灭活肺炎克雷伯菌作为免疫佐剂在动物灭活疫苗中的用途
【专利摘要】本发明公开了灭活肺炎克雷伯菌在在作为免疫佐剂在动物灭活疫苗中新的用途，灭活肺炎克雷伯菌菌液作为免疫成分，具有免疫增强剂作用，既可以诱导机体产生针对肺炎克雷伯菌的抗体使机体免受克雷伯菌的感染，又可以起免疫调节活性提高机体对疫苗应答水平，产生更好的免疫保护。
【专利说明】灭活肺炎克雷伯菌作为免疫佐剂在动物灭活疫苗中的用途
【技术领域】
[0001] 本发明公开了灭活肺炎克雷伯菌作为免疫佐剂在动物灭活疫苗中的应用，用于提 高动物灭活疫苗的免疫效果，属于生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002] 肺炎克雷伯氏菌具有丰厚荚膜，其荚膜物质具有极强的免疫原性，法国罗素公司 已将其开发成口服免疫调节剂。
[0003] 大量实验证明，肺炎克雷伯菌荚膜糖蛋白能加速B淋巴细胞的增殖，增强巨噬细 胞的吞噬、消化、破坏抗原及其趋化作用，并能促进吞噬细胞白介素的产生，从而使T淋巴 细胞增殖。动物实验还证明肺炎克雷伯菌荚膜糖蛋白对细菌(绿脓杆菌、金葡菌、大肠杆菌、 肺炎链球菌、肺炎克雷伯菌、伤寒杆菌)、病毒(流感病毒、引起脑和心肌炎病变的病毒）和真 菌（白色念珠菌）的感染均具明显的保护作用。
[0004] 在充分的理论研究基础上，法国罗素公司将其开发成新型免疫调节剂一必思添， 临床上用于呼吸道感染的防治，并可用于溃疡和烧伤的治疗。国外关于肺炎克雷伯菌荚膜 糖蛋白的研究开展较早，主要集中在二十世纪70-80年代，报道最多的是有关肺炎克雷伯 菌荚膜糖蛋白免疫学活性方面的研究。
[0005] 据报道Kp荚膜多糖（CPS-K)对强抗原和弱抗原均有明显的佐剂作用。在相同 条件下，其作用强于胞壁酞肤(MDP)，与A1 (0Η) 3和脂质体相似，从而证明CPS-K具有免疫增 强剂的作用。有关Kp荚膜多糖的免疫原性和作为独立的免疫调节活性物质的研究已经有 报道。
[0006] 目前常用的疫苗佐剂，例如铝胶佐剂、油佐剂等，由于局部刺激强烈、诱导免疫应 答差等诸多缺点，限制了其应用。因此开发新一代高效、低毒、廉价的疫苗佐剂十分迫切。
【发明内容】
[0007] 本发明公开了灭活肺炎克雷伯菌作为免疫佐剂在动物灭活疫苗中的用途，提供了 灭活肺炎克雷伯菌的新用途，配以灭活疫苗预防动物疾病，预防免疫效果佳，安全性好。
[0008] 本发明提供灭活肺炎克雷伯菌作为免疫佐剂的制备方法，包括以下步骤： 1) 肺炎克雷伯菌菌株26分别按培养基体积的2%接种于培养基培养，调整菌数为100 亿CFU/mL ;500mL挡板瓶装液量16%，摇床转速在150r/min，37°C，增氧震荡培养8h ; 2) 用终浓度0. 3%的甲醛灭活步骤1所得肺炎克雷伯菌培养物，24°C灭活72h，期间振 摇5-8次； 3) 将肺炎克雷伯菌灭活培养物与动物灭活疫苗按照1:9比例混合； 4) 在步骤3所得培养物中添加防腐剂，即得所述含肺炎克雷伯菌免疫佐剂的灭活疫 苗；所述防腐剂为叠氮钠，优选终质量浓度为〇. 01 %。
[0009] 本发明所述肺炎克雷伯菌菌株26混合制成的灭活疫苗，其制备工艺简单，适合商 品化生产，具有良好的应用前景。
