miR-638在抗急性髓系白血病中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种miR-638在抗急性髓系白血病中的应用，属于分子生物学领域。实验表明，在正常造血细胞分化发育和急性髓系白血病发生发展过程中，miR-638的表达水平存在明显的变化；在白血病细胞系和原代急性髓系白血病细胞中miR-638表达水平的上调或下调，可以显著促进或抑制细胞分化进程。本发明研究结果表明通过上调miR-638的表达能够达到治疗急性髓系白血病的目的。基于miR-638的功能其可用于制备抗急性髓系白血病药物，其模拟物或表达载体也可用于制备抗急性髓系白血病药物。本发明为开发新的抗急性髓系白血病的药物或诊断试剂提供了重要的基础。
【专利说明】mi R-638在抗急性髓系白血病中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学领域，涉及一种灵长类特异的非编码微小RNA-- hsa-miR-638(以下称为miR-638)在抗急性髓系白血病中的应用。
【背景技术】
[0002] 微小RNA(microRNAs，miRNAs)是一类长约19?25个核苷酸（nt)的单链小分 子RNA，主要通过抑制蛋白翻译或破坏靶基因转录本稳定性而调节转录后基因表达。1993 年，分别由两个研究小组在线虫中发现了第一种miRNA--lin-4,2001年将之正式命名为 microRNA。随后大量的研究表明，miRNAs的生物学功能几乎涉及到动植物生命活动的方方 面面，包括胚胎发育和肿瘤发生过程。胚胎发育是动植物从受精卵到成体的必经之路；肿 瘤，包括恶性血液疾病和实体瘤，是生长失控和分化异常的细胞群体，恶性肿瘤严重威胁着 人们的身心健康。越来越多的研究已经表明，早期胚胎发育与肿瘤发生发展的生物学行为 之间存在许多相似之处。这些研究为从发育生物学角度理解肿瘤的发生发展和为开发下一 代肿瘤诊断治疗技术提供了新的科学思维方法。
[0003] 为了全面深入剖析人类早期胚胎发育过程中基因表达调控特点和寻找新的肿 瘤诊断和治疗靶标， 申请人:和其他研究组曾利用CDNA表达文库制备和筛选、大规模表达 谱芯片等方法对人胚早期发育4-9周（人胚大多数组织器官形成、分化和发育的关键时 期）的基因表达谱进行了分析，并且对筛选的相关性基因在恶性疾病中的生物学功能开 展了一系列研究。随后还利用微流体miRNAs表达谱芯片分析鉴定了人胚发育4-6周中 miRNAs的表达特点：人类早期胚胎发育4-6周中大多数miRNAs的表达均很低，只有约5% 的miRNAs呈现高表达；并首次定义了 50种人胚特异高表达的miRNAs (HES-miRNAs)，包括 miR-638、miR-720 和 miR-1280 等（Characterization of MicroRNA Expression Profiles and the Discovery of Novel MicroRNAs Involved in Cancer during Human Embryonic Development. PLoS 0NE2013, 8(8):e69230)〇
[0004] 对大量的肿瘤样本进行的miRNA芯片研究表明，几乎所有的肿瘤中都出现了 miRNA的异常表达。异常表达miRNA对肿瘤发生的影响主要可以总结为以下几个方面：（1) 异常表达的miRNA调控原癌基因或抑癌基因异常表达。比如，miR-155基因位于非编码基 因 BIC的转录本中，而在各种淋巴瘤尤其是弥漫性大B细胞淋巴瘤中，这种非编码RNA的表 达水平都显著上升；miR-17-92基因簇位于一个在B细胞淋巴瘤病人中常见的基因扩增区 域内，故一般该簇表达的miRNA在这类淋巴瘤病人中异常高表达。在小鼠模型中，过表达 miR-17-92基因簇阻碍了细胞的凋亡并能促进由c-myc基因诱导的B细胞淋巴瘤的形成； 而c-myc基因本身也能转录调控miR-17-92基因簇及其该类miRNA的靶基因之一的细胞周 期正调控因子E2F1，形成对细胞生长增殖的严密调控。（2)异常表达的miRNA导致细胞周期 的异常。例如miR-221/222报道在许多肿瘤中都表达上调，功能研究表明它们能直接调控 p27kipl和p57kip2的表达，后者能通过与⑶K蛋白与周期蛋白复合体的结合抑制细胞Gl/ S期的转换。（3)异常表达的miRNA影响肿瘤的发展和转移。研究表明在高度转移性的乳 腺癌和恶性肝癌细胞中抑制原癌性的miR-21的表达，能有效抑制肿瘤细胞的侵袭和转移， 而这一过程与其靶基因⑶4和maspin的相应表达上调有关。
