动物用冻干灭活疫苗及其制备工艺的制作方法
【专利摘要】本发明涉及动物用冻干灭活疫苗及其制备工艺，包括分开包装的免疫佐剂或稀释液及真空冷冻干燥生产的灭活疫苗，灭活疫苗由疫苗抗原经灭活后，再经过真空冷冻干燥工艺获得，免疫佐剂或稀释液具有良好的乳化性能。与现有技术相比，本发明可以根据单品种疫苗的免疫剂量先冻干成粉状或块状，使用的时候，用相应的免疫佐剂进行现配现用，在短时间内形成固定的剂型。养殖户根据自身需求，有选择地联合使用疫苗，一来很好的解决了联苗抗原含量难以满足的问题，二来解决了传统灭活疫苗免疫次数过多、免疫剂量过大的困惑。同时解决了灭活疫苗保存时间短的难题。
【专利说明】动物用冻干灭活疫苗及其制备工艺
【技术领域】
[0001]本发明涉及属于动物用疫苗制造领域，尤其是涉及一种动物用冻干灭活疫苗及其制备工艺。
【背景技术】 [0002]动物疫苗对预防动物疾病的发生起到至关重要的作用，现在动物疫苗的种类包括冻干减毒活疫苗，灭活疫苗(液体)。
[0003]目前，动物用灭活疫苗是将抗原灭活后和免疫佐剂按照一定的比例混合，进过乳化(高速剪切、研磨)，制成具有一定剂型的混悬液体(水包油、油包水、水包油包水、亲水型等)，最后分装在瓶子里。已经乳化好的为了保持疫苗的特定剂型，要求保存、运输时在2~8°C条件，如果乳化工艺不好，或保存温度有变化，疫苗剂型容易发生改变，疫苗质量受损，因此，此类疫苗保质期往往只有12个月。这样不仅增加了运输和保存的成本，而且企业在销售不畅时，疫苗容易产生过期报废，造成经济损失。另外，一旦形成了固定剂型很难与其他疫苗再进行联合使用，动物需要预防多种疾病时则需要多针免疫，不仅难以操作，而且给动物带来多次应激。
[0004]随着动物病原的不断出现，需要预防的疫病越来越多，疫苗的种类越来越多，复杂的免疫程序使得养殖户无所适从，很难安排免疫的时间，这样二联疫苗以及多联疫苗应运而生。但是每种疫苗抗原的含量在多联疫苗中具有一定限度不好把握，而且研发一个多联疫苗需要投入巨大的人力、物力、财力、精力。研发成功后又不一定复合市场需求。
[0005]以前用于生产动物灭活疫苗的佐剂剂型单一，主要以油包水为主，主要材料是矿物白油、司本80、吐温80、硬脂酸铝等。乳化工艺繁琐，需要借助高速的剪切设备，乳化后的灭活疫苗，称之为油乳剂灭活疫苗，这种灭活疫苗，容易分层，影响产品质量和免疫效果，同时免疫动物时会有较大的应激，比如呕吐、震颤、口吐白沫等副反应。
[0006]随着新型佐剂的出现，简化了乳化的程序，相应催生了新的疫苗类型和制备工艺。目前新型免疫佐剂类型包括了油包水、水包油、水包油包水、亲水型等，新型免疫佐剂不仅种类增加了，而且可以通过低速摇匀取代高速剪切的乳化程序，实现与冻干疫苗现配现用。
[0007]新型的冻干灭活疫苗，根据单品种疫苗的免疫剂量先冻干成粉状或块状，使用的时候，用相应的免疫佐剂进行现配现用，在短时间内形成固定的剂型。养殖户根据自身需求，有选择地联合使用疫苗，一来很好的解决了联苗抗原含量难以满足的问题，二来解决了传统灭活疫苗免疫次数过多、免疫剂量过大的困惑。
【发明内容】
