重组灵芝免疫调节蛋白（rLZ-8）在制备治疗组织纤维化药物中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及生物制药领域，重点涉及重组灵芝免疫调节蛋白（rLZ-8）在制备治疗组织纤维化药物中的应用，经过一系列实验结果表明，重组灵芝免疫调节蛋白在治疗器官纤维化方面与其他阳性对照药比较具有治疗效果显著，无副作用等优势。
【专利说明】重组灵芝免疫调节蛋白(rLZ-8)在制备治疗组织纤维化药物中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及重组灵芝免疫调节蛋白(rLZ-8)在制备治疗组织纤维化药物中的应用。具体涉及以小鼠作为实验对象，建立组织纤维化模型，设计合理的给药途径和剂量，定期检测小鼠组织纤维化症状，以改善小鼠的生活质量和延长小鼠寿命为治疗目标，评价重组灵芝免疫调节蛋白治疗组织纤维化过程中的意义。
【背景技术】 [0002]纤维化(Fibrosis)能发生于多种器官，主要病理改变为器官组织内纤维结缔组织增多，实质细胞减少，持续进展可致器官结构破坏和功能减退，乃至衰竭，严重威胁人类健康和生命。
[0003]机体器官由实质和间质两部分构成。实质是指器官的主要结构和功能细胞，间质由间质细胞和细胞外基质构成，分布在实质细胞之间，主要起机械支撑和连接作用。此外细胞外基质构成维持细胞生理活动的微环境，是细胞之间的信号传导的桥梁，参与多种生理病理过程，在组织创伤修复和纤维化过程中起重要作用。
[0004]以肺纤维化举例说明，肺纤维化作为一种高致死率的疾病，在医学界已经越来越受到重视。其中，特发性肺纤维化是特发性间质性肺炎中最为常见的一种，发病比例大约占43%~68%。目前，我们经常说的肺纤维化疾病主要包括特发性肺纤维化、矽肺、过敏性肺泡炎以及放射线和药物所导致的肺纤维化，还包括与胶原血管病相关联的肺部炎症等范围较为广泛的一类慢性肺部疾病。此外，各类的慢性以及急性的肺部疾病通常会伴有不同程度上的肺部炎症和纤维化，它们均称为肺间质性疾病。各种不同病因引发的肺间质性疾病的共同结局是肺间质纤维化，也是引发呼吸衰竭的首要因素。
[0005]肺纤维化发病机理主要是多种炎性细胞以及相关的介质参与的损伤过程引发的炎症反应、肺组织的纤维增生修复过程中胶原纤维的过量沉积，肺组织结构被破坏，丧失了正常的气体交换功能。肺纤维化是以肺实质组织成纤维细胞的大量聚集、细胞外基质沉积过量同时伴随有肺组织的炎症和损伤所致组织结构破坏为病理特征。
[0006]因肺纤维化的发病机理并不十分清楚，故在治疗方面还存在着一些困难。以前医生只是用一些非特异性抗炎药物减少炎症反应来减轻纤维化程度；或是用糖皮质激素及免疫抑制剂等药物来缓解病人的病症，但并没有对纤维化的根源进行根治，故治疗效果并不是很理想。通常在治疗过程中伴随有其他的并发症发生或是治疗药物的副作用过大而导致损伤其他的器官，同时也不能很好的改善病人的生活质量。因此，不断的研究新的药物成为一种迫切需求。目前，深入的研究肺纤维化发病机制后，人们猜想通过阻断发病的早期的炎症反应或是减轻修复过程中胶原的过量沉积的治疗方法是可以有效的治疗肺纤维化，由此建立了多种新治疗方法。现在一般认为，加强对肺纤维化的临床诊断和早期识别，对治疗是非常有必要的。了解肺纤维化的一些临床表现能更早的进行确诊，为治疗争取宝贵的时间；对肺纤维化发病机制的研究可以找出最佳的治疗方法。[0007]针对目前的治疗组织纤维化药物都有很严重的副作用，而且并不能非常有效地改善小鼠的生活质量或是延长寿命，寻找一种能解决上述问题的药物显得十分重要。本研究主要探讨重组灵芝免疫调节蛋白rLZ-8用于预防和治疗药物诱导的组织纤维化。
【发明内容】
[0008]本发明涉及重组灵芝免疫调节蛋白rLZ-8在制备治疗组织纤维化药物中的应用，经过一系列实验结果表明，重组灵芝免疫调节蛋白在治疗组织纤维化过程中，药效显著，与其他阳性对照样比较具有治疗效果显著，无副作用等优势。具体
【发明内容】
如下:
