一种甘草次酸衍生物及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种甘草次酸修饰的硬脂酸-聚乙二醇两亲性化合物及其制备方法和应用。本发明利用酰化反应对甘草次酸C3位的羟基进行保护，聚乙二醇一端的羟基和甘草次酸C30位羧基反应生成酯，而聚乙二醇的另一端的羟基则与硬脂酸反应生成酯，得到乙酰甘草次酸、聚乙二醇、硬脂酸共价键合的乙酰甘草次酸-聚乙二醇-硬脂酸。该化合物合成、纯化方法简单，能与常规磷脂、胆固醇等采用通用的方法形成脂质体，含有这种化合物的脂质体具有肝实质细胞主动靶向和长循环作用，可以作为各种药物或影像增强剂或示踪物质的载体，可用于肝脏疾病的诊断、治疗。
【专利说明】一种甘草次酸衍生物及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于医药领域，涉及一种肝靶向长循环脂质体及其制备方法和用途，具体 涉及一种两亲性甘草次酸衍生物的合成方法，以及含有这种衍生物的脂质体（liposome) 及其作为药物、生物活性物质、示踪物、诊断试剂或影像增强剂的肝靶向长循环载体的应 用。
【背景技术】
[0002] 我国是世界上肝脏疾病的高发区，癌症发病率处于世界前列，特别是肝癌、食道 癌和胃癌的发病率为世界第一。当前，据血清流行病学调查，我国人群的乙肝表面抗原 (HBsAg)携带率为10%，约1. 3亿人，其中1/4的人最终将发展为慢性肝病，包括慢性肝炎、 肝硬化和肝癌，丙肝病毒感染者也已超千万人。然而，面对如此庞大的患者人群，治疗现状 却不容乐观。肝脏的病变不仅危害肝脏，同时也会因代谢和解毒功能受损而影响心脏、大 脑、消化系统、内分泌和免疫力，引发各种心脑血管疾病和肿瘤，因此预防和治疗肝脏病变 对于人体极其重要。对于早期肝癌患者来说癌细胞并未扩散到淋巴结和身体的其它部位， 手术切除治疗是最为有效的治疗手段。然而肝癌的发病较隐匿，早期患者无明显症状，一旦 出现症状前往医院就诊时，其病程大多已进入中、晚期，错过了手术治疗的最佳时期。此时 即使手术切除，治疗成功率也仅为20%?30%。因此，实现肝癌的早期高灵敏检测是手术 治疗能否成功的关键因素。这对于显像学的发展提出了更高的要求。而对于肝炎、肝硬化 以及中晚期肝癌患者：非手术治疗，尤其是药物治疗就成为了综合治疗的重要手段之一。化 疗是目前除了手术治疗之外最主要的治疗方法。但传统的化疗方式是通过常规途径给药， 当达到一定的血药浓度后药物在全身分布，缺乏选择性，在杀伤癌细胞的同时还会对其它 正常脏器产生严重的毒副作用，不仅影响疗效也给病人带来巨大痛苦。由此可见传统治疗 方法滞后，治疗效果不好，不少治疗方法甚至是边治肝边伤肝，使肝病治疗陷入了一个久治 不愈、久药不果的怪圈。
[0003] 因此改变化疗的给药途径、变换药物剂型等各种各样的尝试势在必行，也从未间 断。靶向给药系统可以将药物运送到指定的靶器官或靶组织释放，与传统的化疗相比，可以 提高药物在靶部位的药理作用强度，明显降低药物毒副作用，提高治疗效果。
[0004] 随着对细胞表面结构功能认识的不断深入，近年来受体介导的肝靶向递送系统成 为研究热点。它是采用物理或化学的方法将特定的配基引入药物载体，通过配基与肝脏细 胞膜上的受体发生特异性相互作用，将药物、基因等化学物质选择性地输送至肝脏，提高负 载物在肝脏部位的浓度，延长其半衰期，从而达到减少用药剂量和给药次数，降低药物毒副 作用，减少对其它脏器的损伤，提高药效。
