注射用16-妊娠双烯醇酮脂质体给药系统及其制备方法
【专利摘要】本发明提供一种治疗宫颈癌的注射用16-妊娠双烯醇酮脂质体给药系统的制备方法。所述脂质体给药系统包含治疗有效量的16-妊娠双烯醇酮、磷脂膜材、膜稳定材料和药学上可接受的辅料，且所述的16-妊娠双烯醇酮、磷脂膜材及膜稳定材料的重量比为1:5:0.2-1:50:50。该制备工艺包括制备多室脂质体、均化脂质体、定容、除菌、分装、冻干等步骤。本方法制备的脂质体平均粒径小且分布窄、包封率高、载药量高、重现性好、稳定性好，可满足静脉注射要求。体内抗肿瘤实验结果表明，本发明制备的16-DHP脂质体能显著抑制荷瘤裸鼠移植瘤的生长，具有较好的抗肿瘤效果。小鼠体内药动学实验结果表明，本发明制备的16-DHP脂质体能够延长药物在体内的滞留时间，提高进入小鼠体循环的药量。
【专利说明】注射用16-妊娠双烯醇酮脂质体给药系统及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于医药【技术领域】，涉及注射用16-妊娠双烯醇酮脂质体给药系统及其制备方法，该系统主要用于宫颈癌疾病的治疗。
【背景技术】
[0002]宫颈癌是女性第二常见的恶性肿瘤(仅次于乳腺癌)，是女性生殖道最常见的恶性肿瘤。患者年龄分布呈双峰状，35-39岁和60-64岁为高发年龄，平均年龄为52.2岁。全世界每年大约有50万个新发子宫颈癌病例，中国约占30万个，居世界之首。
[0003]宫颈癌又称宫颈浸润癌，由癌前病变发展至宫颈癌一般需5-10年时间，使得宫颈癌易于早期诊断与早期治疗。近40年来，国内外通过宫颈细胞学检查、阴道镜检查、宫颈活检，多数患者在CIN时获得诊断和治疗，宫颈癌发病率明显下降，早期宫颈癌的比例较以前明显增加，宫颈癌的死亡率也随之不断下降。但近年来我国宫颈癌发病率有增加的趋势，发病有年轻化的趋势。
[0004]宫颈癌的治疗应根据临床分期、患者年龄、全身情况、设备条件和医疗技术水平决定治疗措施，手术和放疗是治疗宫颈癌的两大主要治疗手段，早期以手术治疗为主，中晚期大多采用放射治疗，近年来的研究表明化疗有重要的辅助作用。大量研究显示，手术及放射治疗这两种局部治疗手段不能控制肿瘤周围肉眼看不见的微小转移灶以及可能存在的全身亚临床转移，这是晚期宫颈癌治疗后复发的主要原因。为了提高晚期宫颈癌的治疗效果，近十多年来化疗逐渐引起各国学者的重视，化疗成为局部晚期宫颈癌和晚期宫颈癌综合治疗的一个重要组成部分。
[0005]现在，市售的主要抗癌化学药物有:一类:顺钼、卡钼、紫杉醇；二类:5_氟尿嘧啶、异环磷酰胺、托泊替康、吉西他滨等。紫杉醇、5-氟尿嘧啶、托泊替康和氟尿嘧啶都为周期性特异性药物，紫杉醇能特异性将细胞阻滞于G2期和M期；抗代谢药5-氟尿嘧啶和吉西他滨对S期细胞作用显著，主要为干扰细胞DNA合成；托泊替康为拓扑异构酶I抑制剂，在S期干扰DNA合成。顺钼、卡钼和异环磷酰胺为周期非特异性抗肿瘤药，前两者为类烷化剂药物，后者为烷化剂药物，对增殖细胞各期，以及Gtl期细胞都有杀伤作用，导致DNA损伤。
[0006]16-妊娠双稀醇丽(16-dehydropregnenolone, 16-DHP),化学名:3β -羟基-孕甾-5，16- 二烯-20-酮，分子式为C21H2tlO2,分子量为314.46，结构式如下:
[0007]`[0008]在国外，对于16-DHP研究最多的机构属印度的Central Drug ResearchInstitute。该机构下，S.K.Singh等人釆用HPLC-UV法进行了 16-DHP在大鼠体内的药代动力学研究，测定了大鼠血衆、尿液、胆汁和粪便中的16-DHP含量。Satyendra Suryawanshi等人建立了 HPLC/ES1-MS/MS法同时测定家兔血浆中16-DHP及其5种主要代谢物的含量。后来，他又进行了 16-DHP在大鼠体内的临床前药动学、剂量关系、性别差异和蛋白结合率的研究。Devendra Kumar等人研究发现16-DHP是一种新的法尼酯X受体拮抗剂，具有显著地降血脂活性。另有专利报道，16-DHP在正常人和高血脂患者体内有显著的降血脂作用，且没有激素样作用。现在，16-DHP正被开发为一种联合洛伐他汀的抗高血脂症的口服制剂，此种制剂能够提高高密度脂蛋白水平，抑制血小板聚集，减少胆固醇在肝脏中的生物合成。在长期毒性研究中发现，16-DHP的毒副作用很小，且有良好的治疗窗。从毒性和药效学角度可以看出，16-DHP有望开发为具有自主知识产权的抗肿瘤新药。