[0010] 本发明的积极效果在于：公开了灭活肺炎克雷伯菌在在作为免疫佐剂在动物灭活 疫苗中新的用途，灭活肺炎克雷伯菌菌液作为免疫成分，具有免疫增强剂作用，既可以诱导 机体产生针对肺炎克雷伯菌的抗体使机体免受克雷伯菌的感染，又可以起免疫调节活性提 高机体对疫苗应答水平，产生更好的免疫保护。
【专利附图】
【附图说明】
[0011] 图1为肺炎克雷伯菌菌株26的形态； 图2为肺炎克雷伯菌作为佐剂在水貂绿脓杆菌灭活疫苗中的应用； 图3为肺炎克雷伯菌作为佐剂在鸡大肠杆菌灭活疫苗中的应用； 图4为肺炎克雷伯菌作为佐剂在水貂病毒性肠炎灭活疫苗中的应用； 图5为小鼠腹腔巨噬细胞吞噬试验； 图6为淋巴细胞增殖试验。
【具体实施方式】
[0012] 通过以下实施例进一步举例描述本发明，并不以任何方式限制本发明，在不背离 本发明的技术解决方案的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改 动或改变都将落入本发明的权利要求范围之内。
[0013] 本发明涉及的肺炎克雷伯菌菌株26,购自中国农业科学院特产研究所(参见图 1)。
[0014] 用Reed-Muench法测定毒株对小白鼠的半数致死量LD5(I，菌株26对水貂的半数致 死量 LD5Q 为 8X106CFU。
[0015] 试验材料 发酵培养基配方（g/L):蔗糖40,胰蛋白胨20,酵母粉1，K2S04 1，MgS04 0. 25, ΚΗ2Ρ04 4， Na2HP04 3,121°C 灭菌 20min。
[0016] 绿脓杆菌分型用标准血清购自日本生研株式会社；肺炎克雷伯菌的分型采用PCR 分型方法进行；细菌鉴定微量生化反应管购自杭州天和微生物试剂公司；18~22g小白鼠购 自吉林正业生物制品有限公司；甲醛，叠氮钠购自北京化学试剂厂。
[0017] 实施例1 : 灭活免疫佐剂的制备 免疫佐剂制备：将菌株菌株26划线接种于培养基中于37°C培养18h，之后挑单菌落接 种于5mlNB肉汤培养基中37°C振摇12h作为一代种子液，再按1 %比例接种于300mlNB肉 汤中37°C振摇12h作为二代种子液，将二代种子液按2%比例接种于500mL的发酵液体培 养基37°C增氧培养8h，即为培养好的疫苗菌液，通过细菌平板计数对菌液进行计数，并通 过计数结果将菌数均调整为1〇〇亿CFU/mL，之后将菌液按甲醛终浓度为0. 3%灭活，24°C灭 活72h，期间震荡5-8次。将灭活后的肺炎克雷伯菌，按照1 :9的比例与灭活疫苗混合。
[0018] 免疫佐剂的灭活检验：将甲醛灭活后的菌液取200μ L接于5mL液体培养基中，一 次培养取3次样，每个样品接种于3个试管中观察5天进行灭活安全检验，5天后接种的液 体培养基仍澄清无混浊则安全检验合格。
[0019] 实施例2: 灭活肺炎克雷伯菌的安全检验 将实施例1制备好的三批佐剂单剂量、单剂量重复和超剂量注射健康小鼠，后肢内侧 肌肉接种。通过14d观察，接种小鼠体温和食欲正常，接种局部无肿胀和炎症，未出现局部 和全身反应；每批选择3只，剖杀后切开注射部位皮肤观察注射局部病理变化，小鼠接种部 位皮下无异常变化，后肢内侧肌肉接种部位肌肉组织正常，注射部位未见炎症反应。说明对 小鼠具有较好的安全性。
