靶向抑制肺癌细胞的基因药物及其制备方法
【专利摘要】本发明提供一种靶向抑制肺癌细胞的基因药物，其是由纳米脂质体及其包被的以突变型BiK(BikDD)为目的基因的T-VISA高效特异性真核表达载体(T-VISA-BikDD)两部分组成。本发明的纳米脂质体具有低毒、转染效率高、使用方便等优点，包裹基因治疗质粒T-VISA-BikDD后，能高度靶向癌细胞并高效表达目的基因，抑制癌细胞生长，毒副作用低。可用于治疗包括但不限于肺癌。
【专利说明】靶向抑制肺癌细胞的基因药物及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程及医药生物领域，具体地说，涉及一种靶向抑制肺癌细胞的 基因药物及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 肺癌（Lung cancer)，是一种源于支气管黏膜或腺体的恶性肿瘤。目前，肺癌是 世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，在多数发达国家位列癌症死因首位，在我国肺癌也是 发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，其中超过80%为非小细胞肺癌（Non-small Cell Lung Cancer，NSCLC)，5年存活率不超过10%。传统治疗方法副作用大，患者的中位存活期 (Median Survival Time)不到1年。对于晚期NSCLC患者，无论是放疗或综合治疗，虽然取 得了一定的治疗效果，但就其疗效及生存率而言，远不能令人满意。因此，迫切需要探索高 效靶向杀灭肺癌细胞的新型药物。
[0003] 随着分子生物学技术的发展和完善，以及对肺癌发病机制等认识的日益深化，基 因治疗作为一种高效性、特异性、靶向性强的治疗方法，越来越受到重视，已成为继放化疗 和手术治疗之后极有发展前景的治疗方法。但目前基因治疗存在基因表达效率低，靶向 性差的缺点。申请号：201210063812. 1和201210064390. X中公开一种以人端粒酶逆转 录酶基因（hTERT)肿瘤特异性启动子，高效靶向肿瘤细胞载体T-VISA(VP16-GAL4-WPRE integrated systemic amplifier, VISA)，并与多个抑癌基因或促凋亡基因（如BikDD、 PEA15、miR34等）结合，在高特异性灭杀乳腺癌、前列腺癌及肺癌等体内外实验中均取得良 好的效果。
[0004] 脂质体作为新型基因药物输送载体具有许多优点，当药物被脂质体包裹后，可降 低药物毒性，减少药物用量，可进行靶向给药，提高药物疗效。目前市面上商品化的脂质体 多为普通脂质体，在某些肿瘤细胞或正常细胞中基本无转染效率，更无法应用于动物体内 做转染研究，而且作为载体，目前使用的脂质体靶向分布不理想，稳定性较差。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种高效特异靶向抑制肺癌细胞的基因治疗药物，可全身给 药，效率高，药效确切，毒副作用低，能特异杀灭肺癌细胞。
[0006] 本发明的另一目的是提供上述基因药物的制备方法。
[0007] 为了实现本发明目的，本发明的一种靶向抑制肺癌细胞的基因药物，所述基因药 物为纳米脂质体包裹的质粒T-VISA-BikDD。
[0008] 其中，质粒T-VISA-BikDD的核苷酸序列如Seq ID No. 1所示，或Seq ID No. 1所示 的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白的核苷酸序 列。
[0009] 所述纳米脂质体的制备方法为：将氨基甲酰基胆固醇与磷脂酰乙醇胺按1:2的 摩尔比混合，加入有机溶剂溶解，使氨基甲酰基胆固醇的浓度为1. 18mg/mL，将上述溶液置 于旋转烧瓶中，在60°C水浴中旋转蒸发，得到一层附着于烧瓶内壁上的脂膜；然后加入双 蒸水，使氨基甲酰基胆固醇与磷脂酰乙醇胺的摩尔浓度为20mM/L，所得溶液经超声处理 5min (采用200w超声波细胞破碎仪，超声5s，间歇5s)，依次通过0· 45 μ m、0. 22 μ m的滤膜， 收集通过0. 22 μ m的聚碳酸酯膜滤膜的滤液即得纳米脂质体。可将所述纳米脂质体放入洁 净的离心管中，用氮气充填离心管，将脂质体存放于离心管中，置于4°C避光保存。
[0010] 其中，纳米脂质体的平均粒径为l〇〇nm，所述有机溶剂为氯仿与甲醇按等体积比混 合配制。所制备的纳米脂质体可体内外高效低毒转染质粒，稳定性好，并具有高效肿瘤靶向 的特性，可发挥显著的抗肿瘤作用，用于治疗肝癌、肺癌、胃癌等，应用前景广阔。
[0011] 本发明靶向抑制肺癌细胞的基因药物的粒径约为150-300nm。平均粒径约为 244nm〇