[0005] miRNA在细胞调控网络中发挥着平衡基因表达水平的作用，而肿瘤细胞中异常 表达的miRNA往往会打乱这种平衡，因而导致了肿瘤的发生发展。大量的芯片研究表明， miRNA可以用作区分不同肿瘤以及同一肿瘤类型中的不同亚型的分子标志物。人们通过对 334例不同肿瘤样本的miRNA表达谱分析表明，miRNA的表达模式可以用于区分不同组织发 育起源的肿瘤。另外，Murakami和其合作者报道，miR-222、miR-106a和miR-17-92基因簇 的表达水平共同决定了肝细胞癌的分化程度，而miR-21的高表达与胰腺癌病人的低生存 率密切相关。
[0006] 鉴于miRNA在肿瘤发生发展过程中的重要作用，对miRNA表达水平的调控可以作 为肿瘤治疗的一个有效手段。众多的研究指出miRNA的异常表达与肿瘤的耐药性密不可 分，故miRNA或miRNA的抑制剂能单独用于或者辅助用于对那些已经产生抗药性肿瘤的治 疗。
[0007] 已经有许多研究组也对miRNA在小鼠和人造血系统中的表达模式进行了深入研 究。报道表明，miRNA作为一种小分子非编码RNA几乎在造血过程的每一个阶段都发挥着 极其重要的调控作用。急性髓系白血病（acute myeloid leukemia, AML)是由造血干细胞 异常导致的髓系前体细胞分化受阻，且过度增殖而形成造血异常的疾病。AML患者外周血和 骨髓中的髓系前体细胞分化受阻，并丧失了分化成正常髓系终末细胞的能力。有大约25? 30%的基因组突变能引发造血异常，比如t(15 ;17)、t(8 ;21)和inv(16)等。
[0008] 大量的研究表明，miRNA在肿瘤尤其是白血病的发生中也发挥着重要的功能。Mi 和其合作者首次研究了 AML患者中miRNA的表达谱（MicroRNA expression signatures accurately discriminate acute lymphoblastic leukemia from acute myeloid leukemia. Proc Natl Acad Sci USA104(50) :19971-19976)。他们采用 11 例急性淋巴细 胞白血病（acute lymphoblastic leukemia，ALL)病人，47例AML病人和7株相应的白血 病细胞系进行miRNA表达谱分析，结果发现有27个miRNA在两种急性白血病中呈现差异 表达，其中miR-128a、miR-128b、let-7b及miR-223的表达出现显著差异，并且运用其中的 2个miRNA作为指标就可以精确的区分急性髓系和淋巴系白血病，准确率达到了 97-98%。 Isken等分析了 50例AML病人和健康人样本中154个miRNA的表达谱发现，miR-26a、 miR-26b和miR-29b的表达水平介于⑶34+细胞和正常的骨髓样本之间，而AML病人中的 miR-23b、miR-34a和miR-221/miR-222基因簇的表达水平与正常骨髓样本比较则出现了显 著差异（Identification of acute myeloid leukaemia associated microRNA expression patterns, J Haematol 140 (2) :153-161)。而在一些肿瘤细胞中 miR-221/miR-222 基因 簇的高表达会抑制抑癌基因⑶KNlB的表达，进而促进细胞增殖。此外人们还发现miR-181a 在AML亚型FAB (French-American-British)M4型和M5型的表达水平远低于Ml型和M2型， 提示miR-lSla可以作为区分急性髓系白血病亚型的指标。
[0009] 为了发掘针对AML这一疾病的miRNA诊断可能性，Wang等人分析了 10例AML (Ml 型到M5型）病人和6例健康人外周血单个核细胞中的miRNA表达谱。对照样本相比，大量 的miRNA在总的AML样本或不同亚型中出现了差异表达，其中miR-29a和miR-142-3p在 AML病例中显著下调，且其表达水平能作为AML的诊断指标之一（miR-29a and miR-142-3p downregulation and diagnostic implication in human acute myeloid leukemia. Mol 81〇11?印39(3):2713-2722)。随后，他们又详细研究了11111?-293和11111?-142-3口是如何参与 调控AML疾病的发生的。功能研究显示，过表达miR-29a或miR-142-3p都能促进诱导剂 诱导下的白血病细胞系的髓系分化，抑制其表达则相反。而且在原发性AML病人的CD34+ 细胞中重建这两个miRNA的表达能促进其体外诱导的粒系和单核/巨噬系的分化。进一 步的实验表明，miR-29a和miR-142-3p能同时调控CCNT2,进而阻碍磷酸化Rb蛋白的释 放，细胞周期受阻，分化得以顺利进行。此外miR-29a还能单独调控⑶K6,而miR-142-3p 则能调控TAB2蛋白的表达，其中TAB2同时参与了粒系和单核巨噬系分化的调控。以上 结论表明miR-29a和miR-142-3p是髓系造血分化的关键调控因子，其表达异常与AML疾 病的发生密切相关（MicroRNA_29a and microRNA-142_3p are regulators of myeloid differentiation and acute myeloid leukemia. Bloodl19(21):4992-5004)〇
