鸭坦布苏病毒囊膜e蛋白特异性结合肽及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种鸭坦布苏病毒囊膜E蛋白特异性结合肽及其应用，属于动物病毒分子生物学【技术领域】。本发明通过噬菌体随机12肽库筛选得到鸭坦布苏病毒囊膜E蛋白特异性结合肽，其氨基酸序列为：THRSWQGNSWYM。该特异性结合肽可抑制鸭坦布苏病毒HN1株在鸭胚成纤维细胞的增殖，在不同浓度下均能显著下调鸭坦布苏病毒在鸭胚成纤维细胞中的病毒拷贝数，同时显著降低鸭坦布苏病毒在鸭胚成纤维细胞中的病毒滴度，而其本身对鸭胚成纤维细胞的增殖无明显影响。鸭坦布苏病毒囊膜E蛋白特异性结合肽在制备抗鸭坦布苏病毒病的药物或饲料添加剂中具有良好的应用前景，可用于鸭坦布苏病毒病的防治。
【专利说明】鸭坦布苏病毒囊膜E蛋白特异性结合肽及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种鸭坦布苏病毒囊膜E蛋白特异性结合肽，同时还涉及该特异性结 合肽的应用，属于动物病毒分子生物学【技术领域】。
【背景技术】
[0002] 近年来，中国南方爆发了一种新的鸭病毒性传染病，主要引起鸭产蛋严重下降，该 病传播迅速、涉及范围广，发病前期为持续高热，发病后期出现一定比例的神经症状，表现 为瘫痪、翻滚、站立不稳及共济失调等，有些病鸭甚至在数日内死亡。剖检死亡鸭，多数呈现 脾脏和肾脏明显肿大，蛋鸭表现为出血性卵巢炎。该病首先在江浙一带爆发，随后蔓延到福 建和安徽等地，之后在江西、山东、湖南、河南、河北相继爆发。对于此病，国外尚未见报道。 国内研究人员对其病原进行了分离、形态学观察、理化特性测定、RT-PCR检测及序列分析， 现已确定该病病原为鸭坦布苏病毒，故称该病为鸭坦布苏病毒病。该病发病率高、传播迅 速，发病范围极广，已给养鸭业造成重大经济损失。
[0003] 鸭坦布苏病毒（Duck tembusu virus，DTMUV)是一种新型黄病毒，属于黄病毒科不 分节段的单股正链RNA病毒，其病毒粒子呈球形，直径约45?50nm，有囊膜和纤突，病毒约 由10990个核苷酸组成。该病毒对热、脂溶剂和去氧胆酸钠敏感，pH〈5或pH>10时便失去 感染活性，50°C以上加热60min即被灭活。DTMUV能在鸭胚、鸡胚、鸭胚成纤维细胞及Vero、 BHKX6/36等部分传代细胞系上增殖。其病毒基因组由5'端、3'端的非编码区和中间的一 个开放阅读框组成，5'端的非编码区长度为142nt，含I型m7GpppNp帽子结构，3'端非编 码区长618nt，没有poly (A)尾巴，开放阅读框编码由3410个氨基酸残基构成的多聚蛋白 前体。前体蛋白在宿主信号肽酶和病毒丝氨酸蛋白酶的作用下被切割成3种结构蛋白（C、 prM 和 E)和 7 种非结构蛋白（NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5)。
[0004] E蛋白是一种囊膜蛋白，编码501个氨基酸，其氨基酸序列中存在高度保守区和变 异区。E蛋白位于成熟病毒颗粒表面，在病毒吸附受体、与宿主细胞膜融合以及病毒组装过 程中具有重要的作用，且含有多种抗原表位，这些表位与病毒识别宿主细胞膜受体、吸附和 进入细胞，病毒的致病性和诱导免疫应答等密切相关，在病毒感染中起重要作用。另外，E蛋 白还具有较好的免疫原性和反应原性，是宿主抗感染免疫的主要保护性抗原，也是检测该 病毒特异性抗体的理想靶抗原。
[0005] 噬菌体展示技术是近年来兴起的一项研究蛋白质分子间相互作用的有效手段，具 有快捷、高效、表型和基因型一致等特点，近年来被广泛应用于肽类药物、抑制肽、抗原模拟 表位的筛选等研究领域。利用噬菌体展示技术筛选鸭坦布苏病毒囊膜E蛋白特异性结合的 多肽，并研究该多肽对DTMUV在鸭胚成纤维细胞增殖方面的影响，可为DTMUV的防治提供一 个新的途径，具有较好的应用前景。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种鸭坦布苏病毒囊膜E蛋白特异性结合肽。
[0007] 同时，本发明还提供一种鸭坦布苏病毒囊膜E蛋白特异性结合肽的应用。
[0008] 为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：
[0009] 鸭坦布苏病毒囊膜E蛋白特异性结合肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0010] 所述的鸭坦布苏病毒为鸭坦布苏病毒HN1株。