本发明采用实验鼠作为研究对象，分别设计并建立了不同组织纤维化模型，其中，以博来霉素(BLM)作为肺纤维化的造模用药，雾化法造模技术，建立小鼠肺组织纤维化模型；以多柔比星(Dox)作为心肌纤维化造模用药，采用尾静脉注射法建立小鼠心肌纤维化模型；采用顺钼(CDDP)作为肾脏纤维化造模用药，腹腔注射法建立小鼠肾脏纤维化模型；以体积分数为50%四氯化碳(CCl4)橄榄油溶液作为肝脏纤维化造模用药，采用背部皮下注射法建立大鼠肝脏纤维化模型；通过设置对照实验法对比说明重组灵芝免疫调节蛋白在治疗组织纤维化过程中的作用，以组织纤维化的生化参数改变作为主要考察参数，利用SPSS统计学软件对实验结果进行了统计分析，统计结果表明，在治疗组织纤维化方面rLZ-8与其它阳性药比较具有显著差异，无明显的毒副作用产生。
[0009]本发明的有益之处在于:本发明所提供的重组灵芝免疫调节蛋白(rLZ-8)在治疗组织纤维化方面具有显著疗效，采用了 4种典型的组织纤维化病例为代表，说明了 rLZ-8在治疗组织纤维化病症中的应用是显而易见的，在肺组织纤维化实施例中我们可以看到，rLZ-8与阳性药的治疗效果具有明显的差异和优势，并且没有伴随的副反应发生，延长了患病小鼠的生命，在心脏 、肾脏、肝脏的实验中，rLZ-8的治疗效果具有明显的差异和优势，在组织创伤恢复和纤维化含量以及大鼠模型血清中ALT (U/L)、AST (U/L)、ALB (g/L)的活力恢复方面具有积极的影响，同时与阳性对照组相比较具有统计学意义，部分实验中期在治疗组出现纤维化大幅减少甚至消失，是发明人始料未及的，同时也是rLZ-8所能达到的最佳效果。
[0010]【专利附图】
【附图说明】:
图1 rLZ-8对肾纤维化的组织损伤对比的影响 图2 rLZ-8对肾纤维化间质中胶原成分含量的影响
【具体实施方式】
[0011 ] 实施例1:小鼠肺组织纤维化模型的建立 实验材料
昆明鼠雌性，体重范围在18-22g，博来霉素(BLM)，羟脯氨酸试剂盒，丙二酮试剂盒，免疫组化染色试剂盒，抗体，HE染色试剂，医用雾化器，透明玻璃容器，常规试剂(NaCl、多聚甲醛、PBS等)，解剖刀具，正置荧光显微镜，小鼠垫料及饲料，Real time PCR试剂盒，PCR特异引物，冰冻切片机及石蜡切片机。
[0012]实验方法与操作
雾化法造模、肺泡灌洗技术、冰冻及石蜡切片技术、HE染色及Masson氏三色染色技术、ELISA法检测灌洗液中蛋白的变化、流式法检测灌洗液中的炎性细胞的量。
[0013]建模实验:1)建模实验分组:分设3个组，分别为生理盐水组(A组)、BLM低剂量组(B组4mg/mL)、BLM高剂量组(C组8mg/mL)，每组12只小鼠。将各组12只鼠分为两个小组每组6只，分别放入长宽高各为20cm的透明玻璃容器里，做好相应的标记，用医用超声雾化器分别将生理盐水和BLM以雾状的形式喷到相应的透明玻璃器里，2)建模给药操作程序:每次雾化量为Iml,关闭玻璃罩封闭15 min,鼠放回笼内休息5min,此操作重复6次。3)实验结果观察:每天9时和17时记录小鼠的死亡情况并随时观察活动情况。分别于饲养3天、7天、14天和21天的4个时间点处死小鼠取肺观察小鼠肺外观、颜色、肺表面的变化情况；取肺后先进行支气管肺泡灌洗，然后取肺组织一部分做石蜡切片，进行HE染色的组织学检测；另取一部分肺组织做RT-PCR，进行RNA水平的检测。根据组织学分析和RNA水平，蛋白水平和炎性细胞量的变化来评价肺纤维化的模型建立是否可用。下表是按Szapiel等的方法评价肺组织病理变化严重程度的分级标准。
[0014]表1 Szapiel肺组织病理变化等级
【权利要求】
1.重组灵芝免疫调节蛋白(rLZ-8)在制备治疗组织纤维化药物中的应用。
2.如权利I所述组织纤维化，其特征在于包括肺组织纤维化。
3.如权利I所述组织纤维化，其特征在于包括心脏组织纤维化。
4.如权利I所述组织纤维化，其特征在于包括肾脏组织纤维化。
5.如权利I所述组织纤维化，其特征在于包括肝脏组织纤维化。
6.如权利I所述药物，其特征在于该药物制剂核心成分是由权利要求1所述的重组灵芝免疫调节蛋白(rLZ-8)和任选的药学可接受的辅剂组成。
7.如权利要求1所述的药物制剂给药途径为口服和非肠道给药，其中，口服包括口服液，片剂，丸剂和胶囊；非肠道给药包括外用药和注射剂。
【文档编号】A61P1/16GK103751765SQ201410048713
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2014年2月12日 优先权日:2014年2月12日
【发明者】孙非, 梁重阳, 张喜田 申请人:张喜田, 孙非