[0010] 最近，Marcucci等人研究了 60岁以下成年AML病人的miRNA表达谱，病人分为核 型正常或伴有FLT3-ITD(fms_related tyrosine kinase3gene)基因的内部串联重复，或 二者兼有。其中有12个miRNA的表达与病人的临床诊断相关，其中miR-181家族在高危 AML病人中显著下调，而且其表达水平与toll样受体和白介素10信号通路中相关蛋白的 水平变化高度相关（MicroRNA expression in cytogenetically normal acute myeloid leukemia. N Engl J Med358(18):1919-1928) 〇
[0011] 如上所述，miRNA在许多肿瘤包括白血病中都能扮演原癌基因或者抑癌基因的角 色。于是将miRNA作为疾病治疗的作用靶标或者直接用于疾病治疗就成为了可能。迄今， 研究的比较充分的是miRNA的抑制分子，比如用锁核酸（locked nucleic acid, LNA)合 成的miRNA互补链抑制剂，用2-氧-甲基修饰的miRNA互补小RNA都被广泛用于临床研 究。2-氧-甲基修饰的miRNA互补RNA最早被用于在果蝇和线虫体内直接沉默siRNA或者 miRNA。在一项基础研究中发现，将miR-16、miR-122、miR-192和miR-194修饰后的抑制剂 直接注入小鼠体内，能有效的抑制这些miRNA在各个组织中的表达。另外，miR-122非常特 异的在肝组织中高表达，如果小鼠体内注入miR-122的拮抗剂（修饰后的抑制剂）能有效 的下调miR-122的表达，且持续时间能达到23天。其后的实验表明miR-122调控胆固醇代 谢这一重要功能完全被拮抗剂所阻断，显示了 miRNA可以作为一种非常有前景的疾病治疗 靶标。除了 miR-122,另外几种miRNA也在小鼠中被沉默表达，比如在小鼠内皮细胞特异的 miR-126的表达能有效的被其抑制剂下调。
[0012] 迄今为止，世界范围内首例把miRNA作为临床治疗革巴标的案例来自于miR-122。人 们研究了用LNA合成的miR-122抑制剂在抗HCV感染中的应用前景，并完成了在部分临床 试验。肝脏中高表达的miR-122通过与HCV基因组5'非编码区的结合能增强HCV相关蛋 白的翻译。另外，一种非常吸引人们注意的方式就是将miRNA和肿瘤的化疗相结合，同时检 测化疗前后miRNA的表达谱变化来指导治疗。一项对头颈鳞状细胞癌的研究发现，HMGA2表 达水平与该肿瘤对阿霉素的敏感性相关。HMGA2是非组蛋白染色体高迁移率蛋白家族成员， 其在低氧条件下表达下调，与之相应的是miR-98的上调，而在常氧条件下过表达miR-96能 下调HMGA2,并导致该类肿瘤细胞对于阿霉素敏感性的增加。
[0013] 除此之外，人们观察到在一些肿瘤中miRNA基因被甲基化而沉默，是否可以将沉 默的miRNA激活作为疾病治疗的靶标之一呢？比如，在ALL患者中，DNA甲基化导致部分 miRNA下调，而用5-硫唑嘌呤-2-脱氧胞苷处理就能激活这些沉默的miRNA。miRNA的甲基 化导致ALL病人miR-124表达下调，后者又可以下调控制ALL细胞生长增殖的蛋白⑶K6， 而拥有低水平miR-124的ALL病人疾病易复发且死亡率高。所以，甲基化的miRNA基因在 该类疾病的治疗中可以作为一种非常有前景的靶标，或者将其作为疾病诊断非常有效的指 标。
[0014] 最后，miRNA还可以作为疾病预后的检测指标。在CLL病人中，miR-29c和miR-223 在由A期向C期转换，或者预后差的病人样本中表达下调。因此，这些miRNA可以预测病人 的非治疗生存率（treatment-free survival，TFS)和总体生存率（overall survival，OS)。 Stamatopoulos等人介绍了一个由miR_29c、miR-223、ZAP-70和LPL四个分子共同组成的 评分系统，以评价不同亚型的CLL病人预后情况。
[0015] 综上所述，虽然还需要人们进行更系统的基础研究和大量的临床数据，但是将 miRNA用于多种重大恶性疾病的临床诊断和治疗，仍然具有非常光明的前景。
【发明内容】
[0016] 本发明的目的在于确定与人胚发育相关的、灵长类特异的非编码小RNA miR-638 在髓系造血分化中的调控作用，以及miR-638与急性髓系白血病发生的关系，提供一种 miR-638在抗急性髓系白血病中的应用。
[0017] 本发明的目的通过下述技术方案实现：
[0018] 本发明确定了 miR-638在髓系造血分化中的调控作用，以及miR-638与急性髓系 白血病发生的关系，研究结果如下：
