一种a亚群禽白血病病毒基因工程亚单位疫苗的制作方法
【专利摘要】本发明的目的是提供一种A亚群禽白血病病毒基因工程亚单位疫苗，其中抗原的氨基酸序列为SEQ?ID?NO:1。本发明利用pET32a(+)表达性载体构建了能表达A亚群禽白血病病毒(ALV-A)囊膜表面蛋白基因(gp85)的大肠杆菌Rosetta宿主菌。经SDS-PAGE分析，表达出了53kDa重组融合目的蛋白。将融合蛋白纯化并复性后制备成基因工程亚单位氢氧化铝胶疫苗，免疫成年祖代鸡，可以诱发维持42天以上的特异性抗ALV-Ab的抗体,并可抵抗ALV-A病毒的感染。对制备的A亚群禽白血病病毒基因工程亚单位疫苗的性状改造，使该亚单位疫苗保存期内的免疫效力由70％提高至85％。
【专利说明】一种A亚群禽白血病病毒基因工程亚单位疫苗
【技术领域】
[0001] 本发明属于兽用生物制品【技术领域】，具体涉及一种A亚群禽白血病病毒基因工程 亚单位疫苗。
【背景技术】
[0002] 禽白血病病毒（Avian Leukosis Viruses, ALVs)是反转录病毒科α反转 录病毒属的成员之一。20世纪60年代，在鸡群中发现了 5个亚群的ALV，其中A、Β、 C和D亚群是外源性的。E亚群主要以前病毒的形式存在，是内源性的。其中A、B亚 群是鸡群中较常见的ALV，而C、D亚群较少见。由于采取了严格的切断垂直传播和将 未感染的后代隔离饲养的净化措施，从1987年以后国际发达国家的大型种鸡公司中 就已经宣布将外源性鸡白血病毒净化了（Payne L N，Fadly A M.Leukosis/Sarcoma group. Calnek BW, et al. Diseases of Poultry. Ames,USA:Iowa State University Press, 1997,414-416 ；Payne L N. HPRS-103:a retrovirus strikes back.The emergence of subgroup J avian leukosis virus.Avian Pathology, 1998, 27:S36-S45 ； Spencer J L，Crittenden L B，Burmester B R, Okazaki W,Witter R L. Lymphoid Leukosis: Interrelations among virus infections in hens, eggs, embryos and chickens. Avian Diseases, 1977, 21:331-345 ；Spencer J L. Progresstowards eradiction of lymphoid leucosis viruses-a review. Avian Pathology，1984, 13:599-619.)〇 但 美国不久前报道了从马立克氏病疫苗中分离到了 ALV-A(Silva R F，Fadly A M，TaylOT SP.Development of a polymerase chain reaction to differentiate avain leukosis virus (ALV)subgroup: detection of an ALV contaminant in commercial Marek' s disease vaccines. Avian Diseases, 2007, 51:663-667 ；Zavala G, Cheng S. Detection and characterization of avian leukosis virus in Marek' s disease vaccines. Avian Diseases, 2006, 50:209-215 ；Barbosa T, Zavala G, Cheng S.Molecualr characterization of three recombinant isolate of avian leukosis virus obtained from contaminated Marek's disease vaccines. Avian Diseases，2008, 52:245-252)。而我国长期使用从国外 进口袓代鸡和进口疫苗，并且从来没有对ALV采取过净化措施，因此，我国的鸡群中可能已 经存在A亚群禽白血病。