[0012] 本发明还提供所述基因药物的制备方法，将纳米脂质体加入到注射用水中，得到 的纳米脂质体溶液中脂质体的浓度为8mM，另将T-VISA-BikDD质粒加入到注射用水中使质 粒浓度为〇. 6 μ g/ μ 1，然后将纳米脂质体溶液和T-VISA-BikDD质粒溶液混合静置20min， 即得。
[0013] 本发明采用薄膜分散法制备的纳米脂质体，平均直径约为l〇〇nm，容许其穿透极细 的毛细血管并被细胞摄取。将该纳米脂质体与基因治疗质粒T-VISA-BikDD结合，可达到靶 向分布理想、1?效、低毒、稳定性好等目的，为临床提供一种1?效1?特异抑制肿瘤的基因药 物。
[0014] 通过细胞及动物体内药效学实验证明，本发明的靶向抑制肺癌细胞的基因药物具 有显著的抑制癌细胞生长的作用。在体外能高效杀灭一般肺腺癌细胞系（如H1299、H1975、 H1437、H322、A549等），在裸鼠动物模型中可抑制肺腺癌细胞H1299的生长，延长裸鼠的生 存时间，对裸鼠行为无明显影响，无死亡发生。
[0015] 本发明提供的包裹T-VISA-BikDD质粒的纳米脂质体基因药物，利用氨基甲酰基 胆固醇与磷脂酰乙醇胺按1:2的摩尔比作为制备脂质体的主要材料，同时利用超声波仪处 理，得到合适粒径的空白纳米脂质体。该纳米脂质体粒径适当，平均粒径约为l〇〇nm，容许其 穿透极细的毛细血管并被细胞摄取。脂质体包裹基因或质粒后，平均粒径约为244nm，在体 夕卜，可安全高效转染各种细胞；在体内，易穿过肿瘤毛细血管壁，可在肿瘤部位聚集靶向肿 瘤细胞，使其产生高效转染并产生抗肿瘤效应。另外，本发明采用薄膜分散法制备纳米脂质 体，适合工业化大生产。
[0016] 本发明的高效特异靶向抑制肺癌细胞的基因药物，其是由纳米脂质体及其包被的 以突变型BiK(BikDD)为目的基因的T-VISA高效特异性真核表达载体（T-VISA-BikDD)两 部分组成。本发明的纳米脂质体具有低毒、转染效率高、使用方便等优点，包裹基因治疗质 粒T-VISA-BikDD后，能高度靶向癌细胞并高效表达目的基因，抑制癌细胞生长，毒副作用 低。可用于治疗包括但不限于肺癌。
【专利附图】
【附图说明】
[0017] 图1为本发明实施例1中通过动态光散射测得的纳米脂质体的粒径及其分布，其 中脂质体即指空白纳米脂质体，TV-BiKDD脂质体是指纳米脂质体包裹了 T-VISA-BiKDD质 粒。
[0018] 图2为本发明实施例2中肺癌细胞H1975和H1299转染三种质粒48h各组细胞死 亡率。
[0019] 图3为本发明实施例2中肺癌细胞H1975和H1299转染不同浓度T-VISA-BikDD 质粒48h各组细胞死亡率。
[0020] 图4为本发明实施例2中T-VISA-BikDD脂质体不同转染时间对肿瘤细胞的杀伤 作用。
[0021] 图5-图7为本发明实施例3中活体成像仪动态观察裸鼠靶基因 Luciferase表达 结果；其中，A:5d，B: 14d，C:20d，D:26d，图5是模型组，图6是低剂量组，图7是高剂量组；模 型组表示只尾静脉给予注射用水的空白对照；低剂量组表示T-VISA-BIKDD剂量为15 μ g/ 只，高剂量组表示T-VISA-BIKDD剂量为30 μ g/只。
[0022] 图8为本发明实施例3中T-VISA-BikDD脂质体在动物模型中抑制肺癌生长的示 意图；其中，模型组表示只尾静脉给予注射用水的空白对照；低剂量组表示T-VISA-BIKDD 剂量为15 μ g/只；高剂量组表示T-VISA-BIKDD剂量为30 μ g/只。
[0023] 图9为本发明实施例3中给予不同处理的肺癌原位裸鼠模型的生存曲线示 意图；其中，模型组表示尾静脉给予注射用水的空白对照；T-VISA-BIKDD治疗组表示 T-VISA-BIKDD 剂量为 15 μ g/ 只。
【具体实施方式】
[0024] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例 中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
[0025] 实施例1高效特异靶向抑制肺癌细胞的基因药物及其制备方法
[0026] 高效特异靶向抑制肺癌细胞的基因药物，其制备方法如下：
[0027](一）纳米脂质体的制备
[0028] 1、从4°C冰箱中取出3β[Ν_(Ν'，N'-二甲基氨基乙基）]氨甲酰基-胆固醇 (DC-CH0L)与二油酰基磷脂酰乙醇胺（DOPE)，恢复至室温，水浴加热旋转蒸发仪至60°C。
[0029] 2、称取 33mg DC-CH0L 和 99mg DOPE，放入 250mL 圆底烧瓶中。
[0030] 3、向圆底烧瓶中加入14mL氯仿和14mL甲醇。
[0031] 4、旋转烧瓶，使其充分混合。
[0032] 5、打开真空泵，在60°C的水浴中旋转蒸发1.2h，充分除尽有机溶剂，并在烧瓶壁 上形成一层脂质薄膜。
[0033] 6、用封口膜封住瓶口，将圆底烧瓶置于真空干燥器中，室温下过夜，避光。
[0034] 7、向圆底烧瓶中，加双蒸水8.8mL。室温放置15min。
