用于制备树突细胞疫苗的方法

用于制备树突细胞疫苗的方法
【专利摘要】本发明涉及一种用于获得载有抗原之树突细胞的方法，所述载有抗原之树突细胞表现出更高的生存力以及向淋巴结迁移的能力。本发明还涉及包含所述树突细胞的疫苗及其用于治疗感染性疾病(特别是AIDS)的用途。
【专利说明】用于制备树突细胞疫苗的方法

【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种用于获得载有抗原之树突细胞的方法，所述载有抗原之树突细胞 表现出更高的生存力以及向淋巴结迁移的能力。本发明还涉及包含所述树突细胞的疫苗及 其用于治疗感染性疾病（特别是人类免疫缺陷病毒，HIV)的用途。

【背景技术】
[0002] 虽然组合抗逆转录病毒治疗（cART)在抑制HIV-I复制以及允许重建⑶4T细胞数 方面有效，但是其不能根除HIV-I。此外，cART不能恢复HIV-I特异性T细胞免疫应答。事 实上，HIV-I的复制迅速回弹至与治疗前水平相近，甚至更高。结果，HIV对象不得不终身接 受cART，考虑到顺应性、发展出抗病毒物质抗性的风险、价格以及副作用，这是一个特别难 以负担的选择，所述副作用包括严重代谢异常，例如脂肪再分布综合征。参见Martinez E 等，Lancet 2001;357 :592-598。
[0003] 有证据表明，针对HIV-I的强的并且特异性的⑶4+辅助T细胞应答是取得持续、 有效并且特异性的CD8+细胞毒性T淋巴细胞（CTL)应答的关键，而后者能够控制HIV-I在 猕猴和人中的复制。这些发现与最近在小鼠模型中的慢性病毒性感染的数据一致。虽然在 大多数HIV-I感染的个体中可发现分泌干扰素Y (IFN- Y )的HIV-I特异性⑶8+T细胞和 CD4+T细胞，但是不存在CD4+T细胞的增殖性应答，同时CD8T细胞的溶细胞活性存在缺陷。 一些数据表明，在HIV-I感染的对象中，树突细胞（DC)的抗原呈递细胞（APC)功能也受损， 这可能导致HIV-I特异性辅助应答和CTL应答功能紊乱。
[0004] 已经提出了将治疗性免疫接种作为一种方法来限制对持续的终身性CART的需 求。髓样树突细胞（myeloid dendritic cell)是最有效的专职性APC，其具有诱导对⑶4+T 细胞和CD8+T细胞二者的初级免疫应答和次级免疫应答的独特能力。体内和体外实验数据 都表明，DC能够吞噬外源可溶蛋白、肿瘤细胞裂解物、失活的病毒以及凋亡的受病毒感染细 胞，对这些材料进行加工并呈递衍生的抗原肽。除了通过II类MHC通路将抗原呈递至辅 助⑶4+T细胞（Th)外，DC还可通过I类MHC通路将抗原呈递至细胞毒性⑶8+T淋巴细胞 (CTL)，这种现象称为"交叉引发（cross-priming) "或"交叉呈递（cross-presentation) "。 参见 Banchereau，Nature 392 (1998) :245-252 和 Annu. Rev. Immunol. (2000) 18 ；767-811, 以及 Larsson M 等，Curr. Top. Microbiol. Immunol. 2003 ;276 :261_275。
[0005] 在人类传染病和肿瘤的实验小鼠模型中，用多种失活病原体和肿瘤抗原离体脉冲 的自体髓样DC (例如单核细胞衍生的DC，MDDC)表现为诱导强效保护性免疫。一些动物研究 表明，载有HIV-I病毒裂解物、包膜糖蛋白、失活病毒或纳米颗粒的DC引起强的针对HIV-I 的免疫应答。
[0006] 迄今，已经刊载了一些基于DC的疫苗接种对于人类HIV-I感染的临床试验。参 见 Kundu S 等，AIDS Res. Hum. Retroviruses 1998 ; 14 :551_560，Lu w 等，Nat. Med. 2004 ; 10 :1359-1365, Garcia F 等，J. Infect. Dis. 2005 ;195 :1680-1685, Ide F 等，了.]\^(1. Virol. 2006 ;78 :711-718, Connolly N 等，Clin.Vaccine Immunol. 2008 ;15 :284-292, Gandhi R 等，Vaccine 2009;27:6088-6094, Kloverpris H 等，AIDS 2009;23:1329-1340， Routy J 等，Clin. Immunol. 2010 ;134 :140-147,以及 Garcia F 等，J. Infect. Dis. 2011 ; 203:473-478。还有一些使用DC作为治疗性疫苗的临床试验正在进行。遗憾的是，可能由 于所选择的免疫原、失活方法、DC的培养和脉冲条件以及疫苗的施用方案广泛变化，所报道 的结果并不一致。本领域仍然需要在能增强其安全性和效力特性的标准化方法下制备的基 于树突细胞的HIV-I疫苗。


【发明内容】

[0007] 在第一个方面，本发明涉及用于获得载有抗原的树突细胞的体外方法，其包括使 未成熟树突细胞在足以使所述未成熟树突细胞成熟的条件下和防止细胞附着于基底的条 件下与包含所述抗原的免疫原接触。
[0008] 在另一个方面，本发明涉及可通过根据本发明的方法获得的抗原脉冲的树突细 胞。
[0009] 在另一个方面，本发明涉及包含根据本发明的抗原脉冲之树突细胞的树突细胞疫 苗。
[0010] 在另一个方面，本发明涉及根据本发明的树突细胞疫苗用于医疗。
[0011] 在另一个方面，本发明涉及根据本发明的树突细胞疫苗用于治疗或预防Hiv感染 或与HIV感染有关的疾病，其中所述免疫原是HIV免疫原。

【专利附图】

【附图说明】
[0012] 图1.从经治疗的HIV对象中分离的MDDC中的⑶80和⑶83表达水平。
[0013] 图2?从经治疗的HIV对象中分离的MDDC的生存力和数量。
[0014] 图3.从经治疗的HIV对象中分离的MDDC的趋化性特性。
[0015] 图4.从经治疗的HIV对象中分离的MDDC的T细胞特异性HIV应答。
[0016] 图5.在免疫接种和抗逆转录病毒治疗第二次中断后PVL由基线（进行任何抗逆 转录病毒治疗之前）的改变。（A)中值。（B)单个值。底部的数字表示有风险的患者。在 第0、8、12、24、36和48周时示出Mann-Whitney U检验的P值。曲线下面积（AUC)的P值 也示出。（C)在接种疫苗8、12、24、36和48周后经治疗的111￥对象中的111￥病毒载量。针 对分支仏冊)1、分支11和分支111，示出了一些周（-4、-2、0、8、12、24、36和48)的值。
