肠杆菌中以包涵体形式表达，在复性过程中， 大部分蛋白由于不能形成正确折叠，大量析出；每升菌液得到的活性蛋白数量低，导致获得活性蛋白的成本增高，因而限制了其作为佐剂广泛应用于疫苗的可能性 。(2)自身免疫原性强，可以诱导针对蛋白自身的较高水平的抗体。产生的高水平抗体一方面有可能降低其佐剂活性；另一方面，可能增强对机体的不良反应。[0006]因此，本发明旨在提供一种佐剂活性高、适用抗原范围广、自身免疫原性弱的疫苗佐剂，以满足高效率疫苗组合物的应用。
【发明内容】
[0007]基于以上目的，一方面，本发明首先提供了一种具有佐剂活性蛋白的活性功能片段，所述蛋白是通过生物信息学分析、设计不同的截短片段、在大肠杆菌中的诱导表达、并经过功能鉴定筛选获得的具有佐剂活性的ASP-1蛋白的活性片段ASPPR，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID N0s2所示，其位于ASP-1全长蛋白的第10-153位氨基酸残基位置。[0008]本发明还提供了编码权利要求1所述蛋白质的核苷酸序列。[0009]在一个优选的技术方案中，所述核苷酸序列如SEQ ID NOsl所示。本发明还提供了一种含有上述核苷酸序列的表达载体。[0010]在一个优选的技术方案中，所述载体为PQE-ASPPR。[0011]另一方面，本发明还提供了一种疫苗组合物，所述疫苗组合物含有疫苗活性物质和本发明所提供的作为佐剂成分的上述蛋白质。[0012]在一个优选的技术方案中，所述疫苗活性物质为蛋白质、多肽或DNA。[0013]优选地，所述疫苗活性物质可以为HIV四分支肽或HBsAg。[0014]本发明还提供了所述蛋白ASPPR作为不同形式的抗原/疫苗佐剂的应用，所述应用包括:[0015](I) ASPPR对蛋白抗原(模式抗原OVA和HBsAg)的佐剂活性；[0016](2) ASPPR对多肽类抗原(HIV四分支肽)的佐剂活性；[0017](3) ASPPR对HIV DNA疫苗的佐剂活性；[0018]在一个优选的技术方案中，所述被递送分子为蛋白抗原(0VA和HBSAg),多肽抗原 (HIV四分支肽)和DNA疫苗(HIV DNA疫苗)。将ASPPR蛋白直接与上述抗原或疫苗按照混合均匀即可发挥佐剂活性。[0019]本发明提供的重组蛋白片段长度适中，解决了现有技术存在的因片段长度长，复性难、自身免疫原性强、佐剂活性不高的技术问题，表现除了较高的佐剂活性，而且适用抗原范围更广，能够与蛋白、多肽以及DNA配伍，形成具有高效率的疫苗组合物，而且具有较低的自身免疫原性。【专利附图】
【附图说明】[0020]图1ASPPR表达载体pQE-ASPPR的构建与酶切鉴定；[0021]图2ASPPR的诱导表达、鉴定与纯化；[0022]图3ASPPR对模式抗原`OVA的佐剂活性；[0023]图4ASPPR对HBsAg的佐剂活性；[0024]图5ASPPR对HIV四分支肽的佐剂活性；[0025]图6ASPPR对HIV DNA疫苗的佐剂活性；[0026]图7ASPPR的免疫原性检测。【具体实施方式】[0027]下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改和替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。[0028]试验材料[0029]I菌株及质粒[0030]大肠杆菌DH5a,M15 (购自全式金公司),原核表达质粒pQE30 (Clontech公司)[0031]2主要试剂和仪器[0032]主要仪器有:[0033]水平电泳仪(北京六一仪器厂)，酶联仪(Thermo, Multiskan MK3),高速离心机 (HITACHI, CR22G III) ,ELISPOT Reader (CTL 公司)。[0034]主要试剂有:[0035]胰蛋白胨、酵母提取物购自Oxoid公司，质粒提取试剂盒购自TIANGEN公司，限制性内切酶、T4连接酶购自TAKARA公司，N1-NTA为GENSCRIPT公司产品；最小截留分子量为 3500Da的透析袋Millipore公司产品。[0036]实施例1重组蛋白ASPPR的设计、表达与纯化[0037]1.1重组蛋白ASPPR的设计与筛选:[0038]根据ASP-1的结构特征，设计了包含不同可能活性基团的片段共6个片段，在大肠杆菌中表达，经过体内外初步功能鉴定，筛选获得了其中的一个片段，即从N端起的第 10-153氨基酸残基，共计144个氨基酸残基作为本发明所设计的ASPPR的氨基酸序列。