[0035] 8、在水浴超声波清洗器（200w)中对圆底烧瓶进行超声处理5min，再使用超声波 细胞破碎仪（200w)超声5min (超声5s，间歇5s)。
[0036] 9、将所制得的脂质体依次通过0. 45 μ m和0. 22 μ m的滤膜，最后将脂质体放入洁 净的离心管中，即得新型纳米脂质体。
[0037] 10、用氮气充填离心管10s，可将上述制备的新型纳米脂质体存放于离心管中，置 于4°C避光保存备用（防止空气进入）。
[0038] (二）脂质体包被质粒T-VISA-BikDD
[0039] 实验开始前将实验所用试剂（纳米脂质体、质粒溶液、PBS)在室温放置不少于15 分钟；取浓度为1 μ g/ μ 1的T-VISA-BikDD质粒溶液60 μ 1 (含有60 μ g的T-VISA-BikDD 质粒）加入装有40 μ 1 PBS溶液的小离心管中，用移液枪头轻轻吹打3次，混匀，得到100 μ 1 浓度为〇. 6 μ g/μ 1的T-VISA-BikDD质粒溶液；迅速将100 μ 1稀释后的质粒溶液加入到 100 μ 1浓度为8mM的纳米脂质体中（用1. 5ml小离心管保存），用移液枪头轻轻吹打3次， 混匀，得到200 μ 1的T-VISA-BikDD质粒-纳米脂质体混合液（其中含有T-VISA-BikDD质 粒60 μ g，浓度为0. 3 μ g/ μ 1)，混合液室温放置20min，即得。
[0040] 最后，经动态光散射检测，纳米脂质体包裹质粒后的粒径为150nm-300nm，结果如 图1所示。
[0041] 实施例2靶向抑制肺癌细胞的基因药物的体外细胞药效实验
[0042] (一）转染肺癌细胞H1975和H1299实验
[0043] 1、分组与质粒用量：pGL-3空载体组、CMV-BIKDD质粒组和T-VISA-BikDD质粒组。 每组4个复孔；质粒用量均为0. 8 μ g，转染时间为48h。
[0044] 2、待转染细胞株!11975和!11299按常规方法培养于含10%新生小牛血清的 RPMI1640培养基中，转染前24h时用胰酶消化贴壁细胞，重悬于含血清的RPMI1640培养液， 按4X 104个细胞/孔转种于24孔培养板中，待细胞生长达70%融合度进行转染实验。
[0045] 3、新型纳米脂质体、pGL-3、CMV-BIKDD和T-VISA-BikDD质粒等试剂于室温放置 15-20min，肉眼可见溶液呈均匀浑浊状但无沉淀。按一定比例混合纳米脂质体和质粒（脂 质体原浓度为8mM,推荐比例为脂质体（μ 1):质粒（μ g) = 1. 0-2. 5:1)。标记管1 :加入 0· 8 μ g质粒DNA到50 μ 1无血清培养基中混匀，室温放置5min ;标记管2 :加入1 μ 18mM脂 质体到50 μ 1无血清培养基中混匀，室温放置5min。迅速将管1中的液体加入到管2,上下 吹打2次后，室温下静置20min。
[0046] 4、将培养板中的完全培养基去掉，加入400μ 1无血清培养基，然后加入100μ 1质 粒-脂质体混合液至孔中。37 °C，5 % C02孵育4-6小时后，将培养基换成有血清培养基，继续 培养并于转染48h后使用MTT法计算各组细胞死亡率。结果见图2。与空载pGL-3质粒组相 t匕，CMV-BIKDD质粒组和T-VISA-BikDD (即TV-BikDD)质粒组对两株肺癌细胞H1975\H1299 的诱导凋亡作用较为显著，P〈〇. 05。
[0047] (二）不同剂量（0· 4 μ g、0. 8 μ g、l. 6 μ g)T-VISA-BikDD质粒对肿瘤细胞的杀伤作 用比较
[0048] 1、分组与质粒用量：高剂量组1. 6 μ g T-VISA-BikDD质粒、中剂量组0. 8 μ g T-VISA-BikDD质粒、低剂量组0. 4μ g T-VISA-BikDD质粒。每组4个复孔；转染时间为48h。
[0049] 2、同实验（一）中步骤2?4方法进行待转染细胞株H1975和H1299培养、质 粒-脂质体复合物的制备和转染。由图3可知，T-VISA-BIKDD质粒对肺癌细胞H1975和 H1299具有不同程度的杀伤作用，且存在一定的剂量依赖关系，最佳质粒用量为0. 8 μ g。
[0050] (三）T-VISA-BikDD脂质体不同转染时间对肿瘤细胞的杀伤作用比较
[0051] 1、分组与质粒用量：根据转染时间不同分为24h、48h、72h三组，每组4个复孔，质 粒用量均为0.8 μ g。
[0052] 2、同实验（一）中步骤2?4方法进行待转染细胞株H1975和H1299培养、质 粒-脂质体复合物的制备和转染。由图4可知，T-VISA-BIKDD质粒对肺癌细胞H1975和 H1299杀伤作用存在一定的时间依赖关系，48h达到最高。
[0053] 实施例3 T-VISA-BikDD脂质体的体内动物药效实验 [0054] 1、肺癌细胞培养
[0055] 带荧光素酶（Luciferase)基因的肺癌细胞株H1299,按照常规的方法进行复苏培 养，待细胞密度达到70-80%时，用台盼蓝试验证实细胞活性>90%，进行下一步实验。