[0011] 鸭坦布苏病毒囊膜E蛋白特异性结合肽的应用，具体为特异性结合肽在制备抗鸭 坦布苏病毒病（抑制鸭坦布苏病毒增殖，如抑制鸭坦布苏病毒在鸭胚成纤维细胞增殖）的 药物或饲料添加剂中的应用。
[0012] 本发明的有益效果：
[0013] 本发明通过基因工程方法获得DTMUV HN1株E蛋白，并以DTMUV HN1株E蛋白作 为靶标，利用噬菌体随机12肽库筛选得到鸭坦布苏病毒囊膜E蛋白特异性结合肽，其氨基 酸序列为：THRSWQGNSWYM。该特异性结合肽可抑制鸭坦布苏病毒HN1株在鸭胚成纤维细胞 的增殖。标准MTT法检测E蛋白特异性结合肽对鸭胚成纤维细胞增殖的影响，结果显示，多 肽本身对鸭胚成纤维细胞的增殖无明显影响。荧光定量PCR和TCID50检测E蛋白特异性 结合肽对鸭坦布苏病毒在鸭胚成纤维细胞增殖方面的影响，结果显示，该多肽在不同浓度 (0. 02 μ g/mL、0. 2 μ g/mL、2 μ g/mL、20 μ g/mL)下均能显著下调鸭坦布苏病毒在鸭胚成纤维 细胞中的病毒拷贝数，同时显著降低鸭坦布苏病毒在鸭胚成纤维细胞中的病毒滴度。结果 表明，E蛋白特异性结合肽能抑制鸭坦布苏病毒在鸭胚成纤维细胞的增殖，在鸭坦布苏病毒 病的防治中具有良好的应用前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0014] 图1为本发明实施例1中重组表达质粒pET32a-E构建示意图；
[0015] 图2为本发明实施例1中ELISA检测噬菌体展示肽对靶分子的结合活性；
[0016] 图3为实施例1中噬菌体阳性克隆竞争抑制试验结果；
[0017] 图4为试验例中DRMUV HN1株E蛋白特异性结合肽对鸭胚成纤维细胞增殖的影 响；
[0018] 图5为试验例中特异性结合肽对DRMUV HN1株在鸭胚成纤维细胞增殖的影响 (Real time PCR)；
[0019] 图6为试验例中特异性结合肽对DRMUV HN1株在鸭胚成纤维细胞增殖的影响 (TCID50)。
【具体实施方式】
[0020] 下述实施例仅对本发明作进一步详细说明，但不构成对本发明的任何限制。
[0021] 实施例1
[0022] 本实施例中鸭坦布苏病毒囊膜E蛋白特异性结合肽的筛选，包括以下步骤：
[0023] 1)常规方法制备DTMUV HN1株囊膜E蛋白
[0024] (1)重组表达质粒pET32a_E的构建
[0025] 根据GenBank发表的DTMUV HN1株E蛋白的基因序列（序列号：JQ669731)，利用 DNAStar软件分析，设计一对特异性引物P1和P2,引物两端分别加限制性酶切位点EcoR I 和Xba I及保护性碱基（Takara公司合成），下划线部分为酶切位点。
[0026] 上游引物 PI :5' -CCG GAATTC TTCAGCTGTCTGGGGATGCA-3'（如 SEQ ID NO: 2,下划 线部分为EcoR I酶切位点）；
[0027] 下游引物 P2 :5' -CGATCTAGA ATTGACATTTACTGCCAGG-3'（如 SEQ ID NO: 3,下划线 部分为Xba I酶切位点）。
[0028] 常规方法提取DTMUV HN1株RNA (病毒RNA提取试剂盒，南京Tiangen有限公司）， 通过常规反转录PCR获取E蛋白的基因全长序列（Invitrogen -步法RT-PCR试剂盒），将 获取的E蛋白基因克隆入pMD18-T载体中，并进行测序。将pMD18-T载体上的E蛋白基因 目的片段经EcoR I与Xba I酶切后，克隆入pET32a载体，构建重组表达质粒pET32a-E，并 用EcoR I与Xba I双酶切和PCR进行鉴定，鉴定阳性的质粒即为重组表达质粒pET32a-E， 送上海Invitrogen公司测序（见图1)。
[0029] (2)重组表达质粒pET32a_E的诱导表达与纯化
[0030] 采用CaCl2转化法，将重组质粒pET32a-E转化入大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞 中，筛选阳性克隆，即为含DTMUV HN1株E蛋白的基因的阳性基因工程菌株。将阳性基因工 程菌株于37°C培养，待A_值达到0. 5时（0. 4?0. 6均可），加 IPTG至终浓度为0. 8mM， 进行诱导表达。收集不同诱导时间表达的菌体，超声波破碎，离心后分别取上清和沉淀进行 SDS-PAGE电泳，并以鸭抗DTMUV-1血清为一抗，HRP标记的兔抗鸭IgG为二抗对表达产物进 行Western blot分析，最后用DAB显色试剂盒显色。将诱导表达的菌液离心并收获沉淀， 以洗涤液（5mM咪唑，0. 5M NaCl，20mM Tris-HCl，pH7. 9)重悬菌体后，经超声波裂解后离 心，将可溶性表达上清用蛋白质Ni柱亲和层析进行纯化，具体操作过程参照Novagen公司 His .bind purification kit说明书，E蛋白经镍柱纯化后，即获得DTMUV HN1株E蛋白。