[0005] 纳米颗粒和细胞的相互作用包括细胞吞噬、被动靶向、主动靶向等。被动靶向指的 是载药微粒进入体内后，由于肿瘤与正常组织间血管密度及渗透性的差异或被巨噬细胞作 为外界异物吞噬的自然倾向而产生的体内分布特征。一般认为：被动靶向的微粒经静脉注 射后其在体内的分布首先取决于粒径的大小：小于l〇〇nm的纳米囊或纳米球可缓慢积集骨 髓；100?200nm的纳米粒子可富集于实体肿瘤部位；0. 2?0. 3 μ m的粒子一般被肝脾中的 巨噬细胞摄取；大于7 μ m的微粒通常被肺毛细血管床截留进入肺组织或肺气泡。
[0006] 肝脏拥有人体内数量最多的吞噬细胞--枯否细胞（KCs)，约占吞噬细胞总数的 80%。研究表明，具有以下特征的颗粒会被迅速清除，并在肝脾等器官累积，从而产生一定 被动靶向功效：①拥有较大的粒径（直径>200nm);②非球形颗粒；③表面具有较强疏水 性；④表面具有高密度电荷。由此可见，被动肝靶向给药体系主要依赖于体内的单核吞噬细 胞系统（MPS)。因此利用MPS的吞噬功能就成为了肝靶向给药的有效途径。尽管MPS靶向 对于治疗肝肿瘤具有一定的促进作用，但众所周知，恶性肝肿瘤往往发生在肝实质细胞，而 MPS会将大量药物聚集在枯否细胞中，这就造成大量药物无法直接作用于肿瘤部位，影响治 疗效果。因此开发肝实质细胞靶向给药系统就显得尤为重要（王蔚，袁直，"肝靶向纳米给 药系统的最新研究进展"，高分子通报，2013,1 :137?154)。
[0007] 主动靶向给药系统主要包括三个部分：靶向基团、载体以及药物。主动靶向给药就 是载体将药物通过局部给药或全身血液循环选择性地富集于靶器官、靶组织、靶细胞或细 胞内结构中。为了降低MPS系统对主动靶向效率的影响，首先应保证药物载体能逃离MPS 的吞噬，并实现在血液内的长效循环。因此，一般均需对纳米粒子表面进行亲水改性并控制 其粒径在100?200nm之间（亦有文献报道为50?150nm)。由于PEG具有高亲水性、高体 积排阻效应以及低毒性已经成为目前最常用的亲水改性试剂。
[0008] 脂质体作为一种抗肿瘤化疗药物的载体，也是最理想的非病毒基因载体，是一类 由两亲性分子（多为磷脂）形成的具有类似细胞膜双分子层结构的囊泡，可以将多种物质 (药物、核酸等）转运至动物、植物和微生物等多种类型的细胞中，使被包载物的生物学活 性不被破坏，而且还可以提高传递效率，因而在生物、化学、医药等领域得到广泛研究和应 用。脂质体本身具有被动靶向的性质，经静脉注射给药之后能选择性地分布于肝脏、脾脏、 骨髓等内皮网状系统（RES)丰富的组织器官中。但脂质体在肝脏中主要是被肝脏的非实 质细胞组织所内化吞噬入细胞内而吸收，只有少量能够被肝脏实质细胞所吸收。肝实质细 胞是肝脏中数量最多的细胞，约占肝脏总细胞数的60%?70%，有关肝的大多数病变如肝 癌、肝炎、肝硬化等多发生于此，是肝靶向给药系统理想的靶标之一，因此只有有效提高药 物对病灶组织的靶向性，才能提高载药脂质体在肝脏实质细胞中的吸收量，从而真正发挥 药效。