[0008]本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种方便疫苗程序的安排，随意组合联苗，同时减少了运输和储藏成本的动物用冻干灭活疫苗及其制备工艺。
[0009]本发明的目的可以通过以下技术方案来实现:
[0010]动物用冻干灭活疫苗，包括分开包装的免疫佐剂或稀释液及真空冷冻干燥生产的灭活疫苗，
[0011]所述的灭活疫苗由疫苗抗原经灭活后，再经过真空冷冻干燥工艺获得，
[0012]所述的免疫佐剂或稀释液具有良好的乳化性能。[0013]所述的疫苗抗原包括细菌性、病毒性、介于细菌或病毒之间的病原微生物以及表达的用于动物疫苗的成分，动物包括除人类之外的所有动物种类。
[0014]所述的疫苗抗原为PCV_2、PRRS、流行性腹泻、流感病毒等病毒性抗原，猪副嗜血杆菌、链球菌、大肠杆菌等细菌性抗原，支原体、球虫、附红细胞体等其他抗原。
[0015]所述的疫苗抗原经化学灭活方法或物理灭活方法。
[0016]所述的物理灭活方法包括电灭活、脉冲灭活、光灭活、超声波灭活或者其组合。
[0017]所述的真空冷冻干燥将灭活后的疫苗原液和冻干保护剂按体积比1:1~5混合，按照该种疫苗的冻干曲线进行真空冷冻干燥。
[0018]所述的免疫佐剂的剂型包括水包油型、水包油包水型、油包水型或亲水型佐剂，所述的稀释液为免疫佐剂配置得到的稀释液。
[0019]所述的免疫佐剂中包括有免疫增加物质，该物质为可以刺激体液免疫和细胞免疫增强的物质，贮存或缓释抗原作用的物质、聚合或偶联抗原颗粒的物质。
[0020]所述的免疫增加物质为免疫增加物质为氢氧化铝胶、白油免疫佐剂AD04等有良好乳化特性的符合灭活冻干疫苗的物质。
[0021]动物用冻干灭活疫苗的制备工艺采用以下步骤:
[0022]将灭活疫苗由疫苗抗原经物理方法或化学方法进行灭活后，再将灭活后的疫苗原液和冻干保护剂按体积比1:1~5混合，按照该种疫苗的冻干曲线进行真空冷冻干燥再经过真空冷冻干燥工艺获得灭活疫苗；
[0023]将具有良好的乳化性能的免疫佐剂或稀释液与灭活疫苗分开包装，即得到动物用冻干灭活疫苗。
[0024]所述的灭活疫苗及免疫佐剂或稀释液在2-8°C条件或常温下进行保存。
[0025]与现有技术相比，本发明可以根据单品种疫苗的免疫剂量先冻干成粉状或块状，使用的时候，用相应的免疫佐剂进行现配现用，在短时间内形成固定的剂型。养殖户根据自身需求，有选择地联合使用疫苗，一来很好的解决了联苗抗原含量难以满足的问题，二来解决了传统灭活疫苗免疫次数过多、免疫剂量过大的困惑。
【具体实施方式】
[0026]下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。
[0027]实施例1
[0028]猪链球菌冻干灭活疫苗的制备
[0029]1.抗原制备将猪链球菌生产种子按5-15%比例接种到pH值7.2-7.6的缓冲改良马丁肉汤中。温度37 °C，低速搅拌，不通汽培养。培养开始，按0.2%的比例加入50%葡萄糖溶液，加入2-5%的牛血清进行补料。培养4-6小时后，补充含0.2%葡萄糖、2-5%牛血清的缓冲改良马丁肉汤适量，在培养结束前4小时停止补料，终含量葡萄糖不超过0.2%。培养12-18小时后，收获培养液，获得疫苗抗原菌液。