[0019] 1、miR-638在造血细胞不同分化发育阶段以及造血细胞不同谱系间的表达、在白 血病细胞系和健康人外周血细胞之间的表达、以及在AML病人和健康人对照组的外周血单 个核细胞之间的表达，均具有显著的差异性。
[0020] 2、miR-638在PMA诱导白血病细胞THP-I和HL-60向单核/巨噬细胞系分化过程 中、在ATRA诱导白血病细胞HL-60和NB4向粒细胞系分化过程中、以及在PMA和ATRA分别 诱导原发性AML患者外周血原始细胞（blasts)向单核/巨噬细胞系和粒细胞系分化过程 中，均表现为显著的表达上调。
[0021] 3、miR-638在白血病细胞分化过程中的功能，即在白血病细胞THP-I和HL-60中 分别瞬时上调miR-638表达后，可以促进PMA诱导THP-I向单核/巨噬细胞系的分化过程、 以及促进ATRA诱导HL-60向粒细胞系的分化过程；反之，在白血病细胞THP-I和HL-60中 分别下调miR-638表达后，可以抑制PMA诱导THP-I向单核/巨噬细胞系的分化过程、以及 抑制ATRA诱导HL-60向粒细胞系的分化过程。
[0022] 4、miR-638在白血病细胞HL-60中瞬时过表达或稳定过表达后，可以显著地抑制 细胞增殖和软琼脂克隆形成能力。
[0023] 5、miR-638在原发性AML患者外周血原始细胞中表达上调，可以显著地促进诱导 剂PMA和ATRA诱导的细胞分化过程。
[0024] 本发明通过如下方法得出上述结果：
[0025] 通过商品化的设计引物（购自中国广东广州市锐博生物科技有限公司）检测了 miR-638在正常造血细胞分化发育过程以及不同细胞谱系中的表达，也检测了 miR-638在 白血病细胞在诱导剂诱导下向不同分化方向分化过程中的表达，以及在健康人和AML患者 中的表达，结果表明，miR-638的表达均有明显变化或显著差异，这些结果暗示miR-638可 能涉及到正常造血细胞发育过程和AML的发生发展过程。
[0026] 通过瞬时表达或稳定过表达手段，上调或下调白血病细胞和原代AML患者外周血 原始细胞中miR-638的表达，结果显示，miR-638的表达变化显著影响了白血病细胞和原代 AML患者外周血原始细胞的细胞分化进程,这些结果提示miR-638可能作为一种潜在的诊 治靶标用于AML的防治作用。
[0027] 利用逆转录病毒载体MDH1-PGK-GFP2. 0 (该载体为一种常规商品化质粒载 体，详见网站 http://www.addgene.org/11375/和引用文献（MicroRNAs modulate hematopoietic lineage differentiation. Science, 2004, 303(5654) :83_6)和对应的 感染人细胞系的辅助载体pCL-Eco (-种常规商品化质粒载体，详见网站http://www. addgene. org/12371/)，以及从人基因组中克隆到的miR-638基因序列，构建了 miR-638的 逆转录病毒表达载体MDHl-miR-638,构建逆转录病毒表达载体MDHl-miR-638所用到的引 物分别为：
[0028] MDH1-638-FP : 5 ' -AATATCTCGAGCCCGGGAGCAACGGCTACAGA-3 '，
[0029] MDH1-638-RP :5' -GAGTTGAATTCAATTAATTTTTATGGACAGCCCGAAAGAG-3'。
[0030] 构建上述逆转录病毒表达载体MDHl-miR-638的方法，包括如下步骤：
[0031] l)miR-638基因片段扩增：利用上述设计的引物从人基因组序列中克隆得到 miR-638的表达基因片段；
[0032] 2)PCR产物凝胶电泳回收：参考武汉摩尔生物公司提供的试剂盒操作流程；
[0033] 3)PCR片段和载体的双酶切、回收、连接及转化：采用常规的分子生物学方法；
[0034] 4)阳性克隆的鉴定与测序：将筛选到的阳性克隆通过常规PCR和测序方法进行鉴 定。
[0035] 5)逆转录病毒包装、病毒滴度的检测及细胞感染：以MDH1-PGK-GFP2.0或 MDHl-miR-638和其辅助载体包装形成逆转录病毒，用以感染HL-60细胞，以筛选稳转细胞 系。
[0036] 上述逆转录病毒表达载体MDHl-miR-638构建成功后，将该载体和相应的对照载 体MDH1-PGK-GFP2. 0转染白血病细胞HL-60,通过大量筛选和实验验证分析工作，筛选到 分别稳定表达相应载体及miR-638的HL-60亚细胞株：稳转细胞HL-60-MDHl-Vector和 HL-60-MDHl-miR-638。将上述表达载体转染白血病细胞或原代AML患者外周血原始细胞 中，用于miR-638基因的稳定过表达。