近几年对ALV感染的血清学调查证明了 ALV-A感染的普遍性，并且 从中国的鸡群中分离到了 ALV-Α(朱美真等.山东地方品系鸡中一株ALV-A的分离鉴定.中 国动物传染病学报，2009, 17 (4) :31-35 ;乔彦华，等.A亚群禽白血病病毒QC6281株的分离 与 gp85 基因的序列分析.中国兽医杂志，2009,44(12) :9-11 ;Qing-chan ZHANG，Dong-min ZHAO, Hui-jun GUO, Zhi-zhong Cui. Isolation and Identification of a Subgroup A Avian Leukosis Vrius from Imported Meat-type Grand-parent Chickens. Virologica Sinica，2010, 25 (2) : 130-136.)，证实了中国鸡群中A亚群禽白血病的存在。
[0003] 感染有ALV的病鸡和带毒鸡是重要的传染源。有病毒血症的母鸡产出的鸡蛋常带 毒，并且孵出的雏鸡也会带毒。一般雏鸡在2周以内感染这种病毒，发病率和感染率很高， 残存母鸡产下的蛋带毒率也很高。外源ALV有两种传播途径，垂直传播和水平传播。垂直 传播是主要的传播方式，在流行病学上很重要，决定了感染的延续性、持续性。因此，只有通 过从我国以及进口的祖代鸡的源头上进行净化，才能根除禽白血病的危害。但单纯通过淘 汰带毒祖代鸡给养鸡业带来的损失太大，到目前为止，世界上还没有商品化地用于预防ALV 的疫苗，这一严峻现实对于抗ALV的疫苗提出了新要求，因此通过制备抵抗ALV-A的疫苗， 使其产生抗ALV-A的抗体，并通过垂直传播的方式将产生的抗体以母源抗体的形式传给下 一代雏鸡，从而使其对早期易感染ALV的雏鸡提供较强的保护力。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种A亚群禽白血病病毒基因工程亚单位疫苗，即通过原 核表达载体构建出能表达A亚群禽白血病病毒（ALV-A)囊膜表面蛋白gp85的大肠杆菌 Rosetta重组基因工程菌，以制备A亚群禽白血病病毒基因工程重组亚单位疫苗。
[0005] 申请人:通过pET32a(+)原核表达载体构建出能表达A亚群禽白血病病毒（ALV-A) 囊膜表面蛋白gp85的大肠杆菌Rosetta重组基因工程菌，通过对工程菌的诱导、超声破碎、 融合蛋白纯化、定量、与佐剂配比等制备和生产方法制备出了A亚群禽白血病病毒基因工 程重组亚单位疫苗。
[0006] 本发明的A亚群禽白血病病毒基因工程亚单位疫苗，其中抗原的氨基酸序列为 SEQ ID N0:1 ；
[0007] 其中编码抗原的核苷酸序列为SEQ ID NO:2。
[0008] 本发明的A亚群禽白血病病毒基因工程亚单位疫苗，为氢氧化铝胶苗；
[0009] 本发明所提供的亚单位疫苗中，抗原蛋白的含量优选不少于207. 5 μ g/ml ;
[0010] 本发明的A亚群禽白血病病毒基因工程亚单位疫苗，其制备方法包含如下的步 骤：
[0011] 1)将ALV-A接种于DF1细胞上，提取感染细胞的DNA作为模板；
[0012] 2)通过PCR方法扩增出ALV-A囊膜表面糖蛋白gp85基因，回收gp85目的片段；
[0013] 3)将gp85目的片段按正确阅读框架插入表达载体pET32a(+)中，构建成表达重组 质粒；
[0014] 4)将构建的表达重组质粒通过转化Rosetta宿主菌，构建了能表达ALV-A囊膜表 面糖蛋白gp85的大肠杆菌；用该重组基因工程菌表达出ALV-A囊膜表面糖蛋白gp85融合 蛋白；
[0015] 5)对融合蛋白进行纯化、复性后，加入氢氧化铝胶相制成疫苗。
[0016] 6)为了提高疫苗的免疫效力，对抗原进行改造，改造后的蛋白的氨基酸序列为SEQ ID N0:3。
[0017] 本发明利用pET32a (+)表达性载体构建了能表达A亚群禽白血病病毒（ALV-A)囊 膜表面蛋白基因（gp85)的大肠杆菌Rosetta宿主菌。经SDS-PAGE分析，表达出了 53kDa 重组融合目的蛋白。将融合蛋白纯化并复性后制备成基因工程亚单位氢氧化铝胶疫苗，免 疫成年祖代鸡，可以诱发维持42天以上的特异性抗ALV-Ab的抗体，并可抵抗ALV-A病毒 的感染。
【具体实施方式】