[0030]2.灭活向经抗原含量、无菌检验、安全性检验合格的抗原菌液中加入甲醛溶液使终浓度为0.1~0.5%，37°C条件下灭活48小时，收获菌液放在_20°C冷库中保存备用。
[0031]3.冻干将检验无菌的灭活抗原液按1:1~5比例的冻干保护剂制成匀浆，加入适量抗生素，充分混合，定量分装后迅速按合适的冻干工艺曲线进行冷冻真空干燥，制备成冻干灭活疫苗成品。
[0032]实施例2
[0033]猪圆环病毒2型冻干灭活疫苗的制备
[0034]1、抗原制备将猪圆环病毒2型(PCV-2)接种于生长良好的PK15细胞上，37°C条件下悬浮培养，培养24~72小时后，收获细胞培养液。
[0035]2、灭活向经过抗原含量、无菌检验合格的细胞培养液中加入适宜灭活剂使终浓度为0.1~0.5%，37°C条件下灭活48小时，收获抗原液放在_20°C冷库中保存备用。
[0036]3、冻干将检验无菌的灭活抗原液按1:1~5比例的冻干保护剂制成匀浆，加入适量抗生素，充分混合，定量分装后迅速按合适的冻干工艺曲线进行冷冻真空干燥，制备成冻干灭活疫苗成品。
[0037]实施例3
[0038]猪伪狂犬冻干灭活疫苗的制备[0039]1.抗原制备将猪伪狂犬病毒接种于生长良好的单层鸡胚成纤维细胞上，37°C旋转培养，每日观察细胞病变情况，当细胞病变大75%以上时收获细胞培养液。
[0040]2.灭活向经过抗原含量、无菌检验合格的细胞培养液中加入适宜灭活剂使终浓度为0.1~1%，25~37°C条件下灭活24~48小时，收获抗原液放在_20°C冷库中保存备用。
[0041]3.冻干将检验无菌的灭活抗原液按1:1~5比例的冻干保护剂制成匀浆，加入适量抗生素，充分混合，定量分装后迅速进行冷冻真空干燥，制备成冻干灭活疫苗成品。
[0042]实施例4
[0043]猪丹毒-猪多杀性巴氏杆菌二联冻干灭活疫苗制备
[0044]1.抗原制备
[0045]1.1猪丹毒杆菌抗原制备按培养基总量的1%~3%加入猪丹毒种子液，同时按1%~5%加入裂解血球全血，或0.1%吐温-80和0.3%~0.7%葡萄糖，37°C培养28~48小时，收获培养液，并进行活菌计数，计数结果作为配苗参考。
[0046]1.2猪多杀性巴氏杆菌抗原制备将猪多杀性巴氏杆菌种子接种于马丁肉汤培养基，接种浓度为总量的1%~5%，37°C培养12~20小时，收获培养液，并进行活菌计数，计数结果作为配苗参考。
[0047]2.配苗根据两种抗原的活菌计数结果，按猪丹毒杆菌和猪多杀性巴氏杆菌I~2:1的比例进行混合，摇匀。至2~8°C保存备用，时间不超过2两天。
[0048]3.灭活向经检验合格的猪丹毒杆菌、猪多杀性巴氏杆菌抗原液中，按0.1%~0.3%的浓度缓慢加入适宜灭活剂，25~37°C条件下灭活48小时，收获抗原液放在_20°C冷库中保存备用。
[0049]4.冻干将检验无菌的灭活抗原液按1:1~5比例的冻干保护剂制成匀浆，加入适量抗生素，充分混合，定量分装后迅速进行冷冻真空干燥，制备成冻干灭活疫苗成品。
[0050]实施例5[0051 ] 氢氧化铝胶生理盐水稀释剂配制
[0052]1、配制将氢氧化铝胶200g加入800毫升的生理盐水中，混匀后，分装在100毫升玻璃瓶或塑料瓶中。