[0056] 2、裸鼠肺癌原位模型的的建立
[0057] 取雌性BALB/c裸鼠，5-6周龄，适应性饲养1周后，用1% (10mg/ml)的戊巴比妥钠 (55mg/kg)腹腔注射麻醉裸鼠，将裸鼠置于右侧卧位，四肢适当固定。消毒左侧胸壁皮肤，采 用经皮穿刺的方式，用lml的一次性注射器将0. lml细胞浓度为IX 106/0. lml的肺癌细胞 悬液注射入裸鼠的左侧肺部，注射过程中注意控制刺入针头的深度。整个操作过程在细胞 收集后1个小时内完成，严格遵守无菌原则。
[0058] 肺癌裸鼠模型建立后，裸鼠继续饲养，每天观察裸鼠的生长状态，每周称量2次体 重。在注射肺癌细胞悬液后的第4天，用1%的戊巴比妥钠（55mg/kg)腹腔注射麻醉肺癌 原位模型组裸鼠，然后腹腔注射1〇〇μ 1的D-luciferin溶液（含有D-luciferin2-3mg)， 10-15min后置于小动物活体成像仪下检测裸鼠肺部的荧光强度以确定模型是否成功。
[0059] 3、确定为肺癌原位模型的裸鼠随机分为三组，每组数量10只。第一组为模型组， 不加药，尾静脉给予注射用水；第二组为低剂量组，每只尾静脉注射含15 μ g T-VISA-BikDD 质粒的脂质体；第三组为高剂量组，每只尾静脉注射含30 μ g T-VISA-BikDD质粒的脂质体。 每周给药2次，每次注射间隔不少于3天，共6次。
[0060] 4、结果：T-VISA-BikDD脂质体在动物模型中可抑制肺癌生长
[0061] 在Balb/c裸鼠中原位接种肺癌H1299细胞（H1299-luc细胞系，稳定表达 luciferase蛋白），5天后，通过尾静脉注射T-VISA-BikDD脂质体，每周两次，连续三周，用 Xenogen IVIS活体成像仪动态观察靶基因 Luciferase表达（结果见图5-7)，通过活体成 像监测肿瘤生物信号强弱动态观察肿瘤发生发展和生存时间（结果见图8和图9)。结果表 明，T-VISA-BikDD有效抑制肿瘤的生长，并延长小鼠生存时间。
[〇〇62] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在 本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。 〈110>广州市军科泰特医药科技有限公司 〈120>靶向抑制肺癌细胞的基因药物及其制备方法 <160> 1 <170> Patentln version 3. 3 <210> 1 <211> 7412 <212> DNA 〈213> 质粒（T-VISA-BikDD) <400> 1 agcgcccaat acgcaaaccg cctctccccg cgcgttggcc gattcattaa tgcagctggc 60 acgacaggtt tcccgactgg aaagcgggca gtgagcgcaa cgcaattaat gtgagttagc 120 tcactcatta ggcaccccag gctttacact ttatgcttcc gcggctcgta tgttgtgtgg 180 aattgtgagc ggataacaat ttcacacagg aaacagctat gaccatgatt acgccactag 240 tccgaggcct cgagatctat cgatgcatgc catggtaccc gggagctcga attcgaagct 300 tctgcagacg cgtcgacgga tccttatcga ttttaccaca tttgtagagg ttttacttgc 360 tttaaaaaac ctcccacacc tccccctgaa cctgaaacat aaaatgaatg caattgttgt 420 tgttaacttg tttattgcag cttataatgg ttacaaataa agcaatagca tcacaaattt 480 cacaaataaa gcattttttt cactgcattc tagttgtggt ttgtccaaac tcatcaatgt 540 atcttatcat gtctgctcga agcggccggc cgccccgact ctagtcgagc ccgtaccgag 600 ctcgaattcc aggcggggag gcggcccaaa gggagatccg actcgtctga gggcgaaggc 660 gaagacgcgg aagaggccgc agagccggca gcaggccgcg ggaaggaagg tccgctggat 720 tgagggccga agggacgtag cagaaggacg tcccgcgcag aatccaggtg gcaacacagg 780 cgagcagcca tggaaaggac gtcagcttcc ccgacaacac cacggaattg tcagtgccca 840 acagccgagc