[0020] 实施例3 : 灭活肺炎克雷伯菌佐剂对水貂肺炎灭活疫苗的效力试验测定 将灭活肺炎克雷伯菌佐剂和20%铝胶佐剂分别按照1:9比例与水貂出血性肺炎灭活疫 苗混合后免疫45日龄断奶仔貂20只，lml/只，免疫后用实验室已经建立的间接ELISA方法 连续检测10周抗体的水平，绘制抗体消长规律(参见图2所示)。
[0021] 实施例4: 灭活肺炎克雷伯菌佐剂对鸡大肠杆菌灭活疫苗的效力试验测定 将灭活肺炎克雷伯菌佐剂和20%铝胶佐剂分别按照1:9比例与鸡大肠杆菌灭活疫苗混 合后免疫30日龄雏鸡20只，lml/只，免疫后用间接ELISA方法连续检测10周抗体的水平， 绘制抗体消长规律(参见图3所示)。
[0022] 实施例5 : 灭活肺炎克雷伯菌佐剂对水貂病毒性肠炎灭活疫苗的效力试验测定 将灭活肺炎克雷伯菌佐剂和20%铝胶佐剂分别按照1:9比例与水貂病毒性肠炎灭活疫 苗混合后免疫45日龄断奶仔貂20只，lml/只，免疫后用实验室已经建立的血凝抑制试验连 续检测10周抗体的水平，绘制抗体消长规律(参见图4所示)。
[0023] 实施例6 : 灭活肺炎克雷伯菌佐剂对小鼠非特异性免疫增强作用测定 进行免疫相关指标测定，包括小鼠腹腔巨噬细胞吞噬试验和脾脏淋巴细胞增殖实验， 如图5、6所示(注：PP.巨噬细胞吞噬率PI.巨噬细胞吞噬指数Vaccine.肺炎克雷伯菌佐剂 肠炎疫苗Control.铝胶佐剂肠炎疫苗）；将灭活肺炎克雷伯菌佐剂和20%铝胶佐剂分别按 照1:9比例与水貂病毒性肠炎灭活疫苗混合后免疫16~18g小白鼠20只，实验组和对照组 各10只，0. 2ml/只。免疫一周后采用常规方法测定小鼠腹腔巨噬细胞吞噬率和吞噬指数， 使用MTT法测定淋巴细胞增值实验。 本发明公开了肺炎克雷伯菌菌株26及用所述菌株制备的动物灭活疫苗及其制备方 法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有 类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本 发明的产品、方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发 明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应 用本发明技术。
【权利要求】
1. 灭活肺炎克雷伯菌作为免疫佐剂在动物灭活疫苗中的用途。
2. -种灭活肺炎克雷伯菌作为免疫佐剂的制备方法，包括以下步骤： 1) 肺炎克雷伯菌菌株26分别按培养基体积的2%接种于培养基培养，调整菌数为100 亿CFU/mL ;500mL挡板瓶装液量16%，摇床转速在150r/min，37°C，增氧震荡培养8h ; 2) 用终浓度0. 3%的甲醛灭活步骤1)所得肺炎克雷伯菌培养物，24°C灭活72h，期间振 摇5-8次； 3) 将肺炎克雷伯菌灭活培养物与动物灭活疫苗按照1:9比例混合； 4) 在步骤3)所得培养物中添加防腐剂，即得所述含肺炎克雷伯菌免疫佐剂的灭活疫 苗；所述防腐剂为叠氮钠，优选终质量浓度为〇. 01%。
【文档编号】A61K39/39GK104043122SQ201410280086
【公开日】2014年9月17日 申请日期:2014年6月23日 优先权日:2014年6月23日
【发明者】雷连成, 闫新武, 栾浩麟, 赵成新, 王金玲 申请人:吉林大学