[0053]2、灭菌分装将分装好的氢氧化铝胶生理盐水稀释剂放入高压灭菌柜内，100~126°C灭菌I~3小时，灭菌后贴标签，保存于2~8°C，保质期2年。配制好的氢氧化铝胶生理盐水稀释剂。
[0054]实施例6
[0055]纳米佐剂AD04稀释剂配制
[0056]1.配制将纳米型AD04佐剂高压灭菌后，按体积比8%~15%的比例加至灭菌生理盐水中，以不起泡沫的低速进行搅拌45~60分钟。然后，分装至20mL或IOOmL瓶中，贴标签，至2-8°C保存，保质期3年，成品。
[0057]实施例7
[0058]动物用冻干灭活疫苗，包括分开包装的免疫佐剂或稀释液及真空冷冻干燥生产的灭活疫苗，灭活疫苗由疫苗抗原经灭活后，再经过真空冷冻干燥工艺获得，免疫佐剂或稀释液具有良好的乳化性能。
[0059]疫苗抗原为PCV-2病毒性抗原，疫苗抗原经电灭活处理，然后将灭活后的疫苗原液和冻干保护剂按体积比1:1混合，按照该种疫苗的冻干曲线进行真空冷冻干燥。
[0060]免疫佐剂的剂型为水包油型佐剂，其中包括有氢氧化铝胶的，具有良好乳化特性且符合灭活冻干疫苗。
[0061]动物用冻干灭活疫苗的制备工艺采用以下步骤:
[0062]将灭活疫苗由疫苗抗原经物理方法进行灭活后，再将灭活后的疫苗原液和冻干保护剂按体积比1:1混合，按照该种疫苗的冻干曲线进行真空冷冻干燥再经过真空冷冻干燥工艺获得灭活疫苗；
[0063]将具有良好的乳化性能的免疫佐剂或稀释液与灭活疫苗分开包装，即得到动物用冻干灭活疫苗，灭活疫苗及免疫佐剂或稀释液在2-8 V条件或常温下进行保存。
[0064]实施例8
[0065]动物用冻干灭活疫苗，包括分开包装的免疫佐剂或稀释液及真空冷冻干燥生产的灭活疫苗，灭活疫苗由疫苗抗原经灭活后，再经过真空冷冻干燥工艺获得，免疫佐剂或稀释液具有良好的乳化性能。
[0066]疫苗抗原为猪副嗜血杆菌的细菌性抗原，经脉冲灭活处理，然后将灭活后的疫苗原液和冻干保护剂按体积比1:3混合，按照该种疫苗的冻干曲线进行真空冷冻干燥。免疫佐剂的剂型为水包油包水型。在免疫佐剂中包括有免疫增加物质，，本实施例中是白油免疫佐剂AD04，具有良好乳化特性的符合灭活冻干疫苗的物质。
[0067]动物用冻干灭活疫苗的制备工艺采用以下步骤:
[0068]将灭活疫苗由 疫苗抗原经物理方法进行灭活后，再将灭活后的疫苗原液和冻干保护剂按体积比1:3混合，按照该种疫苗的冻干曲线进行真空冷冻干燥再经过真空冷冻干燥工艺获得灭活疫苗；
[0069]将具有良好的乳化性能的免疫佐剂或稀释液与灭活疫苗分开包装，即得到动物用冻干灭活疫苗。灭活疫苗及免疫佐剂或稀释液在2-8 °C条件或常温下进行保存。[0070]实施例9
[0071]动物用冻干灭活疫苗,包括分开包装的免疫佐剂或稀释液及真空冷冻干燥生产的灭活疫苗，灭活疫苗由疫苗抗原经灭活后，再经过真空冷冻干燥工艺获得，免疫佐剂或稀释液具有良好的乳化性能。
[0072]疫苗抗原为支原体抗原，经化学灭活处理，然后将灭活后的疫苗原液和冻干保护剂按体积比1:5混合，按照该种疫苗的冻干曲线进行真空冷冻干燥。免疫佐剂的剂型为油包水型，在免疫佐剂中包括有免疫增加物质，该物质为可以刺激体液免疫和细胞免疫增强的物质，贮存或缓释抗原作用的物质、聚合或偶联抗原颗粒的物质。