[0031] 2)噬菌体随机12肽库的亲和筛选
[0032] (1)包被纯化的DTMUV HN1株E蛋白
[0033] 将上述基因工程表达的E蛋白以TBS稀释为10 μ g/mL，取稀释后的E蛋白包被酶 标板，100 μ L/孔，放置湿盒中4°C过夜；次日倾弃包被液，加入含0. 05 % Tween20的TBST洗 涤3次（每次静置3min)，叩干，然后以含5 %脱脂奶粉的TBS按100 μ L/孔加入各孔，置湿 盒中37°C封闭2h ;倾弃封闭液，以含0. 05% Tween20的TBST溶液洗涤3次，叩干，将包被 好的酶标板封口，于4°C保存待用。
[0034] (2)亲和筛选
[0035] 以TBST稀释原始文库（购于美国New England Biolabs，NEB公司）至1 X 10npfu/ mL，取稀释后的文库液100 μ L加入到预先包被E蛋白的酶标板孔内，放置湿盒中4°C过夜。 次日弃孔内液，并用TBST清洗10次，向微孔中加入100 μ L0. 2M Glycine-HCl (pH2. 2)，于室 温温和摇动l〇min，洗脱液吸入另一干净微量离心管中，加入15yLlM Tris-HCl(pH9. 1)中 和上述洗脱液。测定少量（?1 μ L)洗脱物的滴度，剩余洗脱物加入到20mL ER2738培养物 中（菌体处于对数前期），37°C剧烈摇动培养4. 5h。将培养物转入离心管中，4°C 12,000rpm 离心10min。上清液转入另一离心管中，再离心。取80%上清转入新管中，加入1/6体积 的PEG/NaCl，4°C沉淀过夜。次日，4°C 12,000rpm离心PEG沉淀15min。弃上清，再短暂离 心，弃去残留上清。沉淀物重悬于lmL TBS中，悬液转入微量离心管中，4°C离心5min使残 余细胞沉淀。上清转入另一新鲜微量离心管，用1/6体积的PEG/NaCl再沉淀。冰上孵育 30min(15?60min均可）。4°C离心10min，弃上清，再短暂离心，用微量移液器吸弃残余上 清。沉淀物重悬于200 μ L TBS、0. 02% NaN3中。离心lmin，沉淀任何残余的不溶物。上清转 入新的离心管中，即为第一轮扩增后的噬菌体洗脱物。根据常规M13方法用LB/IPTG/Xgal 平板测定扩增后洗脱物的滴度。将第一轮扩增后的噬菌体液以TBS稀释为IX 10npfu/mL， 取100 μ L加入到预先包被E蛋白的酶标板孔中进行第二轮筛选，37°C温育2h，弃孔内液， 并用含0. 05% Tween20的TBST溶液清洗10次，同上进行筛选后噬菌体的扩增和滴度的测 定，重复以上步骤进行第三轮筛选。
[0036] 在筛选过程中，将每轮投入筛选的噬菌体量记为Input、洗脱得到的噬菌体量记为 Output,分析比较每轮产出/投入比（Input/Output)情况，来反映特异性结合噬菌体的富 集程度。经过3轮筛选发现：淘选获得的噬菌体越来越多，特异性越来越强，其中第三轮噬 菌体滴度为2. 3X 106pfu/mL。噬菌体产出投入比逐轮提高（见下表1)，表明具有特异性结 合作用的噬菌体显示较好的富集效果。
[0037] 表1三轮亲和筛选对噬菌体的富集
[0038]
【权利要求】
1. 鸭坦布苏病毒囊膜E蛋白特异性结合肽，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID N0:1 所示。
2. 根据权利要求1所述的鸭坦布苏病毒囊膜E蛋白特异性结合肽，其特征在于：所述 的鸭坦布苏病毒为鸭坦布苏病毒HN1株。
3. -种如权利要求1或2所述的鸭坦布苏病毒囊膜E蛋白特异性结合肽的应用，其特 征在于：所述鸭坦布苏病毒囊膜E蛋白特异性结合肽在制备抗鸭坦布苏病毒病的药物或饲 料添加剂中的应用。
4. 根据权利要求3所述的鸭坦布苏病毒囊膜E蛋白特异性结合肽的应用，其特征在于： 所述鸭坦布苏病毒囊膜E蛋白特异性结合肽在制备抑制鸭坦布苏病毒在鸭胚成纤维细胞 增殖的药物或饲料添加剂中的应用。
【文档编号】A61P35/00GK104193804SQ201410361045
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2014年7月25日 优先权日:2014年7月25日
【发明者】王臣, 张才, 何雷, 牛明媚, 张春杰 申请人:河南科技大学