ccctgtccag cagcgggcaa ggcaggcggc gatgagttcc gccgtggcaa 900 tagggagggg gaaagcgaaa gtcccggaaa ggagctgaca ggtggtggca atgccccaac 960 cagtgggggt tgcgtcagca aacacagtgc acaccacgcc acgttgcctg acaacgggcc 1020 acaactcctc ataaagagac agcaaccagg atttatacaa ggaggagaaa atgaaagcca 1080 tacgggaagc aatagcatga tacaaaggca ttaaagcagc gtatccacat agcgtaaaag 1140 gagcaacata gttaagaata ccagtcaatc tttcacaaat tttgtaatcc agaggttgat 1200 tgtcgagggc tagatctgca gaattcggct ttcacttgag cagcaggtgc aggcccccgc 1260 tgagcagcgg cagcagcagc gccagcagca gcagcagcgc cagcagcacc tgttcgcagg 1320 acacccagga cccggggttc ggggatctcc agaacctcat tatgttctcc ttaagtgtgg 1380 tgaaaccgtc catgaaactt ctaagaacat ccctgatgtc ctcagtctgg tcgtagatga 1440 aagccagacc caggctgtgc atggccacct cggagagctg ggccaggcgc ggggccctga 1500 ggctcacgtc catctcgtcc ccgatgcagg ccagccgcag ggccaatgcg tcactgccct 1560 ccatgcattc caaagaatcg aagtcctcca tagggtccag gtcctcttca tcgtcatcca 1620 tgccaagaac ctccatggtc gggggttcca ggagctgctc atacaggagg gtctccatca 1680 agatgtctct ggagaggggt cttacttcag acatggtggc aattccagca cactggcggc 1740 cgttactagt ggatctcgag acaccactcg acacggcacc agctcaatca gtcacagtgt 1800 aaaaaagggc caagtgcaga gcgagtatat ataggactgg ggatcctcta gagtcggagt 1860 actgtcctcc gagcggagta ctgtcctccg agcggagtac tgtcctccga gcggagtact 1920 gtcctccgag cggagtactg tcctccggac ctgcaggcat gcaagcttgt attctatagt 1980 gtcacctaaa tgagctcggt acctatcgat agagaaatgt tctggcacct gcacttgcac 2040 tggggacagc ctattttgct agtttgtttt gtttcgtttt gttttgatgg agagcgtatg 2100 ttagtactat cgattcacac aaaaaaccaa cacacagatg taatgaaaat aaagatattt 2160 tattgcggcc ggccgctcta gaaatctagc tgatatagtg tggctcaaaa ccttcagcac 2220 aaatcacacc gttagactat ctggtgtggc ccaaaccttc aggtgaacaa agggactcta 2280 atctggcagg atattccaaa gcattagaga tgacctcttg caaagaaaaa gaaatggaaa 2340 agaaaaagaa agaaaggaaa aaaaaaaaaa aaaagagatg acctctcagg ctctgagggg 2400 aaacgcctga ggtctttgag caaggtcagt cctctgttgc acagtctccc tcacagggtc 2460 attgtgacga tcaaatgtgg tcacgtgtat gaggcaccag cacatgcctg gctctgggga 2520 gtgccgtgta agtgtatgct tgcactgctg aatgcttggg atgtgtcagg gattatcttc 2580 agcacttaca gatgctcatc tcatcctcac agcatcacta tgggatgggt attactggcc 2640 tcatttgatg gagaaagtgg