[0018] 实施例1表达ALV-A gp85基因的重组质粒pET32a-ALV-A-gp85的构建 [0019] 根据ALV-A YB株病毒基因组中gp85囊膜糖蛋白基因序列与表达性载体 PET32a(+)的多克隆酶切位点，利用DNAStar软件设计ALV-A-gp85的特异性引物：gp85-F :5-TATGGATCCCACTTACTCGAGCAGCCA-3 加入了 BamH I 酶切位点；gp85-R:5-ATAGCGGCCGCCT AGACGCTTCGTTTATGTC-3加入了 Not I酶切位点。以禽白血病病毒基因组DNA为模板进行 PCR扩增，并用DNA纯化回收试剂盒回收目的基因，其核苷酸序列为SEQ ID N0:2,编码的 蛋白的氨基酸序列为SEQ ID N0:1。利用pET32a(+)质粒获得pET32a-ALV-A-gp85重组质 粒，将该重组质粒转入表达性大肠杆菌Rosetta宿主菌，挑取单个克隆，酶切法鉴定阳性克 隆，摇菌，测序。
[0020] 实施例2.重组融合蛋白的表达、纯化、复性及SDS-PAGE鉴定
[0021] 将测序结果正确的单个克隆重组质粒pET32a-ALV-A_gp85转化表达性Rosetta 宿主菌构建出重组基因工程菌，命名为pET32a-ALV-A-gp85/Rosetta。将该重组基因工程 菌接种于5ml含有氨苄青霉素（100mg/L)的LB细菌培养基，37°C振摇（200r/min)培养 过夜，次日取出lml培养物接种于120ml的LB培养基中，37°C振摇（200r/min)培养2. 5h 后，菌液摇至半透明半浑浊状态，吸光光度法测得0D600 = 0. 6?0. 8,在诱导前先取10ml 作为诱导前对照，并将振摇温度变为30°C加 α -乳糖（终浓度为1. 0mm〇l/L)诱导，分别 诱导lh、2h、3h、4h、5h、6h收集10ml菌液，以诱导未转化pET32a(+)载体的菌液作为空白 对照，以诱导转化pET32a(+)载体的菌液作为空载体对照。按照以下步骤进行纯化、复性： (1)将诱导表达的菌液取出分装至50ml离心管中，4000r/min离心10min，弃上清；（2)用 lml TE1 (Tris-cll0mM/L，EDTA 二钠 lmM/L, PH = 8. 0)重悬沉淀并转移至 1. 5ml 离心管中， 按照以下条件：超声30s、间隔30s、工作20次、480V电压下超声波裂解破碎工程菌，7000r/ min4°C离心 20min，弃上清；（3)将沉淀中加入 lml TE2(Triton X-100/TE1 = 1/100 配置） 震荡混匀，7000r/min4°C离心20min，弃上清；（4)在沉淀中加入lml TE3 (用TE1配置2M/L 尿素），7000r/min4°C离心20min，弃上清；（5)将沉淀收集加入150ml变性液（8M/L尿素、 10mM/L Tris_cl、10mM/L DTT)搅拌溶解，8000r/min4°C离心 30min，取上清；（6)将上清液 加入半透膜袋中，4°C透析复性48h。取半透膜袋中的蛋白液按1:1加2X上样Buffer煮沸 10min，离心取上清，上清用12% SDS-PAGE电泳鉴定分析获得53kDa目的蛋白。
[0022] 实施例3纯化融合蛋白定量与A亚群禽白血病病毒基因工程亚单位疫苗制备
[0023] 将纯化好的A亚群禽白血病gp85目的蛋白用分光光度法按照以下步骤进行绝对 定量：（1)加测蛋白用的PBS0. 15ml和蛋白定量用考马斯亮蓝染液2. 85ml于比色皿中作为 对照，进行调零；（2)加测蛋白用PBS0. 14ml、加待测蛋白溶液0. 01ml和蛋白定量用考马斯 亮蓝染液2. 85ml于比色皿中测出吸光度值y为0. 184,通过公式y = 0. 0142X+0. 0658得出 蛋白浓度X = 〇. 83mg/ml，即为830 μ g/ml，以上所用测蛋白用试剂购自TIANGEN公司。将 此纯化的融合蛋白溶液与氢氧化铝胶佐剂按体积比=1 :3进行配苗，制备成A亚群禽白血 病病毒基因工程亚单位疫苗，相当于每毫升氢氧化铝胶苗中含有融合蛋白207. 5 μ g/ml。
[0024] 实施例4 A亚群禽白血病病毒基因工程亚单位疫苗对成年祖代鸡免疫反应及抗体 水平检测
[0025] 以0. 5ml/只的剂量用胸部肌肉注射的途径免疫4月龄的成年祖代鸡，14天后重 复免疫一次。成年祖代鸡在带过滤空气装置的隔离罩内饲养，饲料及饮用水均高压灭菌，维 生素及饲料添加剂亦经过无菌检测。在二免后14d、35d、42d、49d采集的血清用ELISA标准 试剂盒（ALV-Ab Antibody Test Kit，购于IDEXX公司）进行检测。ELISA试验检测结果的 S/P值> 0. 4判为阳性。