[0017] 图6.临床试验设计方案。对三十六位进行了抗逆转录病毒治疗的慢性HIV-I感 染患者随机接受三次免疫接种，其中至少107个为用热失活的自体病毒脉冲的MD-DC(每次 剂量109拷贝）。在第一次免疫接种后对患者随访48周。将第二次中断cART的那天（第 二次停止）视为第0周。DC-HIV-I组在-4、-2和0周时有12位患者接受免疫接种，且在 0、2和4周时有12位患者接受免疫接种。选择这两个不同的时间表以评估cART能否对免 疫接种的应答产生任何影响。由于这两个时间表之间在PVL改变或HIV特异性T细胞应答 方面没有观察到显著差异，所以将接受免疫接种的患者作为单个组来分析。DC对照组患者 在-4、-2和0周时接受注射。

【具体实施方式】
[0018] 本发明公开了用于用基本失活的人类免疫缺陷病毒（HIV)的裂解物脉冲单核细 胞衍生之树突细胞（MDDC)的新的和有利的方法。具体地，将本发明的经脉冲MDDC培养在 含有由IL-I-0、IL-6、TNF-a和PGE2构成之成熟化混合物（maturation cocktail)的超 低附着烧瓶中。细胞黏着性的缺乏与培养基的组合显著提高了 MDDC中成熟标志物（即， ⑶80、⑶83)的表达，以及经脉冲MDDC的总量和生存力。本发明的方法还提高了 MDDC的离 体迁移能力，并改进了其向T细胞的HIV-I抗原呈递，因此有利于针对HIV-I的更高的特异 性免疫应答。由此脉冲的MDDC可用作树突细胞疫苗用于人类健康。
[0019] 1.一般术语和表述的定义
[0020] 本文所用术语"AIDS"是指HIV感染的症状阶段，包括获得性免疫缺陷综合征（通 常称为 AIDS)和 "ARC" 或 AIDS 相关复合征。参见 Adler M 等，Brit. MedJ. 1987 ;294: 1145-1147。AIDS的免疫学表现和临床表现在本领域是公知的，包括例如因免疫缺陷导致的 机会性感染和癌症。
[0021] 术语"佐剂"是指在添加至免疫原性药剂中时，非特异地增强或加强暴露于该混合 物后的接受者宿主对所述药剂的免疫应答的物质。
[0022] 本文所用术语"IL-1受体的激动剂"是指充当白细胞介素-1受体（IL-IR)的激动 剂的细胞因子。IL-I受体的激动剂包括但不限于IL-I a和IL-I 3。
[0023] 本文所用术语"aldrithiol-2"或"2,2 '-二硫二吡啶"是指一种也称为 "aldrithiol"或AT-2的化学试剂，其为温和的氧化剂，能通过优先对内部病毒体蛋白（特 别是核衣壳蛋白）的半胱氨酸的游离巯基进行共价修饰来消除HIV的感染性。经AT-2失 活的病毒体没有感染性，但是能够与细胞表面受体以及树突细胞相互作用。
[0024] 本文所用术语"氨托沙林（amotosalen) "是指可逆地插入DNA和RNA螺旋区域的 合成的补骨脂素化合物。因为氨托沙林是光活化（photoactive)化合物，需要使用长波长 紫外（UVA)照明对HIV进行光化学处理。通过用320nm至400nm的UVA光照明，氨托沙林 与核酸中的嘧啶碱基形成共价键。通过这种方式交联的病原体和白细胞的基因组不再具有 功能，也不能进行复制。
[0025] 本文所用术语"抗原"是指当引入身体时，通过免疫系统诱导特异性免疫应答 (即，体液的或细胞的）的任何分子或分子片段。抗原具有结合于抗体的抗原结合位点的 能力。抗原通常是蛋白质或多糖。适于本发明的抗原是细菌、病毒、寄生物和其他微生物的 一部分，例如外壳、荚膜、细胞壁、鞭毛、纤毛和毒素。根据本发明的抗原的实例包括来自以 下的抗原：小核糖核酸病毒、冠状病毒、囊膜病毒、黄病毒（flavirvirus)、棒状病毒、副粘 病毒、正粘病毒、布尼亚病毒、沙粒病毒、呼肠孤病毒、逆转录病毒、乳头瘤病毒、细小病毒、 疱疹病毒、痘病毒、嗜肝DNA病毒（hepadnavirus)以及海绵状病毒家族；或者来自其他病 原体，例如锥虫、绦虫、蛔虫、蠕虫或疟疾。适合的病毒抗原的实例非限制地有：来自人类免 疫缺陷病毒（HIV)的逆转录病毒抗原，包括gag基因、pol基因、env基因和nef基因的基 因产物，以及其他HIV组分；肝炎病毒抗原，例如乙肝病毒的S蛋白、M蛋白和L蛋白，乙肝 病毒的前S抗原，和其他肝炎的（例如，甲肝、乙肝和丙肝，病毒组分例如丙肝病毒RNA);流 感病毒抗原，例如血凝素和神经氨酸酶，以及其他流感病毒组分；麻疹病毒抗原，例如麻疹 病毒融合蛋白和其他麻疹病毒组分；风疹病毒抗原，例如El蛋白和E2蛋白，以及其他风疹 病毒组分；轮状病毒抗原，例如VP7sc和其他轮状病毒组分；巨细胞病毒抗原,例如包膜糖 蛋白B和其他巨细胞病毒抗原组分；呼吸道合胞病毒抗原，例如RSV融合蛋白、M2蛋白以及 其他呼吸道合胞病毒抗原组分；单纯性疱疹病毒抗原，例如立即早期蛋白、糖蛋白D以及其 他单纯疱疫病毒抗原组分；水痘带状疱疫（varicella zoster)病毒抗原，例如gpl、gpll, 以及其他水痘带状疱疹病毒抗原组分；日本脑炎病毒抗原，例如蛋白E、M-E、M-E-NSl、NSl、 NS1-NS2A、80% E，以及其他日本脑炎病毒抗原组分；狂犬病病毒抗原，例如狂犬病毒糖蛋 白、狂犬病毒核蛋白以及其他狂犬病病毒抗原组分。另一些病毒抗原实例参见Fields B， Knipe D 编辑，"Fundamental Virology"，第二版（Raven Press，New York，NY，US，1991)。
[0026] 本文所用术语"载有抗原的抗原呈递细胞"是指捕获了抗原并将其加工以分别呈 递至与II类HLA分子和I类HLA分子缔合的⑶4辅助T细胞和⑶8细胞毒性T淋巴细胞 的树突细胞。
[0027] 本文所用术语"抗逆转录病毒治疗"或"ART"是指施用一种或更多种抗逆转录病 毒药物以抑制HIV的复制。一般来说，ART包括施用至少一种抗逆转录病毒试剂（或通常施 用抗逆转录病毒试剂的混合物），例如，核苷逆转录酶抑制剂（例如齐多夫定、AZT、拉米夫 定（3TC)和阿巴卡韦）、非核苷逆转录酶抑制剂（例如奈韦拉平和依法韦仑），以及蛋白酶 抑制剂（例如茚地那韦、利托那韦和洛匹那韦）。术语高效抗逆转录病毒治疗（"HAART"） 是指旨在强烈抑制病毒复制以及HIV疾病进展的治疗方案，通常由三种或更多种不同药物 组成，例如，两种核苷逆转录酶抑制剂和一种蛋白酶抑制剂。
[0028] 本文所用术语"自体"意为HIV-I病毒颗粒和树突细胞的供体和受体是同一对象。
[0029] 本文所用术语"细胞"等同于"宿主细胞"，旨在表示被引入了本发明的病毒基因 组、载体或HIV-I病毒颗粒的细胞。应理解，该术语不仅表示特定的对象细胞，还表示该细 胞的后代细胞或可能的后代细胞。由于突变或环境影响，在随后的世代中可能存在某些修 饰，因此，这样的后代细胞可能事实上与亲代细胞不同，但仍然可以包括在本文所用术语的 范围内。
[0030] 根据普遍接受的专利实践，本文所用术语"包括"或"包含"还涵盖"由......组 成"。