[0009] 肝实质细胞表面含有多种受体：如去唾液酸糖蛋白受体可以识别半乳糖乳糖等配 体，甘草酸、甘草次酸受体可以识别甘草酸以及甘草次酸等。利用这些受体配体间特异性的 相互作用，研究人员研发出一系列高效的肝靶向给药系统。目前已见报导的配基有去唾液 酸糖蛋白、乳糖酸、半乳糖化配体、无唾液酸胎球蛋白以及豆留醇糖苷等。其中去唾液酸糖 蛋白受体能专一识别末端带有半乳糖残基或乙酰半乳糖胺残基的寡糖或寡糖蛋白。胆酸是 胆汁的主要成分，在体内具有特殊的转运系统，可被肝脏特异性吸收。胆酸盐介导的肝靶向 给药系统是通过肝细胞膜上的Na+依赖性转运系统（NTCP)及Na+非依赖性转运系统（0ΑΤΡ) 来实现的，以胆酸为药物载体，不但能够实现药物的肝靶向性，减少毒副作用，还能够提高 药物的口服生物利用度。甘露糖受体是分子量为175000的跨膜蛋白，能与含有甘露糖配基 的物质特异性识别结合，广泛存在于肝细胞表面。此外研究比较多的还有透明质酸受体、胰 岛素受体等。与这些配体物质相比，能与甘草酸、甘草次酸受体特异性作用的甘草酸和甘草 次酸配体有着独特的优势。
[0010] 甘草是中国自古以来就应用广泛的一种重要传统中药，根据现代的甘草药理学、 体内代谢学研究可知，当甘草酸口服之后，经胃酸水解或者由肝脏中β-葡萄糖醛酸酶酶 解可以得到甘草酸类药物中主要发挥药力活性作用的五环三萜类化合物--甘草次酸，所 以甘草次酸是甘草中最终起作用的成分。甘草次酸来源于豆科植物甘草的根及根茎，廉 价易得，安全性高，具有多种药理活性，如抗炎、抗菌、抗肿瘤、抗溃疡、抗病毒性肝炎及保 肝护肝等。除了较强的治疗炎症的效果外，还具有激活免疫系统活性、抑制肿瘤细胞增殖 和转移、抗心律失常、抗病毒、提高内耳听力抗缺氧等多种治疗作用。研究表明，肝细胞表 面存在大量甘草次酸受体，甘草次酸对肝细胞有特异识别和吸附能力，与该位点的结合呈 可饱和性、高度特异性，能有效的发挥其在肝脏疾病中的治疗作用，目前在临床上较多的 用于慢性肝炎以及肝癌的治疗，例如甘草次酸修饰的纳米粒子用于肝靶向药物传递【ΤΙΑΝ Q, ZHANG C N, WANG X H, et al. ^Glycyrrhetinic acid-modified chitosan/poly (ethylene glycol)nanoparticles for liver-targeted deliver" [J]Biomaterials,2010,31(17)： 4748-4756】。
[0011] 近年来，已有有关表面经甘草次酸修饰的脂质体用于药物肝靶向的传输以 及治疗的报道【Mao SJ，Bi YQ，Jin H，et al. "Preparation，characterization and uptake by primary cultured rat hepatocytes of liposomes surface-modified with glycyrrhetinic acid，'.Die Pharmazie,2007,62 :614_619】。Chen ZP 等人【Chen ZP, Xiao L, Liu D, et al. "Synthesis of a novel polymer cholesterol-poly(ethylene glycol)2000-glycyrrhetinic acid(Choi-PEG-GA)and its application in brucine liposome"[J] · Journal of Applied Polymer Science, 2012,124 (6) :4554_4563】将胆固醇、 聚乙二醇和甘草次酸偶联以得到两亲性化合物Chol-PEG-GA，并将其用于制备甘草次酸修 饰的长循环脂质体（Chol-PEG-GA Liposome，CPGL)来包载二甲马钱子碱，再将该载药脂质 体静脉注射入小鼠体内进行组织分布研究，以传统脂质体为对照。