[0026] 检测结果如下：成年祖代鸡免疫接种试验表明（表1)，用制备的A亚群禽白血病 病毒基因工程亚单位疫苗第2次胸部肌肉注射后14d，ELISA ALV-Ab检测试剂盒测得4只 鸡（编号为3?6)血清的S/P值（[待检样品孔读数-已知阴性对照孔读数]/[标准阳性 对照孔读数-已知阴性对照孔读数])都大于〇. 4,呈强阳性，并且其中3号鸡的抗体水平 明显高于其它鸡只，S/P值竟高达1.735。其它几只鸡的抗体水平也明显高于对照鸡（编号 为1?2)血清。随着免疫时间的延长，机体内ALV-A的中和抗体滴度开始下降，在第2次 免疫注射后35d检测时，虽然4只鸡仍为强阳性，但S/P值已经下降。在二免后42d，鸡血清 中ALV-A的中和抗体滴度最低值下降至阳性临界值。在二免后49d，4只鸡血清的S/P值均 降至0. 4以下，但仍高于对照组鸡。
[0027] 实施例5亚单位疫苗免疫祖代鸡后种蛋孵出雏鸡母源ALV-Ab抗体检测及ALV-A 攻毒保护试验
[0028] 将制备的A亚群禽白血病病毒基因工程亚单位氢氧化铝胶疫苗，以0. 5ml/只的剂 量免疫4月龄成年祖代鸡。所有成年祖代鸡在无菌隔离罩内饲养，于二免后产蛋鸡抗体水 平最高时收集种蛋（包括无抗体组）进行孵化。孵出雏鸡12只，其中无抗体组4只，有抗体 组8只，于1日龄用ALV-A病毒以10 6TCID5(I/只的剂量进行腹腔攻毒，以后每隔10d无菌采 血,进行血液病毒分离试验并采用间接免疫荧光试验（IFA)进行检测，以确定血液中ALV-A 病毒是否存在。结果，攻毒后l〇d、20d和30d分别采血分离病毒，有抗体组8只鸡IFA结果 全部为阴性，无抗体组4只鸡IFA检测结果全为阳性。血清ELISA标准检测试剂盒检测，其 有抗体组7只鸡抗体水平并未升高。以上说明ALV-A病毒并未在鸡体内增殖，从而证明成 年祖代鸡在免疫该亚单位疫苗后，能产生坚强的免疫力，以抵抗ALV-A病毒的侵袭。
[0029] 实施例6 A亚群禽白血病病毒基因工程亚单位疫苗的性状改造
[0030] 本发明制备的A亚群禽白血病病毒基因工程亚单位疫苗在保存过程中，由于蛋白 的降解，会发生效价降低现象。为了延长疫苗的保存期限，对囊膜表面蛋白gp85的氨基酸 序列进行了改造，从而使改造后的疫苗在免疫效力不下降的基础上，能够在长期保存过程 中效价下降速度变慢。
[0031] 具体的改造方法如下：
[0032] 设计 PCR 引物 Xynll-Fla、Xynll-Rlb 如下：
[0033] Xynll-Fla ：GGCGAATTC TATGGATCCCACTTACTCGAGCAGCCA(下划线为限制性内切酶 EcoRI识别位点）
[0034] Xynll-Rlb ：ATAGCGGCCGC ATAGCGGCCGCCTAGACGCTTCGITTATGTC(下划线为限制性 内切酶NotI识别位点）
[0035] 以核苷酸序列为SEQ ID N0 :2的基因片段为模板，以上述引物用GeneMorph II随 机突变PCR试剂盒（Stratagene)进行PCR扩增，胶回收PCR产物，EcoRI、NotI进行酶切处 理后与经同样酶切后的pET32a(+)载体连接，将该重组基因工程菌接种于5ml含有氨苄青 霉素（100mg/L)的LB细菌培养基，37°C振摇（200r/min)培养过夜，次日取出lml培养物接 种于120ml的LB培养基中，37°C振摇（200r/min)培养2. 5h后，菌液摇至半透明半浑浊状 态，吸光光度法测得OD600 = 0. 6?0. 8,在诱导前先取10ml作为诱导前对照，并将振摇温 度变为30°C加 α -乳糖（终浓度为1. 〇mm〇l/L)诱导，分别诱导lh、2h、3h、4h、5h、6h收集 l〇ml菌液，以诱导未转化pET32a(+)载体的菌液作为空白对照，以诱导转化pET32a(+)载体 的菌液作为空载体对照。按照以下步骤进行纯化、复性：（1)将诱导表达的菌液取出分装至 50ml 离心管中，4000r/min 离心 lOmin，弃上清；（2)用 lml TEl(Tris-cllOmM/L，EDTA 二钠 ImM/L，PH = 8. 0)重悬沉淀并转移至1. 5ml离心管中，按照以下条件：超声30s、间隔30s、工 作20次、480V电压下超声波裂解破碎工程菌，7000r/min4°C离心20min，弃上清；（3)将沉 淀中加入 lml TE2(Triton X-100/TE1 = 1/100 配置）震荡混匀，7000r/min4°C 离心 20min， 弃上清；（4)在沉淀中加入lml TE3 (用TE1配置2M/L尿素），7000r/min4°C离心20min，弃 上清；（5)将沉淀收集加入150ml变性液（8M/L尿素、10mM/L Tris-clUOmM/L DTT)搅拌溶 解，8000r/min4°C离心30min，取上清；（6)将上清液加入半透膜袋中，4°C透析复性48h。取 半透膜袋中的蛋白液，即得到纯化复性的gp85囊膜表面糖蛋白突变体。