[0031] 本文所用表述"足以成熟的条件"是指在适合于使所述细胞达到成熟的条件下培 养未成熟树突细胞。成熟的适合条件是为本领域技术人员所公知的。成熟树突细胞可通过 使未成熟树突细胞与有效量或有效浓度的树突细胞成熟化试剂接触来制备（即，成熟化）。 树突细胞成熟化试剂可包括例如，BCG、IFN-Y、LPS、单磷酰基脂质A(MPL)、eritoran(CAS 号185955-34-4)、TNF-a及其类似物。BCG的有效量通常为约IO5Cfu至IO7Cfu每毫升组 织培养基。IFN-Y的有效量通常为约100U至1000U每毫升组织培养基。卡介杆菌（BCG) 是牛分枝杆菌（Ebovis)的无毒株。本文所用的BCG是指完整BCG、以及细胞壁组分、BCG 来源的脂阿拉伯甘露聚糖（Iipoarabidomannan)，以及与诱导2型免疫应答有关的其他BCG 组分。BCG任选地是失活的，例如热失活的BCG或福尔马林处理的BCG。通常使未成熟的 DC与有效量的BCG和IFN- Y接触约1小时至约48小时。合适的培养基包括AIM-V? 、RPMI 1640、DMEM或X-VIV015?。可在组织培养基中补充氨基酸、维生素、细胞因子（例如 GM-CSF)或二价阳离子来促进细胞的成熟。通常使用约500单位/mL的GM-CSF。
[0032] 本文所用表述"适合免疫原加工和通过抗原呈递细胞呈递的条件"是指在合适的 介质中孵育树突细胞以使得能够捕获免疫原并加工，并将所述免疫原呈递给免疫系统的其 他细胞。
[0033] 本文所用术语"接触"是指在预期载入至树突细胞之免疫原存在下孵育未成熟树 突细胞。未成熟的DC能够捕获并内化所述免疫原从而成为载有抗原的树突细胞（也称为 抗原脉冲的树突细胞）。未成熟DC的抗原捕获是通过大胞饮作用、受体介导的抗原捕获以 及对凋亡小体的内吞来介导的。优选地，所述孵育在37°C下进行6小时。抗原载入步骤或 脉冲的成功可通过以下来评估：洗涤经脉冲的树突细胞以去除未捕获的免疫原，并裂解所 述经脉冲的树突细胞以通过ELISA测定来测量胞内抗原含量。例如，当免疫原是HIV病毒 颗粒时，可测定展示于病毒颗粒衣壳表面的P24W抗原的胞内含量。
[0034] 本文所用的术语"树突细胞"是指在淋巴组织或非淋巴组织中发现的多样化的形 态类似之细胞类型的群中的任意成员。树突细胞是一类"专职性"抗原呈递细胞，并且具有 高的使HLA限制性T细胞敏化的能力。具体地，树突细胞包括例如，浆细胞样树突细胞、髓 样树突细胞（通常使用的树突细胞，包括未成熟树突细胞和成熟树突细胞）、郎格汉斯细胞 (作为皮肤中抗原呈递细胞的重要的髓样树突细胞）、交错突细胞（分布在淋巴结以及脾T 细胞区中，并且其被认为起到将抗原呈递给T细胞的作用）。所有这些DC群都来源于髓样 造血细胞。树突细胞还包括滤泡树突细胞,其为重要的针对B细胞的抗原呈递细胞,但是其 并非来源于髓样造血细胞。树突细胞可通过功能或表型（特别是细胞表面的表型）来识别。 这些细胞以其独特的形态（细胞表面上具有幕状突起）、中至高水平的表面II类HLA表达 以及将抗原呈递给T细胞（特别是幼稚T细胞）的能力为特征。参见Steinman R等^皿. Rev. Immunol. 1991 ;9 :271-196。树突细胞的细胞表面以表达细胞表面标志物⑶la+XD4+、 CD86+ 或 HLA-DR+ 为特征。
[0035] 本文所用术语"树突细胞成熟化试剂"是指这样的化合物：当用所述化合物孵育树 突细胞时能够使所述树突细胞成熟。
[0036] 本文所用术语"树突细胞前体"是指能够在合适的细胞因子（即，G-CSF、GM-CSF、 TNF-a、IL-4、IL-13、SCF(c-kit配体）、Flt-3配体或其组合）存在下分化成未成熟树突细 胞的任何细胞。树突前体细胞的实例包括但不限于髓样树突前体细胞、淋巴树突前体细胞、 浆细胞样树突前体细胞以及特别是单核细胞。由多种亚群的树突前体细胞表达的表型表面 标志物在本领域是公知的，并且可用于鉴定目的，例如通过流式细胞术或使用免疫组化技 术。
[0037] 本文所用术语"树突细胞疫苗"是指包含树突细胞的疫苗，所述树突细胞载有免疫 反应所期望针对的抗原。
[0038] 本文所用表述"HIV感染相关的疾病"包括对象已发展成AIDS的状态，同时也包括 感染了 HIV的对象未表现出任何疾病的病征或症状的状态。
[0039] 本文所用表述"需要针对载于抗原呈递细胞中之抗原的免疫应答的疾病"是指能 够通过施用抗原来预防或治疗的任何疾病。合适的疾病包括但不限于感染性疾病（例如 HIV)和癌症。
[0040] 本文所用术语"双硫仑（disulfiram) "是指也被称为Antabuse?或二硫化四乙 基秋兰姆二硫化物的化学药剂，其是FDA批准的广泛用于治疗酒精中毒的药物。所述化合 物还促使金属从HIV核衣壳蛋白锌指结构域中排出。
[0041] 本文所用术语"GM-CSF"是指来自任意物种或来源的粒细胞巨噬细胞集落刺激因 子（granulocyte macrophage colony stimulating factor 或 granulocyte macrophage colony stimulation factor),并且包括小鼠 GM-CSF(GenBank NM 009969)和人 GM-CSF(GenBank BC108724)的全长蛋白质以及蛋白质的片段或部分。在一个实施方案中， 所述GM-CSF来自人或小鼠。在另一个实施方案中，所述GM-CSF蛋白与全长GM-CSF相比缺 少最后10个羧基端氨基酸序列。本文所用术语"GM-CSF片段"意为GM-CSF肽的一部分，其 包括能够刺激干细胞产生粒细胞（嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞）和单核 细胞的 GM-CSF 多肽全长的至少 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95% 或更多。
[0042] 本文所用术语"利用gpl30的细胞因子（gpl30utilizing cytokine) "是指通过包 含gpl30的受体来转导信号的细胞因子。信号转导组件糖蛋白130(gpl30)也称为⑶130， 是形成IL-6受体家族中的I型细胞因子受体的一个亚单位的跨膜蛋白。可用于本发明的 利用gpl30的细胞因子（也称为IL-6样细胞因子）包括：白细胞介素6(IL-6)、白细胞介 素11 (IL-Il)、白细胞介素27 (IL-27)、睫状神经营养因子（CNTF)、心肌营养蛋白-I (CT-I)、 心肌营养蛋白样细胞因子（CLC)、白血病抑制因子（LIF)、抑癌蛋白M(OSM)以及卡波西肉瘤 相关的疱疹病毒白细胞介素6样蛋白（KSHV-IL6)。