[0039]1.2重组蛋白的表达载体的构建和鉴定:[0040]首先将目的基因经过密码子优化，全基因合成ASPPR，并在其两端分别加入限制性酶切位点BamH I和Hind III，获得包含目的基因的克隆载体pUC57_ASPPR。然后，分别以 BamH I和Hind III双酶切pUC57_ASPPR，获得目的片段ASPPR，定向克隆至原核表达载体 PQE30,经酶切鉴定和测序鉴定，获得重组表达质粒pQE-ASPPR。最后，将鉴定正确的重组表达质粒pQE-ASPPR转化至大肠杆菌M15中，获得包含质粒pQE-ASPPR的重组大肠杆菌。[0041]1.3重组蛋白的表达与纯化:[0042]将包含重组表达质粒的大肠杆菌M15以1:100的比例接种至含有氨苄青霉素 (50μ g/ml)和卡那霉素(10μ g/ml)双重抗性的LB培养基中培养过夜，次日以1:20的比例转接至新的LB中37°C继续孵育，当细菌生长至OD6tltl为0.4~0.6时，IPTG(终浓度ImM)诱导4小时，收获细菌，超声破碎后沉淀用包涵体洗液洗涤，离心后沉淀以SM脲溶解并于4°C 过夜。将4°C过夜的包涵体通过亲和层析法(N1-NTA)纯化蛋白，20，50, 100, 150, 300mM洗脱液逐步洗脱目的蛋白；将纯化蛋白加入透析袋中，依次置于6M、4M、2M脲、Iaemmli缓冲液和PBS中，4°C分别放置12h。经PEG-6000浓缩后，测定浓度备用。[0043]1.4实验结果`[0044]1.4.1成功构建原核表达质粒pQE-ASPPR并获得包含pQE-ASPPR的重组大肠杆菌[0045]图1A显示了本发明ASPPR重组蛋白表达载体的构建示意图；[0046]图1B显示了本发明ASPPR重组蛋白表达载体的酶切鉴定图，泳道M为分子量对照，泳道I为PQE-ASPPR质粒，泳道2为pQE-ASPPR质粒/BamH I，泳道3为pQE-ASPPR质粒 /BamH I+Hind III，泳道3显示双酶切后获得了约3000bp的载体片段和400多bp的目的片段，与本发明的目的蛋白ASPPR编码基因长度完全一致，测序结果进一步证明目的片段完全正确，表明本发明成功完成了包含目的基因ASPPR的原核表达质粒pQE-ASPPR。[0047]1.4.2重组蛋白ASPPR比ASP-1易于复性，蛋白得率较高[0048]重组大肠杆菌经IPTG诱导4小时经过镍柱纯化，目的蛋白主要存在于50_300mM 咪唑洗脱液中，图2A显示了 ASPPR诱导表达产物SDS-PAGE电泳图谱，图2B显示了 Western blot (WB)鉴定图谱；图2C显示了经纯化后ASPPR的SDS-PAGE分析。从图3可以看出本发明的目的蛋白得到了成功表达和纯化。与ASP-1相比，纯化复性后的蛋白得率明显提高，在普通培养条件下，每升培养物可以获得6-8mg的蛋白，而ASP-1仅为2_3mg。[0049]实施例2ASPPR作为佐剂的应用[0050]2.1ASPPR作为蛋白类抗原的佐剂:[0051]将纯化的ASPPR与模式抗原卵白蛋白(OVA)混合，免疫剂量为ASPPR25 μ g/只小鼠，OVAlOyg/只小鼠，HBsAgl μ g/只小鼠,体积为100 μ g/只小鼠,肌肉途径免疫小鼠 BALB/c小鼠，共免疫三次，间隔3周，在末次免疫后2周检测小鼠血清中的特异性抗体IgG。[0052]2.2ASPPR作为多肽类抗原的佐剂[0053]将纯化的ASPPR与HIV四分支肽直接混合，免疫剂量为ASPPR25 μ g/只小鼠，HIV 四分支肽10 μ g/只小鼠,体积为100 μ g/只小鼠,肌肉途径免疫BALB/c小鼠,共免疫三次， 间隔3周，在三免后第2周ELISA法检测小鼠血清中的特异性抗体IgG，IgGl和IgG2a。[0054]2.3ASPPR作为DNA疫苗的佐剂[0055]将纯化的ASPPR与HIV DNA疫苗pJW4303_YYl直接混合，免疫剂量为ASPPR25 μ g/ 只小鼠，HIV DNA8 μ g/只小鼠，体积为100 μ g/只小鼠，肌肉途径免疫5周龄BALB/c小鼠， 共免疫2次，间隔3周，在二免后第2周ELISA法检测小鼠血清中的特异性抗体IgG，ELISPOT 方法检测特异性细胞免疫。[0056]2.4实验结果[0057]2.4.1.ASPPR可以增强OVA的免疫原性[0058]结果显示，ASPPR与ASP-1相比具有相似的佐剂活性。