[0073]动物用冻干灭活疫苗的制备工艺采用以下步骤:
[0074]将灭活疫苗由疫苗抗原经化学方法进行灭活后，再将灭活后的疫苗原液和冻干保护剂按体积比1:5混合，按照该种疫苗的冻干曲线进行真空冷冻干燥再经过真空冷冻干燥工艺获得灭活疫苗；
[0075]将具有良好的乳化性能的免疫佐剂或稀释液与灭活疫苗分开包装，即得到动物用冻干灭活疫苗。灭活疫 苗及免疫佐剂或稀释液在2-8 °C条件或常温下进行保存。
【权利要求】
1.动物用冻干灭活疫苗，其特征在于，包括分开包装的免疫佐剂或稀释液及真空冷冻干燥生产的灭活疫苗， 所述的灭活疫苗由疫苗抗原经灭活后，再经过真空冷冻干燥工艺获得， 所述的免疫佐剂或稀释液具有良好的乳化性能。
2.根据权利要求1所述的动物用冻干灭活疫苗，其特征在于，所述的疫苗抗原包括细菌性、病毒性、介于细菌或病毒之间的病原微生物以及表达的用于动物疫苗的成分，动物包括除人类之外的所有动物种类。
3.根据权利要求2所述的动物用冻干灭活疫苗，其特征在于，所述的疫苗抗原为PCV-2、PRRS、流行性腹泻或流感病毒的病毒性抗原，或者为猪副嗜血杆菌、链球菌或大肠杆菌的细菌性抗原，或者为支原体、球虫或附红细胞体抗原。
4.根据权利要求1所述的动物用冻干灭活疫苗，其特征在于，所述的疫苗抗原经化学灭活方法或物理灭活方法。
5.根据权利要求4所述的动物用冻干灭活疫苗，其特征在于，所述的物理灭活方法包括电灭活、脉冲灭活、光灭活、超声波灭活或者其组合。
6.根据权利要求1所述的动物用冻干灭活疫苗，其特征在于，所述的真空冷冻干燥将灭活后的疫苗原液和冻干保护剂按体积比1:1~5混合，按照该种疫苗的冻干曲线进行真空冷冻干燥。
7.根据权利要求1所述的动物用冻干灭活疫苗，其特征在于，所述的免疫佐剂的剂型包括水包油型、水包油包水型、油包水型或亲水型佐剂，所述的稀释液为免疫佐剂配置得到的稀释液。
8.根据权利要求1或7所述的动物用冻干灭活疫苗，其特征在于，所述的免疫佐剂中包括有免疫增加物质，该物质为可以刺激体液免疫和细胞免疫增强的物质，贮存或缓释抗原作用的物质、聚合或偶联抗原颗粒的物质。
9.根据权利要求8所述的动物用冻干灭活疫苗，其特征在于，所述的免疫增加物质为具有良好乳化特性的符合灭活冻干疫苗的物质，包括氢氧化铝胶或白油免疫佐剂。
10.据权利要求1-9中任一项所述的动物用冻干灭活疫苗的制备工艺，其特征在于，该工艺采用以下步骤: 将灭活疫苗由疫苗抗原经物理方法或化学方法进行灭活后，再将灭活后的疫苗原液和冻干保护剂按体积比1:1~5混合，按照该种疫苗的冻干曲线进行真空冷冻干燥再经过真空冷冻干燥工艺获得灭活疫苗； 将具有良好的乳化性能的免疫佐剂或稀释液与灭活疫苗分开包装，即得到动物用冻干灭活疫苗，灭活疫苗及免疫佐剂或稀释液在2-8 0C条件或常温下进行保存。
【文档编号】A61P33/02GK103735521SQ201310548699
【公开日】2014年4月23日 申请日期:2013年11月7日 优先权日:2013年11月7日
【发明者】赖 志, 高俊锋, 章伟建, 马晶晶, 吴碧清 申请人:上海创宏生物科技有限公司