实验结果显示，载药CPGL 脂质体的药时曲线下面积（Area Under Curve，AUC)以及平均驻留时间（Mean Retention Time，MRT)分别为传统脂质体的2. 31倍和2. 11倍；另外，使用甘草次酸修饰的载二甲马钱 子碱脂质体CPGL注射后，药物在小鼠肝脏组织中的浓度要比使用传统脂质体的小鼠肝脏 组织浓度高七倍左右，这表明甘草次酸修饰的长循环脂质体具有显著的肝靶向性和延长药 物释放时间的效果。
[0012] 中国专利CN200810156141. 7公开了甘草次酸前体脂质体及其制备方法，该专利 是将甘草次酸直接作为药物包载在脂质体脂双层中，并引入了聚乙二醇以起到长循环作 用。
[0013] 中国专利CN201010228799. 1公开了甘草次酸修饰磷脂和胆固醇作为脂质体膜 材使用，合成肝靶向脂质体、胶束和复合物的制法，期望达到肝靶向长循环的作用；但是该 专利可能存在的问题：一是在合成其中一个物质甘草次酸修饰聚乙二醇化胆固醇时，先将 甘草次酸与聚乙二醇反应而未对甘草次酸上的羟基进行保护，这样反应结束后两端都有 羟基，之后再与胆固醇反应，这样就存在以下两种可能：（1)反应可能生成胆固醇-甘草次 酸-聚乙二醇，甘草次酸的两端均被键连，这样作为膜材组成脂质体时，甘草次酸很可能 被埋在了脂双层中，很难真正起到肝靶向作用；（2)该反应也可能生成甘草次酸-聚乙二 醇-胆固醇，这个物质才能真正起到肝靶向作用。但是该专利中并没有具体说明制备肝靶 向脂质体所用的是哪一种化合物。二是该专利实施例5在制备脂质体时是先制备空白肝靶 向脂质体，然后再与绿荧光蛋白质粒溶液孵育，虽然脂质体具有一定的流动性，也很可能导 致大量质粒游离在脂质体之外，很多肝靶向脂质体还是空白脂质体，治疗效果会大打折扣。 实施例6中是先制备空白载基因脂质体，再加入甘草次酸修饰聚乙二醇化的胆固醇进行孵 育，以起到肝靶向作用，这同样存在甘草次酸修饰聚乙二醇化的胆固醇无法顺利嵌入脂双 层中的问题，很难真正合成肝靶向脂质体。
【发明内容】
[0014] 为了克服现有技术存在的不足，本发明采用甘草次酸作为肝实质细胞的靶向配 体，共价连接具有长循环作用的聚乙二醇，并在聚乙二醇另一端共价连接可以定位在脂双 层中的硬脂酸，制备一种两亲性甘草次酸衍生物一乙酰甘草次酸-聚乙二醇-硬脂酸 (aga-peg 2_-st)，含有该化合物的脂质体同时具备了肝实质细胞靶向和长循环作用，采用 常规的脂质体组分和制备方法可得到包载药物或造影剂、临床所用试剂的脂质体，可望应 用于临床。
[0015] 本发明的目的是合成一种经济、稳定、实用性强的肝靶向长循环脂质体分子构件， 以用作一系列亲疏水药物、基因、造影剂、示踪物、诊断试剂等的载体，由于采用本发明提供 的分子构件所制备的脂质体具有长循环肝靶向的性质，从而可以提高包载物对肝脏实质细 胞的靶向性，降低毒副作用，提高疗效。