[0043] 本文所用术语"HIV免疫原"是指来源于HIV的能够在对象中产生免疫应答的蛋 白质抗原或肽抗原，并且还指HIV病毒颗粒，所述颗粒是完整的病毒颗粒或缺少一个或更 多个病毒组分但保留了产生免疫应答能力的病毒颗粒。根据本发明使用的HIV免疫原可选 自任何HIV分离株（例如，任何原代的或培养的HIV-I、HIV-2或HIV-3分离株、毒株或分化 株）。现在HIV分离株被归类为分立的遗传亚型。已知HIV-I包含至少十种亚型（Al、A2、 A3、A4、B、C、D、E、PL F2、G、H、J 和 K)。参见 Taylor B 等，New Engl.J.Med 2008;359(18): 1965-1966。已知HIV-2包括至少五个亚型（A、B、C、D和E)。B亚型与在世界范围的男同性 恋以及静脉内药物使用者中的HIV流行有关。大多数HIV-I免疫原、实验室适应分离株、试 剂和绘制的表位都属于B亚型。在撒哈拉以南的非洲、印度和中国这些新增HIV感染发生 率高的地区中，HIV-IB亚型仅占感染的小部分，而HIV-IC亚型表现为最常见的感染亚型。 因此，在某些实施方案中，可优选从特定的亚型（例如，HIV-IB亚型或C亚型）中选择免疫 原。可期望在单个的免疫学组合物中包含来自多个HIV亚型（例如，HIV-IB亚型和C亚型， HIV-2A亚型和B亚型，或HIV-1、HIV-2或HIV-3亚型的组合）的免疫原。
[0044] 本文所用术语"HIV-1病毒颗粒"是指约120nm直径的大致球形的结构，其由被锥 形衣壳封装的两个拷贝的正单链RNA构成，所述衣壳由2, 000个拷贝的病毒蛋白p24构成， 所述RNA编码病毒的九个基因。单链RNA与核衣壳蛋白p7以及病毒体发育所需的酶（例 如逆转录酶、蛋白酶、核糖核酸酶和整合酶）紧密结合。由病毒蛋白P17构成的基质包围衣 壳以确保病毒体颗粒的完整性。即，在新形成的病毒颗粒从细胞出芽时，其进而被由两层获 自人细胞膜的被称为磷脂的脂肪分子构成的病毒包膜包围。包埋于病毒包膜中的是来自宿 主细胞的蛋白质，以及约70个拷贝的穿过病毒颗粒表面而突出的复合HIV蛋白。该蛋白称 为Env，其由三个被称为糖蛋白（gp) 120的分子构成的帽以及将该结构锚定在病毒包膜内 的由三个gp41分子组成的主干组成。该糖蛋白复合物使得病毒附着于靶细胞上，并与靶细 胞融合，以起始感染周期。
[0045] 本文所用术语"人类免疫缺陷病毒"或"HIV"意为包括HIV-I和HIV-2。"HIV-1" 意为1型人类免疫缺陷病毒。HIV-I包括但不限于胞外病毒颗粒以及与被HIV-I感染的细 胞相关联的HIV-I形式。"HIV-2"意为2型人类免疫缺陷病毒。HIV-2包括但不限于胞外 病毒颗粒以及与被HIV-2感染的细胞相关联的HIV-2形式。优选地，HIV是HIV-1。
[0046]本文所用术语"未成熟树突细胞"是指与成熟状态的树突细胞相比具有显著低的 T细胞活化能力的树突细胞。特别地，未成熟树突细胞可具有的抗原呈递能力为低于1/2， 优选低于1/4的通过添加LPS(1 y g/mL)并培养两天所诱导成熟之树突细胞的抗原呈递能 力。抗原呈递能力可使用例如异型（allo)T细胞活化能力（混合淋巴细胞测试）来量化： 在I : 10的T细胞：树突细胞比率下，或优选在不同的比率下，将异型T细胞和树突细胞 进行共培养；在培养结束前8小时添加3H-胸腺嘧啶，并基于整合进T细胞DNA中3H-胸腺 嘧啶的量来评估T细胞生长能力。参见Jonuleit H等，Gene Ther. 2000;7:249-254。可 替选地，可通过使用肽测试诱导特异性细胞毒性T细胞（CTL)的能力来评估，其中向树突细 胞添加某种抗原的已知的I类限制性肽；将树突细胞与由采集所述树突细胞的同一健康供 体的外周血中得到的T细胞共培养（在第三天或更晚的时候添加25U/mL或优选lOOU/mL 的IL-2)。优选在21天期间用树突细胞刺激T细胞三次，更优选在14天期间用树突细胞刺 激两次。将所得到的效应细胞与51Cr标记的靶细胞（肽限制性的I类阳性肿瘤细胞）以 100 : 1 至2.5 : 1(100 : 1、50 : 1、25 : 1、20 : 1、12.5 : 1、10 : 1、5 : 1 或2.5 : 1) 的比率、优选10 : 1的比率共培养4小时；量化从靶细胞释放的51Cr。参见Hristov G等， Arch. Dermatol. Res. 2000 ;292 :325-332。此外，未成熟树突细胞优选具有对抗原的吞噬能 力，并且更优选示出低表达（例如比上述由LPS诱导的成熟DC显著更低）或阴性表达诱导 共刺激T细胞活化的受体。未成熟树突细胞表达可用于通过流式细胞术或免疫组化染色来 鉴定该类细胞的表面标志物。
[0047]本文所用术语"免疫原"是指如果将其本身注入的话能够引发适应性免疫应答的 抗原。所有免疫原也都是抗原，但并非所有抗原都是免疫原。
[0048]本文所用术语"免疫原性组合物"是指在对象中引发免疫应答的组合物，所述免疫 应答为针对特异性免疫原产生抗体或细胞介导的免疫应答。免疫原性组合物可制备为例如 可注射物，例如液体溶液剂、混悬剂和乳剂。术语"抗原组合物"是指可被宿主免疫系统识 别的组合物。例如，抗原组合物包含能够被宿主免疫系统的体液组分或细胞组分识别的表 位。
[0049]本文所用术语"失活的HIV病毒"是指完整的、失活的HIV病毒。失活的HIV是指 不能感染或复制的病毒。完整的失活HIV病毒一般保持天然的病毒抗原结构，以维持免疫 原性，并刺激针对天然病毒的免疫应答。
[0050]本文所用术语"孵育"是指将树突细胞的培养物在成熟化介质中保持特定的时间， 优选48小时，直至未成熟树突细胞转化成成熟树突细胞。术语"介质"是包含合适的培养 基、一种或更多种成熟化试剂以及任选其他补充剂的成熟化基质。
[0051]本文所用术语"IL-4"是指任意物种的天然或重组的白细胞介素-4,其具有天然 人IL-4(SEQ ID N0:1)的129个通常存在的氨基酸序列，以及其保持了促进Th2细胞分化、 免疫球蛋白类型转换和B细胞中的抗体产生之能力的变体。参见Lee F等，US 5, 017, 691。 IL-4的活性可通过例如免疫学方法（例如ELISA或EIA)来测量。
[0052] 术语"基本失活的HIV的裂解物"是指当细胞被破坏时产生的包含HIV病毒体的溶 液，其溶液经受使用化学试剂的失活方法，其中至少20 %、至少30 %、至少40 %、至少50 %、 至少60 %、至少70 %、至少80 %、至少90 %或100 %的所述病毒失活。
[0053] 本文所用术语"成熟树突细胞"是与未成熟状态的树突细胞相比对T细胞等具有 显著较强的抗原呈递能力的细胞。特别地，与通过添加LPS(I ilgAiL)并培养两天来诱导成 熟之树突细胞的抗原呈递能力相比，所述成熟树突细胞可具有一半或更强，优选与其相等 或更强的抗原呈递能力。成熟的DC显示出共刺激细胞表面分子的上调表达，并且分泌多种 细胞因子。具体地，成熟的DC表达更高水平的I类HLA抗原和II类HLA抗原（HLA-A、B、 C，HLA-DR)，并且对于⑶80、⑶83和⑶86表面标志物的表达一般是阳性的。
[0054] 本文所用表述"半数组织培养感染剂量"或"TCID50"意为将在50%的所接种细胞 培养物中产生病理学改变的病原体的量。
[0055] 本文所用术语"药剂"应被理解为包含本发明之免疫原性组合物的药物组合物，特 别是疫苗。