[0037] 利用商业化miR-638的模拟物和抑制剂可以在细胞中分别瞬时过表达miR-638和 抑制miR-638的表达；构建的逆转录病毒表达载体MDHl-miR-638具有在肿瘤细胞中特异性 高表达miR-638基因的能力，这为进一步研究miR-638基因的生物学功能提供更加可靠和 便捷的研究手段，同时为针对miR-638基因的相关基因治疗药物的开发提供了可能。
[0038] 上述结果表明miR-638在AML患者中的异常表达与白血病的发生间存在关联，上 调miR-638表达能促进原始细胞在诱导剂作用下的单核/巨噬或粒系分化。而加快AML患 者外周血中的原始细胞的细胞分化进程，促进那些处于低分化或去分化状态的恶性肿瘤细 胞向成熟细胞方向分化，重建正常血细胞表型，恢复正常造血功能，并最终促进恶性白血病 细胞凋亡和抑制增殖，从而达到治愈白血病的目的。即miR-638的表达能够促进恶性白血 病细胞凋亡和抑制增殖，促进恶性肿瘤细胞向正常血细胞分化，恢复正常造血功能。
[0039] 上述结果表明，通过上调miR-638的表达能够达到治疗急性髓系白血病的目的； miR-638在髓系细胞中的表达量也能够用于诊断髓系白血病的发生。
[0040] 基于上述结果,本发明提供的miR-638在抗急性髓系白血病中的应用如下：
[0041] miR-638在制备抗急性髓系白血病药物中的应用。
[0042] miR-638的模拟物在制备抗急性髓系白血病药物中的应用。
[0043] miR-638的表达载体在制备抗急性髓系白血病药物中的应用。
[0044] 一种抗急性髓系白血病药物，包含miR-638。
[0045] 一种抗急性髓系白血病药物，包含miR-638的模拟物。
[0046] 一种抗急性髓系白血病药物，包含miR-638的表达载体。
[0047] 所述的miR-638的表达载体可以为上述构建的逆转录病毒表达载体 MDHl-miR-638。
[0048] miR-638在制备急性髓系白血病的诊断试剂中的应用。
[0049] 本发明首次发现了 miR-638在髓系造血分化中的调控作用，以及miR-638与急性 髓系白血病发生的关系，即通过上调miR-638的表达能够达到治疗急性髓系白血病的目 的。根据miR-638功能，可将其应用于制备抗急性髓系白血病的药物，为开发新的抗AML疾 病的药物或诊断试剂提供了重要的基础。
【专利附图】
【附图说明】
[0050] 图1实时荧光定量PCR检测miR-638在人血液谱系特异性细胞中的相对表达情 况。
[0051] 图2miR-638在白血病细胞和急性髓系白血病病人中的表达水平检测。A、6例健康 人外周血MNC与白血病细胞系THP-I、HL-60、NB4和U937中miR-638表达水平比较，p〈0. 05 ; 每组实验重复三次,结果显示为"均值土SD" ;B、13例健康人与9例急性髓系白血病（AML) 病人外周血单个核细胞中miR-638表达水平比较，结果显示为箱线图。
[0052] 图3瑞氏吉姆萨染色法分析THP-I和HL-60分别诱导向单核/巨噬系和粒系分化。 图示诱导Oh和诱导24h、48h、72h和96h时细胞的形态变化，其中以诱导96h时间点用黑色 箭头指示了典型的单核/巨噬系和粒系分化的细胞形态；图片中细胞放大倍数为250倍。
[0053] 图4miR_638在白血病细胞系体外诱导分化过程中表达上调。流式细胞术检测髓 系分化指标（单核/巨噬细系：⑶14 ;粒系：⑶11b，A?D，右侧）表达和实时定量PCR检测 (A?D，左侧）。每组实验重复三次，miR-638表达柱状图结果显示为"均值土SD"。）
[0054] 图5miR_638在原发白血病细胞体外诱导分化过程中表达上调。每组实验重复三 次，miR-638表达柱状图结果显示为"均值土SD"。
[0055] 图6半定量和实时荧光定量PCR检测转染后THP-I和HL-60细胞内miR-638表 达。A、B图中表示模拟物对照；C、D图中表示抑制剂对照，inh.表示抑制剂；每组实验重复 三次，miR-638表达柱状图结果显示为"均值土SD"。
[0056] 图7流式分析和统计调节THP-I和HL-60细胞内miR-638表达对诱导髓系分化的 影响；图示中流式检测结果，每一小图中"右边的峰图"表示细胞经对应的诱导剂诱导，"左 边的峰图"表示细胞经诱导剂对照（0. 1% DMSO)诱导。A、B图中表示模拟物对照；C、D图 中表示抑制剂对照，Inh.为抑制剂的缩写。每组实验重复三次，⑶14、⑶Ilb表达柱状图结 果显示为"均值土SD"。）
[0057] 图8瑞氏吉姆萨复合染色法检测细胞形态学的变化。图片中细胞放大倍数为250 倍，黑色箭头指示为分化较为典型的细胞。
[0058] 图9实时荧光定量PCR检测模拟物转染后诱导THP-I和HL-60细胞髓系特异基因 转录本的表达。miR-638表示miR-638模拟物。林，p〈0. 01 ;GAPDH为荧光定量的内参基因。
[0059] 图10实时定量PCR检测抑制剂转染后诱导THP-I和HL-60细胞髓系特异基因转 录本的表达。miR-638(inh.)表示miR-638抑制剂。林，p〈0. 01;GAPDH为内参基因。每组 实验重复三次，结果显示为"均值土 SD"。