ctgtggctca gaaagggggg accactagac cagggacact 2700 ctggatgctg gggactccag agaccatgac cactcaccaa ctgcagagaa attaattgtg 2760 gcctgatgtc cctgtcctgg agagggtgga ggtggacctt cactaacctc ctaccttgac 2820 cctctctttt agggctcttt ctgacctcca ccatgatact aggaccccat tgtattctgt 2880 accctcttga ctctatgacc cccactgccc actgcatcca gctgggtccc ctcctatctc 2940 tattcccagc tgggtaccga gctcggatcc actagtaacg gccgccagtg tgctggaatt 3000 cgcccttata tctagaggcc cctccctcgg gttaccccac agcctaggcc gattcgacct 3060 ctctccgctg gggccctcgc tggcgtccct gcaccctggg agcgcgagcg gcgcgcgggc 3120 ggggaagcgc ggcccagacc cccgggtccg cccggagcag ctgcgctgtc ggggccaggc 3180 cgggctccca gtggattcgc gggcacagac gcccaggacc gcgctcccca cgtggcggag 3240 ggactgggga cccgggcacc cgtcctgccc cttcaccttc cagctccgcc tcctccgcgc 3300 ggaccccgcc ccgtcccgac ccctcccggg tccccggccc agccccctcc gggcctccca 3360 gcccccccct ttcctttccg cggccccgcc ctctcctcgc ggcgcgagtt tcaggcagcg 3420 ctgcgtcctg ctgcgcacgt ggggcggccc tagcctcctg aaagatgaag ctactgtctt 3480 ctatcgaaca agcatgcgat atttgccgac ttaaaaagct caagtgctcc aaagaaaaac 3540 cgaagtgcgc caagtgtctg aagaacaact gggagtgtcg ctactctccc aaaaccaaaa 3600 ggtctccgct gactagggca catctgacag aagtggaatc aaggctagaa agactggaac 3660 agctatttct actgattttt cctcgagaag accttgacat gattttgaaa atggattctt 3720 tacaggatat aaaagcattg ttaacaggat tatttgtaca agataatgtg aataaagatg 3780 ccgtcacaga tagattggct tcagtggaga ctgatatgcc tctaacattg agacagcata 3840 gaataagtgc gacatcatca tcggaagaga gtagtaacaa aggtcaaaga cagttgactg 3900 tatcgccgga attcctgcag cccgggggat ccgccccccc gaccgatgtc agcctggggg 3960 acgagctcca cttagacggc gaggacgtgg cgatggcgca tgccgacgcg ctagacgatt 4020 tcgatctgga catgttgggg gacggggatt ccccgggtcc gagatccgcc cccccgaccg 4080 atgtcagcct gggggacgag ctccacttag acggcgagga cgtggcgatg gcgcatgccg 4140 acgcgctaga cgatttcgat ctggacatgt tgggggacgg ggattccccg ggtccgagat 4200 cctctagaaa tgtcgatcga cagcttggga tctttgtgaa ggaaccttac ttctgtggtg 4260 tgacataatt ggacaaacta cctacagaga tttaaagctc taaggtaaat ataaaatttt 4320 taagtgtata atgtgttaaa ctactgattc taattgtttg tgtattttaa attcacagtc 4380 ccaaggctca tttcaggccc ctcagtcctc acagtctgtt catgatcata atcagccata 4440 ccacatttgt agaggtttta