[0056] 本文所用术语"单核细胞树突细胞前体"或MoDC前体包括在其表面上具有GM-CSF 受体的单核细胞，以及对GM-CSF有响应的其他髓样前体细胞。所述细胞可得自它们所存在 的任何组织中，特别是淋巴组织，例如脾、髓样、淋巴结和胸腺。单核细胞树突细胞前体还可 从循环系统中分离。外周血是单核细胞树突细胞前体的容易获得的来源。脐带血是单核细 胞树突细胞前体的另一个来源。
[0057] 本文所用术语"有效（operably)连接"旨在表示目的核苷酸序列与一个或更多个 调控序列以允许所述核苷酸序列表达的方式连接（例如，在体外转录/翻译系统中，或者 当载体被引入宿主细胞中时在宿主细胞中）。参见Auer H，Nature Biotechnol. 2006 ;24: 41-43。
[0058] 术语"可药用载体"、"可药用稀释剂"、"可药用赋形剂"或"可药用载剂"在本文中 可互换使用，表示任何常规类型的无毒的固体、半固体或液体填料、稀释剂、封装材料或制 剂辅料。在所使用的剂量和浓度下，可药用载体对接受者是基本无毒的，并且与制剂的其他 成分是可相容的。可药用载体的数量和性质取决于所期望的施用形式。可药用载体是已知 的，并且可通过本领域公知的方法来制备。参见Fauli i Trillo C，"Tratado de Farmacia Gal6nica"（Ed. Luzdn 5, S. A. , Madrid，ES, 1993),以及 Gennaro A 编辑，"Remington : The Science and Practice of Pharmacy，' 第 20 版(Lippincott ffilliams&ffilkins, Philadelphia, PA, US, 2003) 〇
[0059] 本文所用术语"预防"意为在感染的初始阶段或早期施用本发明的免疫原性组合 物或含有所述组合物的药剂以避免出现临床病征。
[0060] 本文所用表述"促炎性细胞因子混合物"是指能够引起未成熟树突细胞成熟的 两种或更多种细胞因子的混合物。这样的细胞因子的实例非限制地有=IL-I-P、IL-6、 丁即-〇、几-18、几-11、几-27和正^〇。合适的促炎性细胞因子混合物非限制地有 ：了即-〇 与⑶40L形成的混合物；IFN- a与TNF- a形成的混合物；IFN- a与⑶40L形成的混合物； IFN-a、TNF-a与CD40L形成的混合物；TNF-a、IL-I-P与IL-6形成的混合物；IL-I 3、 丁呖-〇、正^〇、正^￥与聚（1:〇形成的混合物；几-1、11-6、1呖-〇、正^〇与〇)401形 成的混合物。
[0061]本文所用术语"前列腺素"是指由脂肪酸酶促衍生的一组脂质化合物的成员，并 且在动物体内起着重要作用。每种前列腺素含有20个碳原子，包含5-碳环。可用于本 发明的前列腺素的实例非限制地有：前列环素I2(PGI2)、前列腺素E2(PGE 2)和前列腺素 F2a (PGF2a)。
[0062] 本文所用术语"补骨脂素化合物"是指属于被称为呋喃香豆素（furocoumarin)的 天然产物家族的化合物，所述呋喃香豆素是光活化化合物。所述化合物插入DNA中，并且在 暴露于紫外（UVA)辐射时，优选可与基因组中的5' -TpA位点处的胸腺嘧啶形成共价的链 间交联。
[0063] 本文所用术语"TLR4配体"或"toll样受体4配体"是指toll样受体4(TLR4)的 配体。TLR4还被称为⑶284 (分化簇284)，是Toll样受体家族的成员，其在病原体识别和 先天免疫系统的活化方面起重要作用。
[0064] 本文所用术语"TNF超家族成员"是指属于肿瘤坏死因子（TNF)超家族的细胞 因子。TNF超家族细胞因子表示促炎性细胞因子的多功能群，其激活细胞存活、凋亡、炎 性反应以及细胞分化的信号通路。TNF超家族成员的实例非限制地包括肿瘤坏死因子 a (TNF- a )、LIGHT、CD40 配体（CD40L)、4_1BB 配体（4-1BBL)、APRIL、CD27 配体（CD27L)、 ⑶30配体（⑶30L)、Fas配体、糖皮质激素诱导的TNFR相关配体（GITRL)、淋巴毒素 a (LT a )、淋巴毒素0 (LT P )、0X40配体（0X40L)、NF- K B配体的受体激活剂（RANKL)、TNF 家族的B细胞激活因子（BAFF)、TNF相关的凋亡诱导配体（TRAIL)、TNF样弱凋亡诱导物 (TWEAK)以及 VEGl。
[0065] 本文所用术语"治疗"是指在临床病征出现之前或之后施用本发明的免疫原性 组合物或包含该组合物的药剂以控制疾病的发展。对疾病发展的控制应理解为意为有益 的或期望的临床结果，其包括但不限于：症状的减少、疾病持续时间缩短、病理状态稳定化 (特别是避免进一步恶化）、延迟疾病的发展、改善病理状态以及缓解（部分地和完全地二 者）。对疾病发展的控制还包括与未施加治疗的预期存活相比延长存活。在本发明的上下 文中，术语"治疗"特别是指防止或减缓被HIV-I感染之对象中健康的CD4+T细胞的感染和 破坏。该术语还指防止和减缓获得性免疫缺陷疾病的症状的发作，例如极低的CD4+T细胞 数以及被机会病原体例如分支杆菌属（Mycobacteria spp)、卡氏肺孢子虫（Pneumocystis carinii)和隐球菌肺孢子菌（Pneumocystis cryptococcus)反复感染。有益或期望的临床 结果包括但不限于，幼稚⑶4+T细胞的绝对数的升高（10至3520的范围），⑶4+T细胞占总 循环免疫细胞百分率的升高（1%至50%的范围），和/或⑶4+T细胞数升高（1%至161% 的范围）为未被感染的对象中正常CD4+T细胞数的百分率。"治疗"还可意为与没有接受任 何HIV靶向治疗之对象的预期存活相比延长被感染对象的存活。
[0066] 本文所用术语"疫苗"是指用于向宿主体内施用以提供针对疾病（特别是病毒性 疾病）之防护的免疫原性组合物，所述宿主可为灵长类宿主，尤其是人宿主。
[0067] 本文所用术语"载体（vector) "表示线性或环状的核酸分子，其包含编码形成病毒 颗粒之所有蛋白质（除了部分或完整的整合酶蛋白质）的基因组，所述基因组与为其在目 的宿主细胞中的自主复制所提供的额外片段有效连接。优选地，所述载体是表达载体，其被 定义为这样的载体，其除了宿主细胞中的自主复制区域外，还包含与本发明的基因组有效 连接并且能够增强根据本发明的基因组产物之表达的区域。
[0068] 本文所用术语"病毒颗粒"是指完整的病毒颗粒，而不是指蛋白亚基或肽。病毒颗 粒（也称为病毒体）由两部分或三部分组成：由DNA或RNA构成的病毒遗传物质；保护这些 基因的蛋白质外壳；以及在一些情况下，当它们处于细胞外时包围所述蛋白质外壳的脂质 包膜。取决于病毒，病毒颗粒的形状为从单螺旋和二十面体形式至更复杂的结构。
[0069] 2.用于体外获得载有抗原之抗原呈递细胞的方法