[0016] 本发明利用酰化反应对甘草次酸C3位的羟基进行保护，聚乙二醇一端的羟基和 甘草次酸C30位羧基反应生成酯，而聚乙二醇的另一端的羟基则与硬脂酸反应生成酯。具 体地，首先，由甘草次酸（GA)与乙酰氯（摩尔比为1 :5?10)反应，以与甘草次酸1?2 倍摩尔量的碳酸钾或三乙胺作为缚酸剂，得到乙酰甘草次酸（AGA);接着乙酰甘草次酸在 脱水剂二环己基碳二亚胺（DCC)和催化剂二甲氨基吡啶（DMAP)的存在下，控制反应条件， 与聚乙二醇单端反应，得到乙酰甘草次酸-聚乙二醇；然后将硬脂酸用过量的二氯亚砜进 行酰氯化，产物纯化后，与乙酰甘草次酸-聚乙二醇进行反应，得到乙酰甘草次酸-聚乙二 醇-硬脂酸。
[0017] 本发明所提供的技术方案具体如下：
[0018] -种甘草次酸衍生物，具有式I所示的结构：
[0019]
【权利要求】
1. 一种甘草次酸衍生物，其特征在于，具有式I所示的结构：
2. -种制备权利要求1所述的甘草次酸衍生物的方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 乙酰甘草次酸的合成：将甘草次酸溶解在二氯甲烷中，然后加入缚酸剂，在冰浴条 件下缓慢滴加乙酰氯，然后室温搅拌反应8?24小时，反应结束后，纯化，即得到乙酰甘草 次酸；所述缚酸剂为碳酸钾或三乙胺，所述缚酸剂的摩尔量为甘草次酸的1?2倍，所述乙 酰氯的摩尔量为甘草次酸的5?10倍； (2) 乙酰甘草次酸-聚乙二醇的合成：将步骤（1)中得到的乙酰甘草次酸溶解在二氯 甲烷中，制备乙酰甘草次酸的二氯甲烷溶液；同时将聚乙二醇、二环己基碳二亚胺、二甲氨 基吡啶溶解在二氯甲烷中，边搅拌边缓慢滴加到乙酰甘草次酸的二氯甲烷溶液中，搅拌回 流18?30小时，反应结束后，纯化，即得到乙酰甘草次酸-聚乙二醇；其中，所述聚乙二醇 的摩尔量为乙酰甘草次酸的1?1. 25倍，所述二环己基碳二亚胺的摩尔量为乙酰甘草次酸 的1?1. 2倍，所述二甲氨基吡啶的摩尔量为乙酰甘草次酸的0. 02?0. 1倍； (3) 乙酰甘草次酸-聚乙二醇-硬脂酸的合成：向硬脂酰氯中加入二氯甲烷、二甲氨基 吡啶、三乙胺；同时将乙酰甘草次酸-聚乙二醇溶解在二氯甲烷中，冰浴条件下缓慢滴加入 烧瓶，搅拌回流18?30小时，纯化，干燥，即得到上述甘草次酸衍生物；所述硬脂酰氯的摩 尔量为乙酰甘草次酸-聚乙二醇的1?2倍，所述三乙胺的摩尔量为乙酰甘草次酸-聚乙 二醇的1?2倍，所述二甲氨基吡啶的摩尔量为乙酰甘草次酸-聚乙二醇摩尔量的0. 02? 〇· 1 倍。
3. 根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤（2)所述聚乙二醇的摩尔量为 乙酰甘草次酸的1.25倍。
4. 根据权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于：步骤（2)所述的搅拌回流时间 为24小时。
5. 根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤（3)所述硬脂酰氯的摩尔量为 乙酰甘草次酸-聚乙二醇的2倍。
6. 根据权利要求2或5所述的制备方法，其特征在于：步骤（3)所述的搅拌回流时间 为24小时。
7. 权利要求1所述的甘草次酸衍生物在制备甘草次酸受体介导的肝靶向脂质体中的 应用。
【文档编号】A61K48/00GK104045823SQ201410298103
【公开日】2014年9月17日 申请日期:2014年6月26日 优先权日:2014年6月26日
【发明者】刘芝兰, 张留杰, 黄世文, 马毅慧, 匡映, 刘佳, 杜丽娜, 卓仁禧 申请人:武汉大学