[0060] 图11过表达miR-638影响HL-60细胞增殖。A、转染miR-638模拟物（或对照） 后，HL-60生长曲线绘制（细胞计数）；B、转染miR-638模拟物（或对照）并添加 PM诱导 剂后，HL-60生长曲线的绘制（CCK-8检测）。图中数据显示为"均值土SD"。
[0061] 图12miR-638稳转细胞（HL-60)的构建。A、流式细胞术分析分选后病毒转导阳性 细胞的比例；B、实时荧光定量PCR检测稳转细胞中miR-638表达水平。图中数据显示为"均 值土 SD"。
[0062] 图13miR-638稳转细胞（HL-60)增殖情况分析。A、B :诱导剂（PMA和ATRA)作用 下，稳转细胞生长曲线绘制。图中数据显示为"均值土SD"。
[0063] 图14miR-638抑制HL-60细胞的软琼脂克隆形成能力。A、miR-638 (或对照）稳 转细胞在软琼脂中形成的克隆图，每组设置两组重复；B、对克隆数目进行统计分析，图中数 据显示为"均值土 SD"。#，p〈0. 01。
[0064] 图15过表达miR-638促进原发性AML细胞在诱导剂作用下的髓系分化。A、实时 荧光定量PCR检测转染24h后细胞中miR-638的表达水平；B和C、流式细胞术分析诱导髓 系分化特异标志物⑶14和⑶Ilb的表达。
【具体实施方式】
[0065] 下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的描述。应理解，这些实施例仅用于 说明本发明而不用于限制本发明的范围。
[0066] 下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规实验条件，如 Sambrook 等编，《分子克隆：实验室手册》（New York :Cold Spring Harbor laboratory Press，2002)中所述的实验条件，或按照制造厂商所建议的实验条件。
[0067] 实施例lmiR-638在不同来源血细胞中的表达调查
[0068] 为了探索miR-638是否涉及到正常造血过程和白血病发生发展过程，本实施例分 离并检测了 miR-638在健康人外周血的髓系、淋巴系以及造血多能干细胞群落中的本底表 达水平；以及健康人对照外周血单个核细胞、多种白血病细胞系和AML患者外周血原始细 胞中的表达水平。
[0069] AML患者外周血和脐带血取自武汉大学中南医院、华中科技大学附属同济医院和 江苏省中医院，每份样本均得到患者知情同意以及相应的医学伦理委员会批准。白血病细 胞系包括HL-60、THP-I、NB4细胞（均购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库），以 及U937细胞。
[0070] 从外周血样本中分离单个核细胞（mononuclear cells, MNCs)的方法是采用密 度梯度离心法。其原理在于Ficoll-paque TM Plus分离液（美国GE Healthcare公司 产品）的密度为I. 〇77g/mL，MNCs的密度大约在1. 076?I. 090g/mL之间，而红细胞密度 为I. 093g/mL，粒细胞密度为I. 092g/mL，它们密度都大于MNCs，所以用与MNCs密度相近的 Ficoll-paque TM Plus,再结合密度梯度离心可以分离得到比较纯的单个核细胞。具体步 骤参照商品化试剂盒的详细说明。
[0071] 一、miR-638在造血细胞不同分化发育阶段以及造血细胞不同谱系间的表达调查
[0072] 使用加拿大StemCell公司的⑶34+分选试剂盒采用磁珠正向吸附法从单个核细 胞中分离纯化CD34阳性细胞。其原理是：使用偶联有抗CD34抗体的磁珠颗粒，结合强力磁 极将阳性细胞从细胞群体中分离出来。根据StemCell公司实验手册，所用起始MNCs来源 于脐带血，因为其含有较高比例的CD34阳性细胞。具体步骤参照试剂盒的详细说明。
[0073] 通过磁珠正向分离法在健康人脐带血的单个核细胞中得到纯度在90%以上的 CD34+细胞。将通过密度梯度离心的方法得到了健康人外周血中的单个核细胞（PBMC)采 用流式细胞术分选，得到了高纯度的⑶14+和⑶Ilb+的髓系细胞亚群和⑶3 e +和⑶45R+ 的淋巴细胞亚群（流式细胞分析采用的荧光标记抗体：FITC-⑶lib、APC-⑶lib、PE-⑶14、 FITC-CD14、FITC-CD45R、PE-CD3 e 和 APC-CD34 均购自 Biolegend 公司）。实时荧光定量 PCR检测miR-638 (miRNA 定量检测试剂盒Bulge-LoopTM miRNA qRT-PCR Kit，包括miR-638 检测引物和内参引物均购自广州锐博生物科技公司）在这些细胞中的表达水平显示（如图 I) :(l)miR-638在髓系细胞发育过程中表达水平显著上调（与⑶34+细胞相比，⑶Ilb+细 胞水平上调约10倍，而⑶14+细胞水平上调约30倍）；（2)与⑶34+细胞相比，miR-638在 淋巴细胞亚群中的表达水基本检测不到。这些结果表明miR-638可能在正常的髓系造血分 化中发挥作用。