[0070] 在第一个方面中，本发明涉及用于获得载有抗原的树突细胞的体外方法（下文中 称为"本发明的第一种方法"），其包括：使未成熟树突细胞在足以使所述未成熟树突细胞成 熟的条件下并且在防止细胞附着于基底的条件下与包含所述抗原的免疫原接触。
[0071] 本发明的方法包括在足以a)使抗原呈递细胞成熟，以及b)防止细胞附着于基底 的条件下使未成熟树突细胞与包含抗原的免疫原接触。
[0072] 在一个优选实施方案中，所述免疫原是病毒颗粒，优选HIV病毒颗粒，更优选 HIV-I病毒颗粒。所述病毒颗粒可包含若干抗原。
[0073] HIV-I病毒的整个基因组表现出异常高度的遗传变异性。序列对比已鉴定了 HIV-I的三个遗传群，命名为M、0和N。根据2009年分离的一株病毒，猜测存在第四群"P"。 M群进一步分为系统发生相关的主要遗传亚型（或分枝），命名为A、B、C、D、E、F、G、H、J和 K。不同亚型的共感染产生流行重组型（CRF)。M群与流行亚型间重组型（CRF) -起包括了 当今世界大多数的HIV-I变体。本发明的HIV-I病毒可表示能够感染人类的任何遗传群或 遗传亚型，并且还包括流行重组型、实验室毒株以及原代分离株。因此，在一个优选实施方 案中，免疫原是HIV免疫原。
[0074]合适的 HIV 免疫原包括：HIV 包膜（env;例如 NCBI Ref. Seq. NPJ357856)、gag (例 如 p6、p7、pl7、p24、GenBankAAD39400. I)、pol 编码的蛋白酶（例如 UniProt P03366)、 nef (例如 GenBank CAA41585. 1，Shugars D 等，J. Virol. 1993 ;67 (8) :4639-4650)，以及其 变体、衍生物和融合蛋白。参见G6mez C等，Vaccine 2007;25:1969-1992。合适的毒株和 组合可由本领域技术人员根据需要来选择。
[0075] 本发明的HIV免疫原能够引发免疫应答。特别地，"免疫应答"是指⑶4+T细胞或 ⑶8+T细胞介导的针对HIV感染的免疫应答。针对HIV的免疫应答可通过测量例如以下因 子来确定：病毒载量、T细胞增殖、T细胞存活、T细胞进行的细胞因子分泌或抗原特异性抗 体产量（例如，抗体浓度）的增加。
[0076] 所述方法的第一步是在足以使所述抗原呈递细胞成熟的条件下进行的。在一个优 选实施方案中，足以使所述未成熟树突细胞成熟的条件包括与GM-CSF和IL-4的组合接触。
[0077] GM-CSF 可以以 100IU/mL 至 1500IU/mL 的浓度使用，优选 300IU/mL 至 1300IU/mL， 更优选 500IU/mL 至 1200IU/mL，例如 700IU/mL 至 1100IU/mL，并且最优选约 1000IU/mL。纯 化的 GM-CSF 或重组的 GM-CSF(例如重组人 GM-CSF(R&D Systems，Inc.，Minneapolis，MN, US)或沙格司亭（Leukine?，Bayer Healthcare Pharmaceuticals, Inc. ,Wayne,NJ，US)) 都可用于本文所述的方法。
[0078] IL-4 可以以 100IU/mL 至 1500IU/mL 的浓度使用，优选 300IU/mL 至 1300IU/mL，更 优选 500IU/mL 至 1200IU/mL，例如 700IU/mL 至 1100IU/mL，并且最优选约 1000IU/mL。
[0079] 在一个优选实施方案中，两种细胞因子（GM-CSF和IL-4)都以lOOOIU/mL的浓度 使用。
[0080] 在再造用于DC成熟之生理环境的尝试中，可使用成熟化试剂的一些平衡混合物。 因此，在另一个优选实施方案中，所述细胞成熟化试剂是促炎性细胞因子混合物。在一个优 选实施方案中，所述促炎性细胞因子混合物至少包含IL-I受体的激动剂、利用gpl30的细 胞因子以及TNF超家族成员。所述细胞因子混合物可包含其他化合物。
[0081] 在一个优选实施方案中，所述IL-I受体激动剂是IL-I 0。优选地，有效的IL-I 3 浓度为300U/mL。在另一个优选实施方案中，所述利用gpl30的细胞因子是IL-6。优选地， 有效的IL-6浓度为lOOOU/mL的IL-6。在另一个优选实施方案中，所述TNF超家族成员是 丁呖-〇。优选地，有效的了呖-〇浓度为100(^/1^。
[0082] 最常使用的混合物包含TNF-a、IL-I P和IL-6。因此，在一个优选实施方案中， 所述促炎性细胞因子混合物包含IL-I P、IL_6和TNF-a的混合物。更优选地，所述介质的 组成为：300U/mL 的 IL-I P、1000U/mL 的 TNF-a 和 l〇〇〇U/mL 的 IL-6。
[0083] 已公开，向促炎性细胞因子混合物中添加前列腺素改进了所生成之DC的产量、成 熟、迁移和免疫刺激能力。参见Jonuleit H等，Eur. J. Immunol. 1997 ;27 :3135-3142。因此， 在一个优选实施方案中，所述促炎性细胞因子混合物还包含前列腺素。更优选地，所用的前 列腺素是前列腺素E 2 (PGE2)。优选地，有效的PGE2浓度为I y g/mL。更优选地，所述介质的 组成为：300IU/mL 的 IL-I P、1000IU/mL 的 TNF-a、l〇〇〇IU/mL 的 IL-6 和 lug/mL 的 PGE2。
[0084] 在另一个实施方案中，所述接触步骤包括第一步，其中使细胞与GM-CSF和IL-4的 组合接触；以及第二步，其中使所述细胞与上述促炎性细胞因子混合物接触。在另一个实施 方案中，所述接触步骤包括第一步，其中使细胞与GM-CSF和IL-4的组合接触；以及第二步， 其中使所述细胞与GM-CSF和IL-4以及上述促炎性细胞因子混合物的组合接触。
[0085] 本发明的第一种方法还在防止细胞附着于基底的条件下进行。如果细胞可在施加 轻柔的机械力（例如轻拍烧瓶）以使弱附着的细胞分离后通过来自培养容器的上清液来收 集，则该细胞被视为非黏着的。在一个优选实施方案中，使用低附着性的基底来防止细胞附 着于基底。这些基底是广泛可获得的，并且通常由亲水并且电中性的水凝胶形成，从而防止 细胞通过与带负电或带正电的表面蛋白质的相互作用或者疏水相互作用而附着。当基底导 致单核细胞群的附着比对附着基底（例如聚苯乙烯基底）的附着低至少10%、至少20%、 至少30 %、至少40 %、至少50 %、至少60 %、至少70 %、至少80 %、至少90 %或更低，则该基 底被视为低附着。用于确定表面是否是低附着的合适测定在本领域是已知的。参见Shen M 等，J. Biomed. Mater. Res. 2001 ;57 :336_345。
[0086] 本发明的方法使用未成熟树突细胞来进行，当与成熟化组合物接触时，其发育成 成熟的树突细胞。