图3为ASPPR (图中以PR 表示)对模式抗原OVA的佐剂活性说明图，其中图3A、B和C分别为BALB/c小鼠接受两次免疫后2周的抗OVA抗体IgG，IgGl和IgG2a。从图3可以看出，ASPPR+0VA免疫小鼠产生的特异性抗体IgG，IgGl和IgG2a与ASP-1相似，但IgG2a显著高于铝佐剂(图中AL表示铝剂佐剂)。[0059]2.4.2.ASPPR可以增`强HBsAg的免疫原性[0060]图4为ASPPR对HBsAg的佐剂活性说明图，其中，图4A为BALB/c小鼠接受初次免疫后3周的抗HBsAg抗体IgG的滴度，图4B为BALB/c小鼠接受二次免疫后3周的抗HBsAg 抗体IgG的滴度。从图4可以看出，与Alum+HBsAg组(铝剂佐剂对照)、HBsAg组(无佐剂对照)和PBS组(空白对照)相比，ASPPR+HBsAg组产生了较高水平的抗HBsAg抗体IgG，表明 ASPPR对HBsAg抗原发挥了显著的佐剂活性；而且在免疫3周时抗体水平高于铝佐剂对照组,说明ASPPR可以加速抗原诱导的免疫应答的产生。[0061]2.4.3.ASPPR可以增强HIV四分支肽的免疫原性[0062]图5为ASPPR对HIV四分支肽的佐剂活性说明图，BALB/c小鼠接受三次免疫后2 周测定抗HIV四分支肽抗体IgG (图5A)、IgGl (图5B)、IgG2a (图5C)。从图5可以看出， 作为多肽抗原的佐剂，ASPPR诱导的抗多肽特异性抗体IgG显著高于铝佐剂对照；而且，能诱导IgG2a抗体的产生，说明ASPPR诱导多肽抗原产生Thl偏倚的Thl/Th2型免疫应答。[0063]2.4.4.ASPPR可以增强DNA疫苗的免疫原性[0064]图6为ASPPR对HIV DNA疫苗的佐剂活性说明图。图6A为BALB/c小鼠免疫6周后血清抗HIV多肽抗体IgG的0D450值。图6B显示BALB/c小鼠免疫6周后脾脏固相酶联免疫斑点实验(ELISPOT)检测图。从图6A中可以看出，PJW4303-YY1获得了比PJW4303组 (空白质粒对照)、和PBS组(空白对照)都显著高的抗HIV多肽抗体IgG，证明ASPPR增强了 HIV DNA疫苗诱导的体液免疫。图6B显示了 PJW4303-YY1具有诱导体内细胞分泌IFN- Y 和IL-4等细胞因子的能力，增强了 HIV DNA疫苗诱导的细胞免疫。[0065]实施例3.自身免疫原性的评价[0066]将前述2.4.1ASP-1和ASPPR作为OVA蛋白佐剂的小鼠血清，以ELISA方法检测血清中抗ASP-1和ASPPR抗体的水平。结果显示，ASPPR产生的抗体水平显著低于ASP-1约 30倍，说明ASPPR的自身免疫原性显著低于ASP-1。[0067]图7显示，本发明所述 的ASPPR在作为疫苗佐剂使用时显示出较低的免疫原性。
【权利要求】
1.一种重组蛋白质，其特征在于所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID N0s2所示。
2.一种编码权利要求1所述蛋白质的核苷酸序列。
3.根据权利要求2所述的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列如SEQID NOsl所/Jn ο
4.一种含有权利要求3所述核苷酸序列的表达载体。
5.根据权利要求4所述的表达载体，其特征在于，所述载体为pQE-ASPPR。
6.一种疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物含有疫苗活性物质和权利要求1所述的蛋白质。
7.根据权利要求6所述的疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗活性物质为蛋白质、多肽或 DNA。
8.根据权利要求7所述的疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗活性物质为HIV四分支肽。
【文档编号】A61K39/39GK103554241SQ201310512041
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2013年10月25日 优先权日:2013年10月25日
【发明者】寇志华, 周育森, 郭晶晶, 杨裔, 于虹, 郭彦, 孙维来, 赵光宇, 孙世惠, 李军锋 申请人:中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所