[0009]在国内，孙立新等在对白英进行抗肿瘤活性追踪提取分离活性成分中，首次分离得到16-DHP，并进行了体内抗肿瘤实验，结果表明16-DHP可以显著抑制荷瘤小鼠S180和H22实体瘤的生长。并首次发现其体外对多种肿瘤细胞的增殖具有抑制作用，并对其诱导人宫颈癌Hela细胞死亡的机制作了初步研究:实验结果表明:16-DHP可通过诱导人宫颈癌HeLa细胞周期阻滞于Gl期，进而诱导线粒体途径的细胞凋亡而抑制HeLa细胞的增殖。16-DHP诱导的Gl周期阻滞的机制涉及激活ATM-Chk2-p53-p21信号通路，p53诱导Bax蛋白的上调介导16-DHP的凋亡诱导作用。
[0010]16-妊娠双烯醇酮难溶于水，且脂溶性也不大，在进行临床前研究时，文献中多采用高比例有机溶剂溶解16-DHP后再进行相关研究，而高比例的有机溶剂会对机体的正常代谢产生一定影响。因此，16-DHP的难溶性，给药物的临床前研究带来挑战，同时也很大地影响了其临床应用。目前尚无16-妊娠双烯醇酮脂质体制剂的文献公开。脂质体(Liposomes)是由磷脂双层构成的具有水相内核的脂质微囊。在20世纪60年代初,英国学者Bangham和Standish将磷脂分散在水中进行电镜观察时发现了脂质体的结构。脂质体可以由天然磷脂 或合成磷脂组成，外形常见有球形、椭圆形等，直径从几十纳米到几微米之间。脂质体作为一种药物载体，可用于传递化学药物、核酸以及疫苗。从1988年第一个脂质体药物在美国进入临床试验，现在已有十几个脂质体品种工业化生产并上市销售，如两性霉素B脂质体、阿霉素脂质体、柔红霉素脂质体和乙肝疫苗脂质体等。国内上市的脂质体主要有注射用紫杉醇脂质体、两性霉素B脂质体和盐酸多柔比星脂质体。
[0011]脂质体性质不稳定，容易受多种因素的影响，如pH值变化、环境中物质与包封的药物的性质等。液态脂质体在贮存的过程中，很容易凝聚、融合从而导致包封药物泄漏。在放置的过程中，液体状态脂质体最多也只能贮存几周的时间。磷脂是构成脂质体的主要膜材，但易氧化生成溶血磷脂对机体造成危害，同时还会对药物包封率产生影响。为了使脂质体和包封的药物能够在常温下长期稳定地贮存，近年来冷冻干燥技术被广泛用于制备冻干的脂质体。冷冻干燥的主要过程有:预冻、一次干燥和二次干燥。预冻过程影响冰晶的成核和冻结状态的外形；一次干燥除去大部分水分；二次干燥除去结合水以保证冻干后脂质体有较低含水量。然而，对于脂质体而言，冷冻干燥本身就是一个严重的破坏过程。在无冻干保护剂存在下，冻干后的脂质体会有不可避免的粒径增大、粒子融合、破裂和包封药物严重泄漏等现象发生。因此在冻干过程中，需要加入冻干保护剂，减小冰晶对膜的损坏并降低干燥后膜的相转变温度，以保证脂质体冻干前后各项理化性质变化不大。药品按上述方法进行冷冻干燥后，可在冷处避光长期贮存，需要使用时，加蒸馏水或生理盐水制成悬浮液，即可恢复到冻干前的状态。
【发明内容】
[0012]本发明的一个目的在于提供一种新型的注射用16-妊娠双烯醇酮脂质体给药系统；另一个目的是提供一种新的用于注射用16-妊娠双烯醇酮脂质体给药系统的制备方法。本发明制剂使用时用注射用水复溶，可用5%葡萄糖注射液进一步分散，用于静脉注射。
[0013]根据本发明，所述注射用16-妊娠双烯醇酮脂质体给药系统包含治疗有效量的16-妊娠双烯醇酮、磷脂膜材、膜稳定材料，且所述的16-妊娠双烯醇酮、磷脂膜材及膜稳定材料的重量比为1:5:0.2-1:50:50。
[0014]根据本发明，所述的磷脂膜材可为纯度80%以上的蛋黄卵磷脂、大豆卵磷脂、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、氢化卵磷脂或其混合物。