[0087] 未成熟树突细胞可从树突细胞前体群得到。优选地，所述树突细胞前体可在四周 或更短时间内分化成未成熟树突细胞的细胞，所述时间更优选20天或更短时间，甚至更优 选18天或更短时间，且更优选16天或更短时间。在一个优选实施方案中，所述树突细胞前 体在GM-CSF和IL-4的存在下，在小于7天内，更优选5天内，分化成未成熟树突细胞。
[0088] 在一个优选实施方案中，所述树突前体细胞群是单核细胞树突细胞前体群。更优 选地，所述单核细胞树突细胞前体来源于外周血单个核细胞（PBMC)。PBMC可从用缓冲盐水 I : 1稀释的全血中得到，或者通过Ficoll-Paque PLUS (不含内毒素，货号17-1440-03， Amersham Pharmacia Biotech AB，Uppsala，SE)进行标准离心从白细胞浓缩物（"血沉 棕黄层"级分，MSKCC血库）中得到。MoDC前体是组织培养塑料附着性的（货号35-3003， Falcon，Becton-Dickinson Labware Inc. , Franklin Lakes，NJ，US)PBMC，并且可如上所 述在GM-CSF(1000IU/mL)和IL-4(500IU/mL)的存在下，在加有1%正常人血清（NHS)(或 10%胎牛血清）的全RPMI 1640中进行培养，每两天更换一次培养液。参见Thurner B等， J. Immunol. Meth. 1999 ;223 :1-15 以及 Ratzinger G 等，J. Immunol. 2004 ; 173 :2780-2791。
[0089] 可在培养之前用CD14+抗体从PBMC分离纯化的单核细胞群，以得到未成熟树突细 胞。单核细胞通常通过染色的涂片中大的两叶核来鉴定。除了表达CD14外，单核细胞还表 达一种或更多种以下表面标志物：125I-WVH-1、63D3、亲脂素（adipophilin)、CB12、CDlIa、 CDlIb、CD15、CD54、Cdl63、胞苷脱氨酶和 FIt-I。参见 Feyle D 等，Eur. J. Biochem. 1985 ; 147 :409-419, Malavasi F 等，Cell Immunol. 1986 ;97 (2) :276-285, Rupert J 等， Immunobiol. 1991 ；182(5) :449-464 ；Ziegler-Heitbrock H, J. Leukoc. Biol. 2000 ；67 ： 603-606,以及 Pilling D 等，PLoS One 2009 ;4 (10) :e-7475。
[0090] 一般而言，单核细胞树突细胞前体可通过标志物（例如⑶13和⑶33)的表达来鉴 定。髓样树突前体可经CD14或CDla通路分化成树突细胞。因此，本发明的树突前体细胞 可为⑶14+⑶Ia-树突前体细胞或⑶14-⑶Ia+树突前体细胞。在本发明的某些实施方案 中，髓样树突前体细胞可以以表达SCA-1、c-kit、⑶34、⑶16和⑶14标志物为特征。在一 个优选实施方案中，髓样树突前体细胞为CD14+单核细胞。所述CD14+单核细胞还可表达 GM-CSF 受体。
[0091]用作本发明第一种方法的起始材料的未成熟树突细胞可为待治疗对象自体的。在 另一些实施方案中，用作本发明方法的起始材料的未成熟树突细胞是异源的树突细胞。例 如，如果要治疗移植物抗宿主疾病，用作起始材料的所述未成熟树突细胞是从供体获得的 树突细胞。对象可为例如小鼠、大鼠、狗、鸡、马、山羊、驴或灵长类。最优选地，所述对象是 人。在一个优选实施方案中，所述未成熟树突细胞是单核细胞来源的未成熟树突细胞。
[0092] 本发明的第一种方法包括：使未成熟树突细胞在足以使所述抗原呈递细胞成熟的 条件下和防止细胞附着于基底的条件下与包含所述抗原的免疫原接触。结果，得到了载有 抗原的抗原呈递细胞。
[0093]在孵育时间结束时得到成熟的载有抗原的树突细胞（即，携带目的抗原的成熟树 突细胞）。树突细胞的成熟可通过本领域已知的方法监测。可在例如流式细胞术和免疫组 化染色的测定中检测mDC表面标志物。还可通过细胞因子的产生（例如通过另一种免疫测 定ELISA，或者通过使用寡核苷酸测定）来监测mDC。树突细胞的成熟可通过免疫分型来进 一步确认。可例如基于选自CD80和CD86的标志物来区分未成熟树突细胞和成熟树突细胞。 未成熟树突细胞这些标志物呈弱阳性，优选阴性，而成熟树突细胞呈阳性。
[0094] 当在含有未成熟树突细胞群的培养物中进行本发明的方法时，足以成熟的条件使 得实现至少50 %、至少60 %、至少70 %、至少80 %、至少90 %或优选100 %的未成熟树突细 胞成熟。
[0095] 在一个优选实施方案中，本发明的第一种方法还包括回收免疫原脉冲的树突 细胞。所述回收可通过任何本领域已知的方法进行。在一个优选实施方案中，所述 免疫原脉冲的树突细胞的回收通过使用对成熟树突细胞标志物特异的抗体免疫隔离 (immunoisolation)来进行，例如以下的一种或更多种：CD4、CD8、CD54、CD56、CD66b 和 CD86。
[0096] 在一个优选实施方案中，待载入树突细胞的免疫原是病毒颗粒，优选逆转录病毒 颗粒。在另一个优选实施方案中，所述免疫原是慢病毒颗粒，优选HIV病毒颗粒。更优选地， 所述免疫原是HIV-I病毒颗粒。
[0097] HIV-I病毒通过使用细胞表面的协同受体来与人⑶4细胞结合，随后感染人⑶4 细胞。不同的HIV-I毒株使用不同的协同受体来进入人CD4细胞。因此，当毒株仅使用 C-C趋化因子受体5型（CCR5)协同受体感染⑶4细胞时，HIV-I病毒可能是CCR5向性 的（CCR5-tropic);当毒株仅使用C-X-C趋化因子受体4型（CXCR4)协同受体感染CD4细 胞时，是CXCR4向性的；并且当毒株既能使用CCR5协同受体又能使用CXCR4协同受体感 染 CD4 细胞时，是双向向性的（dual-tropic)。参见 Whitcomb J等，Antimicrob.Agents Chemother. 2007 ;51 (2) :566-575。存在若干种可用的测定来区分不同向性的病毒（例如 TVofile?, Monogram Biosciences，Inc.，San Francisco, CA, US)。在一个优选实施方案 中，所述HIV-I病毒选自CXCR4向性病毒和CCR5向性病毒；优选为CXCR4向性病毒。
[0098] 在另一个实施方案中，所述免疫原是失活的HIV颗粒，或基本失活HIV的裂解物。 可使用常规方法使病毒或其裂解物失活，例如加热、化学试剂以及光化学试剂。
[0099] 失活的病毒在体外检测不到感染性。为了量化由所施加的失活方法产生的感染剂 量的降低，以及为了量化在失活后的样品中仍然存在的残余感染剂量，对失活的HIV进行 测定。可用于该目的的方法在本领域是已知的。参见Agrawal K等，PLoS One. 2011 ;6(6): e21339。所述方法包括使用失活的上清液来感染允许（permissible)细胞，然后检测新形 成的病毒。所述检测可通过测量由细胞产生的HIV RNA拷贝数/mL，或者通过ELISA法来测 量每毫升上清液中HIV p24抗原的量来进行。HIV p24抗原的产生的检测可例如通过在本 发明的实验部分描述的ELISA来进行。