cttgctttaa aaaacctccc acacctcccc ctgaacctga 4500 aacataaaat gaatgcaatt gttgttgtta acttgtttat tgcagcttat aatggttaca 4560 aataaagcaa tagcatcaca aatttcacaa ataaagcatt tttttcactg cattctagtt 4620 gtggtttgtc caaactcatc aatgtatctt atcatgtctg gatcgcggcc gctctagaac 4680 tagtggatcg atccccaatt cgccctatag tgagtcgtat tacaattcac tggccgtcgt 4740 tttacaacgt cgtgactggg aaaaccctgg cgttacccaa cttaatcgcc ttgcagcaca 4800 tccccctttc gccagctggc gtaatagcga agaggcccgc accgatcgcc cttcccaaca 4860 gttgcgcagc ctgaatggcg aatggcgcct gatgcggtat tttctcctta cgcatctgtg 4920 cggtatttca caccgcatac gtcaaagcaa ccatagtacg cgccctgtag cggcgcatta 4980 agcgcggcgg gtgtggtggt tacgcgcagc gtgaccgcta cacttgccag cgccttagcg 5040 cccgctcctt tcgctttctt cccttccttt ctcgccacgt tcgccggctt tccccgtcaa 5100 gctctaaatc ggggtgggcc atcgccctga tagacggttt ttcgcccttt gacgttggag 5160 tccacgttct ttaatagtgg actcttgttc caaactggaa caacactcaa ctctatctcg 5220 ggctattctt ttgatttata agggattttg ccgatttcgg tctattggtt aaaaaatgag 5280 ctgatttaac aaaaatttaa cgcgaatttt aacaaaatat taacgtttac aattttatgg 5340 tgcactctca gtacaatctg ctctgatgcc gcatagttaa gccagccccg acacccgcca 5400 acacccgctg acgcgccctg acgggcttgt ctgctcccgg catccgctta cagacaagct 5460 gtgaccgtct ccgggagctg catgtgtcag aggttttcac cgtcatcacc gaaacgcgcg 5520 agacgaaagg gcctcgtgat acgcctattt ttataggtta atgtcatggg gggggggggg 5580 aaagccacgt tgtgtctcaa aatctctgat gttacattgc acaagataaa aatatatcat 5640 catgaacaat aaaactgtct gcttacataa acagtaatac aaggggtgtt atgagccata 5700 ttcaacggga aacgtcgagg ccgcgattaa attccaacat ggatgctgat ttatatgggt 5760 ataaatgggc tcgcgataat gtcgggcaat caggtgcgac aatctatcgc ttgtatggga 5820 agcccgatgc gccagagttg tttctgaaac atggcaaagg tagcgttgcc aatgatgtta 5880 cagatgagat ggtcagacta aactggctga cggaatttat gcctcttccg accatcaagc 5940 attttatccg tactcctgat gatgcatggt tactcaccac tgcgatcccc ggaaaaacag 6000 cattccaggt attagaagaa tatcctgatt caggtgaaaa tattgttgat gcgctggcag 6060 tgttcctgcg ccggttgcat tcgattcctg tttgtaattg tccttttaac agcgatcgcg 6120 tatttcgtct cgctcaggcg caatcacgaa tgaataacgg tttggttgat gcgagtgatt 6180 ttgatgacga gcgtaatggc tggcctgttg aacaagtctg gaaagaaatg cataaacttt 6240 tgccattctc accggattca gtcgtcactc