[0036] 最终筛选出氨基酸序列为SEQ ID N0 :3的突变体，将突变体按照实施例3记载的 方法进行定量配苗，制备的亚单位疫苗按照实施例4和实施例5记载的方法进行疫苗免疫 效力评价。结果，获得具有免疫效力且能够抵抗ALV-A病毒侵染的突变体亚单位疫苗。然 后将具有免疫效力的gp85囊膜表面糖蛋白突变体制备的亚单位疫苗进行保存期试验，其 在2?8°C保存4个月后还保有85%以上的免疫效力，而没有进行随机突变的亚单位疫苗 免疫效力仅为70%。
[0001] 序列表 SEQUENCE LISTING <110>青岛易邦生物工程有限公司 <120> -种A亚群禽白血病病毒基因工程亚单位疫苗 <160> 3 <170> Patent!n version 3.5 <210> 1 <211> 341 <212> PRT <213> wild amino acid sequence <400> 1 Asp Val His Leu Leu Glu Gin Pro Gly Asn Leu Trp lie ThrTrp Ala 1 5 10 15 Asn Arg Thr Gly Gin Thr Asp Phe Cys Leu Ser Thr Gin Ser Ala Thr 20 25 30 Ser Pro Phe Gin Thr Cys Leu lie Gly lie Pro Ser Pro lie Ser Glu 35 40 45 Gly Asp Phe Lys Gly Tyr Val Ser Asp Asn Cys Thr Thr Leu Gly Thr 50 55 60 Asp Arg Leu Val Ser Ser Ala Ser lie Thr Gly Gly Pro Asp Asn Ser 65 70 75 80 Thr Thr Leu Thr Tyr Arg Lys Val Ser Cys Leu Leu Leu Lys Leu Asn 85 90 95 Val Ser Met Trp Asn Glu Pro Pro Glu Leu Gin Leu Leu Gly Ser Gin 100 105 110
[0002] Ser Leu Pro Asn lie Thr Asp lie Thr Gin lie Ser Gly Val Ala Gly 115 120 125 Gly Cys Val Gly Phe Arg Pro Lys Gly Val Pro Trp Tyr Leu Gly Trp 130 135 140 Ser Gin Gly Giu Ala Thr Arg Phe Leu Leu Arg His Pro Ser Phe Ser 145 150 155 160 Asn Leu Thr Glu Pro Phe Thr Val Val Thr Ala Asp Arg His Asn Leu 165 170 175 Phe Met Gly Ser Glu Tyr Cys Gly Ala Tyr Gly Tyr Arg Phe Trp Glu 180 185 190 lie Tyr Asn Cys Ser His Arg Trp Gly Ser Ser Thr Ala Val Ala Met 195 200 205 His Ala Ala Pro Ala Arg Val lie Leu Lys Pro Ser Val Gin Gly Glu 210 215 220 Glu Ala Asn Gly Leu lie Asn His Gly Lys Leu Met Arg Gin Ser Arg 225 230 235 240 Ser Ala Leu Arg Arg Pro Val Gin Leu Val Leu Gly Asn Ala Ser Gly 245 250 255 Cys Cys Gly Lys Ala Gly Thr lie Leu Pro Gly lie Trp Val Asp Ser 260 265 270 Thr Gin Gly Asn Phe Thr Lys Pro Lys Ala Leu Pro Pro Ala lie Phe 275 280 285