[0074] 二、miR-638在健康人外周血单个核细胞、白血病细胞系以及AML患者样本中的表 达调查
[0075] 为了探索miR-638与白血病的相关性，本实施例检测了 miR-638在白血病细胞中 的表达。实时荧光定量PCR结果显示，与健康人的MNC比较，miR-638在4个被检测的白血 病细胞系中的表达水平都比较低，与正常人PBMCs存在显著差异（图2A)。另外，本实施例 还检测了从AML病人外周血分离获得了单个核细胞miR-638的表达水平。类似的，miR-638 在AML白血病病人外周血细胞中表达水平显著低于正常人（图2B)。结合miR-638在正常髓 系细胞中的高表达，这些结果表明miR-638的表达失调可能与白血病发生发展过程相关。
[0076] 实施例2miR-638在白血病细胞和AML患者外周血原始细胞的诱导分化过程中的 表达变化分析
[0077] -、miR-638在白血病细胞诱导分化过程中的表达变化分析
[0078] 为了进一步验证miR638与白血病发生发展的相关性，本实施例利用白血病细胞 体外分化的模型来分析miR-638的表达与白血病细胞分化的关系。HL-60和NB4细胞在全反 式维甲酸（ATRA)的处理下，可以向粒系成熟细胞分化；THP-I和HL-60细胞在佛波酯（PMA) 的诱导下，可以向单核细胞分化。通过瑞氏吉姆萨染色法观察白血病细胞分化时的细胞形 态变化。图3展示了 THP-I和HL-60分别在PM和ATRA的诱导下向单核细胞核和粒细胞 分化时的细胞形态变化，图示中分化的单核细胞与未诱导细胞相比，细胞核明显变小，核质 比也变小；分化成熟的粒系细胞不仅核质比变小，细胞核分成多个小叶。
[0079] 通过流式细胞术检测了细胞分化的程度（如图4)，表现为单核细胞特异性表面标 志物CD14和粒系细胞特异性表面标志物CDllb的峰随着诱导时间增加而明显向右偏移， 表明细胞逐渐分化成熟。随后，通过实时荧光定量PCR对3种细胞系分别向2个方向诱导 分化过程中miR-638的表达水平进行了检测。如图4所示，无论是在单核细胞还是在粒细 胞分化成熟的过程中，miR-638的表达水平都是持续上调的，尤其是HL-60由PMA诱导的末 期（96h)，miR-638表达水平相比诱导前上调有约90倍之多。这些发现与之前分析得到的 miR-638在髓系血细胞中特异高表达的现象是吻合的，也进一步提示miR-638很可能参与 正常髓系造血过程，其异常表达可能参与髓系白血病的发生。
[0080] 二、miR-638在AML患者外周血原始细胞的诱导分化过程中的表达变化分析
[0081] 此外，本实施例也将从AML(FAB-M1型）病人外周血中分离得到的单个核细胞（含 大量髓系前体母细胞）进行体外诱导分化，并检测了 miR-638的表达水平。如图5所示，白 血病细胞经PMA诱导向单核细胞分化和ATRA诱导向粒系分化时，miR-638表达水平显著上 调，而用对照（Vehicle，即0. 1 % DMSO溶液）试剂处理的细胞表达水平基本不变。该结果 与在白血病细胞系的诱导分化实验结果一致。
[0082] 从正常的或异常的造血过程以及体外诱导分化等实验结论可以得出miR-638很 可能是人髓系造血分化过程中一个重要的调控因子，其表达异常可能参与髓系白血病的发 生。
[0083] 实施例3miR_638在白血病细胞中的表达变化显著影响细胞分化进程
[0084] 为了研究miR-638对髓系白血病细胞系体外诱导分化的影响，本实施例通过瞬 时转染miRNA模拟物（mimics)和抑制剂（inhibitors)及其对照的方法，人为调节细胞 (THP-1 和 HL-60)内 miR-638 的表达水平。miRNA 模拟物（mimics)和抑制剂（inhibitors) 及各自对照均购自中国广东广州市锐博（Ribio)生物技术有限公司，模拟物序列与成熟 miR-638的序列完全一致，抑制剂序列与成熟miR-638的序列完全互补配对。通过使用 IfectRNA Plus转染试剂（PharmInova公司产品）和BLOCK-iT荧光分子（FITC)标记寡核 苷酸（Invitrogen公司产品），初步观察这些寡核苷酸的转染效率均达到了 90%以上。
[0085] 通过半定量（所使用检测miR-638和内参引物序列与实施例1所述的荧光定量 PCR引物序列一致）和荧光定量PCR的方法（所使用的方法与实施例1 一致）对转染细胞 系中miR-638的表达水平进行了定性和定量的分析。如图6所示，THP-I和HL-60细胞在转 染miR-638mimics24h之后，细胞内miR-638表达水平得到了显著的提高；而转染miR-638 的抑制剂，其表达水平显著降低。