[0100] 失活步骤进行足够的时间以导致相对于对照上清液（即，未用失活试剂处理的上 清液，或者在类似的条件下用本应提供失活试剂的载剂处理的上清液），所述上清液感染 性降低至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少 80%、至少90%或至少100%。适于评估HIV失活的方法包括但不限于，取出血液培养物， 然后在T细胞介质中培养，并测量感染性。一种替选方法是在以周期性的方式（例如，每1 天至7天）在进行失活尝试或处理之前和之后测定血液中存在的病毒拷贝数。
[0101] 在一个实施方案中，所述免疫原是加热失活的病毒或病毒裂解物。病毒（例如 HIV-1)可通过本领域已知的数种方案来加热失活。参见Harper J等，J. Virol. 1978; 26(3) :646-659, Einarsson R 等，Transfusion 1989 ;29(2) :148-152,以及 Gil C 等， Vaccine 2011 ;29(34) :5711-5724。
[0102] 在另一个实施方案中，所述免疫原是化学失活的病毒或病毒裂解物。可通过用化 学试剂孵育病毒来实现所述失活。在本发明的另一个方面，对病毒与化学试剂的混合物进 行辐照。优选地，用紫外光辐照混合物直至病毒失活。
[0103] 在一个优选实施方案中，所述化学试剂是锌指修饰性化合物。术语"锌指修饰性化 合物"是指共价修饰HIV病毒体核衣壳蛋白中必需的锌指，从而使其失去感染性的化合物。 这种失活模式的一个优点是，保存了病毒体表面上的蛋白质的构象完整性和功能完整性。 已鉴定了多种化合物，其通过多种不同机制以共价修饰核衣壳锌指，导致配位的锌释放并 失去感染性来起作用。虽然这些化合物的具体作用机制各不相同，但是其共同的机制特征 涉及对组成核衣壳蛋白锌指的残基中配位锌的半胱氨酸硫进行优先化学攻击。参见Rossio J 等，J. Virol. 1998 ;72 (10) :7992-8001)。
[0104] 用于根据本发明方法的合适锌指修饰性化合物包括但不限于：
[0105] (i) C-亚硝基化合物，
[0106] (ii)偶氮二甲酰胺，
[0107] (iii)具有R-S-S-R结构的二硫化物，
[0108] (iv)具有以下结构的马来酰亚胺
[0109]

【权利要求】
1?一种用于获得载有抗原的树突细胞的体外方法，其包括：使未成熟树突细胞在足以 使所述未成熟树突细胞成熟的条件下并且在防止细胞附着于基底的条件下与包含所述抗 原的免疫原接触。
2. 根据权利要求1所述的方法，其还包括回收所述载有抗原的树突细胞。
3. 根据权利要求1或2所述的方法，其中所述足以使所述未成熟树突细胞成熟的条件 包括与GM-CSF和IL-4的组合接触。
4. 根据权利要求1至3中任一项所述的方法,其中所述足以使所述未成熟树突细胞成 熟的条件还包括与促炎性细胞因子混合物接触。
5. 根据权利要求4所述的方法，其中所述促炎性细胞因子混合物至少包含IL-I受体的 激动剂、利用gpl30的细胞因子以及TNF超家族成员。
6. 根据权利要求5所述的方法，其中所述IL-I受体的激动剂是IL-I运，其中所述利用 gp 130的细胞因子是IL-6和/或其中所述TNF超家族成员是TNF-a。
7. 根据权利要求4至6中任一项所述的方法，其中所述促炎性细胞因子混合物还包含 前列腺素。
8. 根据权利要求7所述的方法，其中所述前列腺素是前列腺素 E2(PGE2)。
9. 根据权利要求8所述的方法，其中介质的组成为：30(mJ/mL的IL-I P、1000IU/mL的 TNF- a、l〇〇〇IU/mL 的 IL-6 和 I U g/mL 的 PGE2。
10. 根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述防止细胞附着于基底的条件包 括使用低附着基底。
11. 根据权利要求1至1〇中任一项所述的方法，其中所述未成熟树突细胞是单核细胞 衍生的未成熟树突细胞。
12. 根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述免疫原是HIV免疫原。
13. 根据权利要求12所述的方法，其中所述HIV免疫原是失活的HIV颗粒。
14. 根据权利要求13所述的方法，其中所述失活的HIV颗粒选自热失活的HIV颗粒、化 学失活的HIV颗粒和光化学失活的HIV颗粒。
15. 根据权利要求14所述的方法，其中所述失活的HIV颗粒是使用干扰CCHC锌指之试 剂获得的化学失活的HIV颗粒。
16. 根据权利要求14所述的方法，其中所述失活的HIV颗粒是热失活的HIV颗粒。
17. 根据权利要求15所述的方法，其中所述干扰CCHC锌指的试剂选自： (i) C-亚硝基化合物， (ii) 偶氮二甲酰胺， (iii) 具有R-S-S-R结构的二硫化物， (iv) 具有以下结构的马来酰亚胺
(V)具有以下结构的a -卤代酮
(vi) 具有式R-NH-NH-R的酰肼， (vii) -氧化氮及包含NO基团的其衍生物， (viii) 铜离子以及包含Cu2+的配合物， (ix) 铁离子以及包含Fe3+的配合物， 其中R是任意原子或分子，并且X选自F、I、Br和Cl。
18. 根据权利要求17所述的方法，其中所述二硫化物是双硫仑或aldrithiol-2(2， 2' -二硫二吡啶）。
19. 根据权利要求13所述的方法，其中所述失活的HIV颗粒是使用补骨脂素化合物并 在能够活化所述补骨脂素化合物的波长下辐照获得的光化学失活的HIV颗粒。
20. 根据权利要求19所述的方法，其中所述补骨脂素化合物是氨托沙林。
21. 根据权利要求1至20中任一项所述的方法，其中所述HIV是HIV-I。
22. 可通过权利要求1至21中任一项所限定的方法来获得的抗原脉冲的树突细胞。
23. -种树突细胞疫苗，其包含根据权利要求22所述的抗原脉冲的树突细胞。
24. 根据权利要求23的树突细胞疫苗，其用于医疗。
25. 根据权利要求24的树突细胞疫苗，其用于治疗或预防HIV感染或与HIV感染有关 的疾病，其中所述免疫原是HIV免疫原。
【文档编号】A61K39/21GK104244975SQ201380020366
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2013年3月1日 优先权日:2012年3月2日
【发明者】费莉佩·加西亚阿尔凯德, 特里萨·加拉特, 努里亚·克利门特维达尔, 克里斯蒂娜·吉尔罗达, 约瑟夫·马里亚·加特利阿蒂加斯 申请人:埃斯特韦实验室有限公司, 私人艾滋病研究基金会-银行