[0015]根据本发明，所述的膜稳定材料为胆固醇、胆固醇硫酸钠、胆固醇磷酸钠、胆固醇磺酸钠、十二烷基磺酸钠或其混合物。
[0016]根据本发明，还可进一步包括药学上可接受的辅料，包括pH值调节剂和冻干保护剂等。
[0017]根据本发明，所述的pH值调节剂可为4.0-9.0的Tris-HCl缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、醋酸-醋酸钠缓冲液或磷酸盐缓冲液。
[0018]根据本发明，所述的冻干保护剂包括糖和多元醇，且所述冻干保护剂的量占所述给药系统总量的1%_15%(质量比)。糖类主要包括甘露糖、葡萄糖、乳糖、麦芽糖和海藻糖等；多元醇类中，比较常用的是甘 露醇和山梨醇。
[0019]根据本发明，所述脂质体给药系统可以是冻干粉形式的制剂。其中，粒径为50-300nm ;16_妊娠双烯醇酮的制剂最终浓度为1-lOmg/mL。
[0020]根据本发明，注射用16-妊娠双烯醇酮脂质体给药系统的制备方法由以下步骤实现:
[0021](I)制备多室脂质体:按照权利要求1的组分量，将16-妊娠双烯醇酮、磷脂膜材和膜稳定材料溶解于有机溶剂中，用减压蒸馏法将溶剂除去，形成脂质混合物；配制0.001-0.1M的缓冲液，用该溶液水化脂质混合物，水化温度在40-70°C之间，必要时用搅拌使脂质水化完全。
[0022](2)均化脂质体:用磷酸盐等pH值调节剂制成的缓冲液水化完全后用高压均质机均质或用细胞超声粉碎机超声脂质体至所需的粒径和均匀度，也可通过挤压设备把多层脂质体在一定压力下通过相应孔径的微孔膜来达到，脂质体的平均粒径控制在50-300nm。
[0023](3)定容、除菌、分装:用注射用水定容，将16-妊娠双烯醇酮脂质体溶液用0.22 μ m微孔滤膜过滤除菌，分装。
[0024](4)冷冻干燥:将上述制品置冷冻干燥机中，冷冻干燥，压盖，得冻干粉针，可在2-10°C 保存。
[0025]本发明的有益效果表现在:
[0026]本发明16-妊娠双烯醇酮脂质体仅以类脂质为膜材，均具有生物相容性，毒副作用小，不加入其他的表面活性剂来提高脂质体对药物的包封能力及载药量。
[0027]本发明生产过程中除溶剂步骤由减压蒸馏来完成，减小粒径步骤由高压均质机或挤压设备来完成，制得的脂质体适合工业化大生产，且符合临床要求。
[0028]本发明16-妊娠双烯醇酮脂质体冻干粉针具有良好的水溶性，加入注射用水重新溶散后，平均粒径在50-300nm之间，冻干前后粒径未见明显变化，药物包封率>90%。
[0029]本发明16-妊娠双烯醇酮脂质体冻干粉针在2-10°C下的6个月稳定性实验结果表明，脂质体的各项检测指标均符合质量标准，显示出了 16-妊娠双烯醇酮脂质体制剂具有较好的稳定性。
[0030]本发明的特点是，克服了 16-妊娠双烯醇酮难溶于水，不易制成普通的注射剂，给临床应用带来局限的缺点，能够制备平均粒径小、粒径分布窄，包封率高，载药量高的注射用给药系统；另外16-妊娠双烯醇酮结构中有双键，其性质不稳定，容易被氧化，本发明制成的脂质体冻干粉针具良好稳定性，又可满足静脉注射要求。
[0031]裸鼠接种Hela细胞后，静脉注射给药，进行体内抗肿瘤实验，结果表明，本发明制备的16-DHP脂质体能显著抑制荷瘤裸鼠移植瘤的生长，具有较好的抗肿瘤效果。
[0032]小鼠静脉注射16-DHP脂质体后，分别于不同时间取样测定血药浓度，结果表明，本发明制备的16-DHP脂质体能够延长药物在体内的滞留时间，提高进入小鼠体循环的药量。
[0033]【专利附图】
【附图说明】(以【具体实施方式】中实施例1为例)
[0034]图1为16-妊娠双烯醇酮脂质体(实施例1)的透射电镜(TEM)照片
[0035]图2为16-妊娠双烯醇酮脂质体冻干前(实施例1)粒径分布和累计百分率图
[0036]累计结果
[0037]平均粒径:84.1nm ； P.1.=0.242
[0038]80% 分布 112.6nm