[0086] 通过流式细胞术分析和统计了调节THP-I和HL-60细胞内miR-638表达对诱导髓 系分化的影响，结果见图7。如图7A所示，在THP-I细胞中，与转染模拟物对照相比，PM诱 导72小时后，转染miR-638mimic S的单核细胞特异表达的表面标志物⑶14的表达水平明 显上调；模拟物对照组分化水平为23. 8 %，而过表达miR-638的实验组细胞⑶14表达水平 为34.6%。图7B左侧对流式的三次重复实验进行统计，发现二者之间存在显著差异。相似 地，在HL-60细胞中，ATRA诱导向粒系分化时，过表达miR-638能显著提高粒系特异表面标 志物⑶Ilb的表达，对照组分化水平为29. 4%，过表达miR-638则达到41. 4%。图7B右侧 对流式细胞分析的三次重复实验进行统计，发现二者之间也存在显著差异。
[0087] 同样地，在转染miRNA的抑制剂时（如图7C)，THP-I由PM诱导的单核细胞分化被 显著抑制，其分化比例由对照组的37. 6%下降到实验组的27. 3%。相似的结果也在HL-60 由ATRA诱导向粒系分化时发现，抑制miR-638的表达水平后分化比例由对照组的30. 5% 下降到实验组的18.3%。图7D对抑制剂作用下的实验结果进行了统计分析，结果表明在 THP-I和HL-60细胞中，抑制miR-638表达能显著抑制诱导剂作用下的髓系分化表面标志物 的表达。
[0088] 同时通过瑞氏吉姆萨复合染色法对诱导分化末期的细胞进行了细胞形态学的观 察，如图8所示，染色后能清楚地显示细胞核和细胞质的状态。如图8A未分化的THP-I细胞 (左上角）核质比较大,细胞核基本占据整个细胞,细胞质很少；而经过PM诱导细胞质比 例增加，细胞核明显变小，此为分化的典型特征。与右上角转染miRNA模拟物对照的THP-I 细胞相比，如黑色箭头所示，过表达miR-638后更多比例的细胞呈现分化状态。同样地，如 图8B，HL-60在未分化时，细胞核几乎占据整个细胞；分化后细胞核出现小叶（箭头所示） 或呈现马蹄状。与右上角转染miRNA模拟物对照的HL-60细胞相比，过表达miR-638后更 多比例的细胞呈现分化状态（右下角）。
[0089] 下调miR-638的结果与过表达恰好完全相反，抑制miR-638的表达显著的抑制了 THP-I和HL-60在PMA或ATRA诱导剂作用下的髓系分化。结果如图8C，与左上角转染miRNA 模拟物对照的THP-I细胞相比，如黑色箭头所示，抑制miR-638表达后的呈现单核系分化状 态的细胞比例明显降低；相似的在HL-60细胞中，抑制miR-638表达导致ATRA诱导的粒系 分化细胞比例比对照组更低（如图8D)。
[0090] 此外，通过实时荧光定量PCR对诱导72小时后细胞内髓系特异性基因表达情况进 行了检测（所使用的各对荧光定量PCR引物序列如表1所示，荧光定量PCR方法与实施例1 所述一致）。对髓系分化的两个方向，分别选取了常见的几个特异性基因作为分化指标，如 单核/巨噬系分化过程中⑶14、ITGAM(即⑶lib)和CSFlR表达水平明显上调；而粒系分化 过程中，ITGAM和CSF3R的表达水平上调的同时MPO表达水平却出现下调。MPO为髓系祖细 胞或前提细胞特异表达的基因，在向粒系分化时其表达水平会逐渐下调。如图9A所示，与 转染对照相比，在诱导剂PMA作用下，过表达miR-638能显著提升⑶14、ITGAM和CSFlR三 个髓系特异性基因 mRNA的表达水平；相似的结果也在HL-60诱导向粒系分化时发现（如图 9B)，与转染对照相比，在诱导剂ATRA作用下，过表达miR-638显著提升ITGAM和CSF3R的 表达水平。而MPO这一髓系前体细胞特异表达的基因，在miR-638过表达的细胞中下降的 水平比对照细胞更为明显。
[0091] 表1实时荧光定量PCR引物列表
[0092]
【权利要求】
1. miR-638在制备抗急性髓系白血病药物中的应用。 2. miR-638的模拟物在制备抗急性髓系白血病药物中的应用。 3. miR-638的表达载体在制备抗急性髓系白血病药物中的应用。
4. 一种抗急性髓系白血病药物，其特征在于：包含miR-638。
5. -种抗急性髓系白血病药物，其特征在于：包含miR-638的模拟物。
6. -种抗急性髓系白血病药物，其特征在于：包含miR-638的表达载体。
7. 根据权利要求3所述的应用或权利要求6所述的药物，其特征在于：所述的miR-638 的表达载体的骨架载体为MDH1-PGK-GFP 2.0。 8. miR-638在制备急性髓系白血病的诊断试剂中的应用。
【文档编号】A61P35/02GK104208723SQ201410466367
【公开日】2014年12月17日 申请日期:2014年9月12日 优先权日:2014年9月12日
【发明者】李文鑫, 郭明雄, 黄赞, 林义 申请人:武汉大学