atggtgattt ctcacttgat aaccttattt 6300 ttgacgaggg gaaattaata ggttgtattg atgttggacg agtcggaatc gcagaccgat 6360 accaggatct tgccatccta tggaactgcc tcggtgagtt ttctccttca ttacagaaac 6420 ggctttttca aaaatatggt attgataatc ctgatatgaa taaattgcag tttcatttga 6480 tgctcgatga gtttttctaa tcagaattgg ttaattggtt gtaacactgg cagagcatta 6540 cgctgacttg acgggacggc gcaagctcat gaccaaaatc ccttaacgtg agttttcgtt 6600 ccactgagcg tcagaccccg tagaaaagat caaaggatct tcttgagatc ctttttttct 6660 gcgcgtaatc tgctgcttgc aaacaaaaaa accaccgcta ccagcggtgg tttgtttgcc 6720 ggatcaagag ctaccaactc tttttccgaa ggtaactggc ttcagcagag cgcagatacc 6780 aaatactgtt cttctagtgt agccgtagtt aggccaccac ttcaagaact ctgtagcacc 6840 gcctacatac ctcgctctgc taatcctgtt accagtggct gctgccagtg gcgataagtc 6900 gtgtcttacc gggttggact caagacgata gttaccggat aaggcgcagc ggtcgggctg 6960 aacggggggt tcgtgcacac agcccagctt ggagcgaacg acctacaccg aactgagata 7020 cctacagcgt gagctatgag aaagcgccac gcttcccgaa gggagaaagg cggacaggta 7080 tccggtaagc ggcagggtcg gaacaggaga gcgcacgagg gagcttccag ggggaaacgc 7140 ctggtatctt tatagtcctg tcgggtttcg ccacctctga cttgagcgtc gatttttgtg 7200 atgctcgtca ggggggcgga gcctatggaa aaacgccagc aacgcggcct ttttacggtt 7260 cctggccttt tgctggcctt ttgctcacat gttctttcct gcgttatccc ctgattctgt 7320 ggataaccgt attaccgcct ttgagtgagc tgataccgct cgccgcagcc gaacgaccga 7380 gcgcagcgag tcagtgagcg aggaagcgga ag 7412
【权利要求】
1. 一种靶向抑制肺癌细胞的基因药物，其特征在于，所述基因药物为纳米脂质体包裹 的质粒 T-VISA-BikDD ; 其中，质粒T-VISA-BikDD的核苷酸序列如Seq ID No. 1所示； 纳米脂质体的制备方法为：将氨基甲酰基胆固醇与磷脂酰乙醇胺按1:2的摩尔比混 合，加入有机溶剂溶解，使氨基甲酰基胆固醇的浓度为1. 18mg/mL，将上述溶液置于旋转烧 瓶中，在60°C水浴中旋转蒸发，得到一层附着于烧瓶内壁上的脂膜；然后加入双蒸水，使氨 基甲酰基胆固醇与磷脂酰乙醇胺的摩尔浓度为20mM/L，所得溶液经超声处理5min，依次通 过0. 45 μ m、0. 22 μ m的滤膜，收集通过0. 22 μ m的聚碳酸酯膜滤膜的滤液即得纳米脂质体； 其中，纳米脂质体的平均粒径为l〇〇nm，所述有机溶剂为氯仿与甲醇按等体积比混合配制。
2. 根据权利要求1所述的基因药物，其特征在于，超声处理采用200w超声波细胞破碎 仪，超声5s，间歇5s。
3. 根据权利要求1或2所述的基因药物，其特征在于，所述基因药物的粒径为 150_300nm。
4. 权利要求1-3任一项所述基因药物的制备方法，其特征在于，将纳米脂质体加入到 注射用水中，得到的纳米脂质体溶液中脂质体的浓度为8mM，另将T-VISA-BikDD质粒加入 到注射用水中使质粒浓度为0. 6 μ g/ μ 1，然后将纳米脂质体溶液和T-VISA-BikDD质粒溶 液混合静置20min，即得。
【文档编号】A61K47/28GK104043133SQ201410310707
【公开日】2014年9月17日 申请日期:2014年6月30日 优先权日:2014年6月30日
【发明者】陈光明, 饶桂荣, 罗肇璋, 谢小明, 齐颖 申请人:广州市军科泰特医药科技有限公司