[0039]90% 分布 139.6nm
[0040]99% 分布 233.0nm
[0041]图3为16-妊娠双烯醇酮脂质体冻干粉针(实施例1)复溶后的粒径分布和累计百分率图
[0042]累计结果
[0043]平均粒径:99.7nm ； P.1.=0.235
[0044]80% 分布 146.6nm
[0045]90% 分布 181.4nm
[0046]99% 分布 301.2nm
【具体实施方式】
[0047]以下通过实施例对本发明的【具体实施方式】作详细说明。
[0048]本发明在实施中，可由以下实施例给出，但本发明的保护范围不局限于此。
[0049]实施例1
【权利要求】
1.一种治疗宫颈癌的注射用16-妊娠双烯醇酮脂质体给药系统，其特征在于，所述注射用16-妊娠双烯醇酮脂质体给药系统包含治疗有效量的16-妊娠双烯醇酮、磷脂膜材、膜稳定材料和药学上可接受的辅料，且所述的16-妊娠双烯醇酮、磷脂膜材及膜稳定材料的重量比为1:5:0.2~1:50:50。
2.根据权利要求1所述的注射用16-妊娠双烯醇酮脂质体给药系统，其特征在于所说的磷脂膜材为纯度80%以上的蛋黄卵磷脂、大豆卵磷脂、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、氢化卵磷脂或其混合物。
3.根据权利要求1所述的注射用16-妊娠双烯醇酮脂质体给药系统，其特征在于所说的膜稳定材料为胆固醇、胆固醇硫酸钠、胆固醇磷酸钠、胆固醇磺酸钠、十二烷基磺酸钠或其混合物。
4.根据权利要求1所述的注射用16-妊娠双烯醇酮脂质体给药系统，其特征在于所说的药学上可接受的辅料包含pH值调节剂和冻干保护剂。
5.根据权利要求4所述的注射用16-妊娠双烯醇酮脂质体给药系统，其特征在于所说的PH值调节剂为4.0-9.0的Tris-HCl缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、醋酸_醋酸钠缓冲液或磷酸盐缓冲液。
6.根据权利要求4所述的注射用16-妊娠双烯醇酮脂质体给药系统，其特征在于所说的冻干保护剂包括糖和多元醇，且所述冻干保护剂的量占所述给药系统总量的1%_15%。
7.根据权利要求6所述的注射用16-妊娠双烯醇酮脂质体给药系统，其特征在于所说的冻干保护剂为甘露糖、葡萄糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、甘露醇、山梨醇或其混合物。
8.根据权利要求1所述的注射用16-妊娠双烯醇酮脂质体给药系统，其特征在于所说的脂质体给药系统是粒径为50`-300 nm并且16-妊娠双烯醇酮的制剂最终浓度为1_10 mg/mL的冻干粉形式的制剂。
9.一种权利要求1-8所述的注射用16-妊娠双烯醇酮脂质体给药系统的制备方法，其特征在于，由以下步骤实现: (O制备多室脂质体:按照权利要求1的组分量，将16-妊娠双烯醇酮、磷脂膜材和膜稳定材料溶解于有机溶剂中，用减压蒸馏法将溶剂除去，形成脂质混合物；配制0.001-0.1M的缓冲液，用该溶液水化脂质混合物，水化温度在40-70 °C之间，必要时用搅拌使脂质水化完全； (2)均化脂质体:水化完全后用高压均质机均质或用细胞超声粉碎机超声脂质体至所需的粒径和均匀度，也可通过挤压设备把多层脂质体在一定压力下通过相应孔径的微孔膜来达到，脂质体的平均粒径控制在50-300 nm ； (3)定容、除菌、分装、保存:用注射用水定容，将16-妊娠双烯醇酮脂质体溶液用0.22μ m微孔滤膜过滤除菌，分装，冷冻干燥，即得成品，成品可在2-10 °C保存。
10.根据权利要求9所述的注射用16-妊娠双烯醇酮脂质体给药系统，其特征在于所说的有机溶剂为二氯甲烷、氯仿、无水乙醇或乙酸乙酯。
【文档编号】A61K47/24GK103622923SQ201310648671
【公开日】2014年3月12日 申请日期:2013年12月3日 优先权日:2013年12月3日
【发明者】孙立新, 毕开顺, 魏岚, 张石, 邓振雪 申请人:沈阳药科大学