[0003] Leu lie Cys Gly Asp Arg Ala Trp Gin Gly lie Pro Ser Arg Pro Val 290 295 300 Gly Gly Pro Cys Tyr Leu Gly Lys Leu Thr Met Leu Ala Pro Asn His 305 310 315 320 Thr Asp lie Leu Lys lie Leu Ala Asn Ser Ser Arg Thr Gly lie Arg 325 330 335 Arg Arg Arg Ser Val 340 <210> 2 <211> 1023 <212> DNA <213> wild gene sequence <400> 2 gatgtccact tactcgagca gccagggaat ctttggatta catgggccaa ccgtacaggc 60 caaacggatt tctgcctctc tacacagtca gccacttccc cttttcaaac atgtttgata 120 ggcatcccgt cccctatttc cgaaggtgat tttaagggat acgtctctga taattgcacc 180 accttgggaa ctgaccggtt agtctcgtca gccagcatta ctggcggccc tgacaacagc 240 accaccctca cttatcgaaa ggtttcatgc ttgctgttaa aactgaacgt ctctatgtgg 300 aatgagccac cggaactaca gctgctaggt tcccagtctc tccctaacat tactgatatt 360 actcagattt ctggtgtagc tgggggatgc gtaggcttca ggccgaaagg ggtcccctgg 420 tacctgggtt ggtctcaggg ggaggccaca cggttcctcc ttagacaccc ctctttctct 480 aatctcacgg aaccgttcac ggtggtaaca gcggatagac acaatctctt tatggggagt 540 gagtattgcg gtgcgtacgg atacagattt tgggaaatat acaactgctc acacaggtgg 600 ggcagcagta ccgctgtggc aatgcacgcc gcccccgccc gggtcatcct gaaacccagt 660
[0004] gtacaaggag aggaggcaaa tgggttaatc aatcacggaa aattaatgag acagagccgt 720 tcagctttac ggtaacctgt acagctagta ttgggcaatg ccagtggatg ttgcpgaaaa 780 gcaggcacga ttctcccggg aatctgggtc gacagcacac aaggtaattt caccaaacca 840 aaagcgctac cacccgcaat tttcctcatt tgcggggatc gcgcatggca gggaattcct 900 agtcgtccgg tagggggccc ctgctattta ggcaagctta ccatgttagc acccaaccat 960 acagatattc tcaaaattct tgctaattcg tcgcggacag gtataagacg tagacgaagc 1020 gtc 1023 <210> 3 <211> 341 PFTT <213> mutant amino acid sequence <400> 3 Asp Val His Leu Leu Glu Gin ProGlyAsn Leu Trp UeThrTrp Ala 1 5 10 15 Asn Arg Thr Gly Gin Thr Asp Phe Cys Leu Ser Thr Gin Ser Ala Thr 20 25 30 Ser Pro Phe Gin Thr Cys Leu lie Gly lie Pro Ser Pro lie Ser Glu 35 40 45 Gly Asp Phe Lys Gly Tyr Val Ser Asp Asn Cys Thr Thr Leu Gly Thr 50 55 60 Asp Arg Leu Val Ser Ser Ala Ser lie Thr Gly Gly Pro Asp Asn Ser 65 70 75 B0 Thr Thr Leu Thr Tyr Arg Lys Val Ser Cys Leu Leu Leu Lys Leu Asn
[0005] 85 90 95 Val Ser Met Trp Asn Glu Pro Pro Glu Leu Gin Leu Leu Gly Ser Gin 100 105 110 Ser Leu Pro Asn lie Thr Asp lleThr Gin lie Ser Gly Val Ala Gly 115 120 125 Gly Cys Val Gly Phe Arg Pro Lys Gly Val Pro Trp Tyr Leu Gly Trp 130 135 140 Ser Gin Gly Glu Ala Thr Arg Phe Leu Leu Arg His Pro Ser Phe Ser 145 150 155 160 Asn Leu Thr Glu Pro Phe Thr Val Val Thr Ala Asp Arg His Asn Leu 165 170 175 Phe Met Gly Ser Glu Tyr Cys Gly Ala Tyr Gly Tyr Arg Phe Trp Glu 180 185 190 lie Tyr Asn Cys Ser His Arg Gly Gin Gin Tyr Thr Ala Val Ala Met 195 200 205 His Ala Pro Arg Pro Gin Ser lie Leu Lys Pro Ser Thr Arg Gin Gin 210 215 220 Gly Ala Asn Gly Leu lie Asn His Giy Lys Leu Met Arg Gin Ser Arg 225 230 235 240 Ser Ala Leu Arg Arg Pro Val Gin Leu Val Leu Gly Asn Ala Ser Gly 245 250 255 Cys Cys Gly Lys Ala Gly Thr lie Leu Pro Gly lie Trp Val Asp Ser
[0006]
【权利要求】
1. 一种A亚群禽白血病病毒基因工程亚单位疫苗，其特征在于，所述的疫苗免疫祖代 鸡可以诱发维持42天以上的特异性抗ALV-Ab的抗体，免疫祖代鸡所产种蛋孵出雏鸡可抵 抗ALV-A病毒的感染。
2. 如权利要求1所述的疫苗，其特征在于疫苗抗原的氨基酸序列为SEQ ID NO: 1。
3. 如权利要求2所述的疫苗，其特征在于所述的抗原编码基因的核苷酸序列为SEQ ID N0:2。
4. 如权利要求1所述的疫苗，其特征在于所述的抗原的氨基酸序列为SEQ ID NO:3。
5. 如权利要求1所述的疫苗，其特征在于所述的疫苗为氢氧化铝胶苗。
6. 如权利要求1所述的疫苗，其特征在于所述的抗原蛋白的含量为207. 5 μ g/ml。
7. 权利要求1所述的疫苗的制备方法，其特征在于，所述的方法包括有如下的步骤： 1) 将ALV-A接种于DF1细胞上，提取感染细胞的DNA作为模板； 2) 通过PCR方法扩增出ALV-A囊膜表面糖蛋白gp85基因，回收gp85目的片段； 3) 将gp85目的片段按正确阅读框架插入表达载体pET32a(+)中，构建成表达重组质 粒； 4) 将构建的表达重组质粒通过转化Rosetta宿主菌，构建了能表达ALV-A 囊膜表面糖蛋白gp85的大肠杆菌；用该重组基因工程菌表达出ALV-A囊膜表面糖蛋白 gp85融合蛋白； 5) 对融合蛋白进行纯化、复性后，加入氢氧化铝胶相制成疫苗。
8. 如权利要求1所述的疫苗，通过对其性状进行改造，使该亚单位疫苗保存期内的免 疫效力由70 %提高至85%。
【文档编号】A61P31/14GK104096241SQ201410347690
【公开日】2014年10月15日 申请日期:2014年7月19日 优先权日:2014年7月19日
【发明者】张恒, 范根成, 杜元钊 申请人:青岛易邦生物工程有限公司