一种酶响应的二元超分子纳米粒子及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】一种酶响应的二元超分子纳米粒子，其构筑单元以磺化环糊精为主体，以鱼精蛋白为客体，通过主-客体包结配位作用构筑超分子组装体；其制备方法是，将磺化环糊精和鱼精蛋白溶解于水中，均匀混合后得到酶响应的二元超分子纳米粒子溶液；所述二元超分子纳米粒子用于将胰蛋白酶8-羟基芘-1,3,6-三磺酸三钠盐负载到二元超分子纳米粒子溶液中并实现可控释放。本发明的优点是：该纳米超分子纳米粒子，制备方法简便，主、客体原料用量少；制备的超分子纳米粒子具有良好的生物相容性和稳定性，对胰蛋白酶具有良好的选择响应性，为负载特定药物用于治疗疾病等创造有利的条件。
【专利说明】一种酶响应的二元超分子纳米粒子及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明属于纳米超分子材料【技术领域】，特别是一种酶响应的二元超分子纳米粒子及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002]近年来，刺激响应纳米粒子在生物技术、医疗诊断、药物传递等领域备受关注，参见:1)八.11161161-, 0.匕 0181-1611.泛挪.2002, 102, 727 - 757； 2) 0.1.^1-16261118, 1.0.^8^01168, 了.八.八.1 ￡161118118, 了.了.1.1.1188611，八.￡.尺0册11，尺.了.1.^011:6.0/10111.处厂.2005，105, 1445 - 1489； 3) 1 6110, 0.820^8.紋0116111.1^08.2003, 36，335 - 341。刺激响应纳米粒子的药物/基因传递体系由于可以将负载物在特定位点靶向地进行释放而成为其中的一个研究热点，因为这不但可以提高负载物的药效，而且可以降低其毒副作用。目前报道的刺激响应纳米粒子大多是对外界光、电、热和邱等刺激进行响应的体系，参见:1)1.166, 8.-1.166, 1.-?.了匕叩.工細.泛挪.500.2004, 126, 12724-12725； 2) 0.胃&叩，011611,只.XII，2.胃&叩，1211811?.祖七?31\ 2010，22，2553 — 2555； 3)六.~即011，1.^816111:1111, 111-6111,1.1111161-, 了.八.^11^611.舰.^61-.2004, 3, 183 - 189； 4) ￡.1(1111, 0.1(1111,只.了.166, 8.？ 8111, 861^8^818111, 1 11111, 0.6.1(.1(1111.0116111., I壯.2010, 49，4405 - 4408。但是对于酶信号进行响应的纳米粒子体系还不是很多见，参见:0.胃&叩，01611，2.胃&叩，1 211811?.如供界.0116111.//7(.2010, 49，8612 - 8615。酶不仅具有很高的响应速率，而且是高度生物相容的，并且具有高度的选择性，此外，很多疾病都与酶的非正常活性相关，参见:2.6.118118, 8.父口.^00.016111 1^68.2008, 41, 315 - 326。因此，设计酶响应的超分子纳米粒子体系具有重大意义和广阔应用前景。
[0003]然而，酶响应位点的引入通常需要复杂和耗时的共价键合成，这不但提高了制备成本，而且还会将有机溶剂和毒性试剂在合成过程中引入到囊泡体系从而降低了其生物兼容性。超分子手段是除共价键手段外的另一种构筑刺激响应囊泡的方法，参见:1)1.1矶8，扎 XII，1 211811?.紐3 七?31\ 2009，21, 2849 - 2864； 2) 10.胃&叩.泛挪.500.2011, 40, 94 - 101。刺激响应位点可以通过非共价键相互作用的方式引入到囊泡体系中来，从而避免了共价键的化学合成。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是针对上述技术分析和存在问题，提供一种酶响应的二元超分子纳米粒子及其制备方法和应用，该超分子纳米粒子基于磺化环糊精和鱼精蛋白二元超分子组装的酶调控纳米粒子，该二元超分子纳米粒子具有良好的生物相容性、稳定性和对胰蛋白酶选择性响应性，并可以被细胞吸收，在包结药物、对药物可控释放等方面的潜在应用价值。
[0005]本发明的技术方案:
一种酶响应的二元超分子纳米粒子，其构筑单元以磺化环糊精(SCD)为主体，以鱼精蛋白(PT)为客体，通过主-客体包结配位作用构筑超分子组装体。
[0006]一种所述酶响应的二元超分子纳米粒子的制备方法，将磺化环糊精和鱼精蛋白溶解于水中，均匀混合后得到酶响应的二元超分子纳米粒子溶液；所述酶响应的二元超分子纳米粒子溶液中磺化环糊精的浓度为18 mmol/mL，鱼精蛋白的浓度为0.02 mg/mL。
[0007]—种所述酶响应的二元超分子纳米粒子的应用，将模型分子胰蛋白酶8-羟基芘-1，3，6-三磺酸三钠盐(HPTS)负载到二元超分子纳米粒子溶液中并实现可控释放，负载方法是:将8-羟基芘-1，3，6-三磺酸三钠盐(HPTS)滴加到含有磺化环糊精(S⑶)和鱼精蛋白(PT)的二元超分子纳米粒子溶液中直至纳米粒子完全解聚，溶液中8-羟基芘-1，3，6-三磺酸三钠盐、磺化环糊精和鱼精蛋白的浓度分别为0.0lmM、18 mmol/mL和0.02 mg/mL，然后将溶液用截留分子量为3500透析袋透析纯化即可。
[0008]本发明的优点是:该基于磺化环糊精和鱼精蛋白二元超分子组装构筑的纳米超分子纳米粒子，制备方法简便，主、客体原料用量少；制备的超分子纳米粒子生物相容且具有很好的稳定性，对胰蛋白酶具有良好的选择响应性，可以负载模型分子HPTS，负载HPTS后的纳米粒子对胰蛋白酶具有高选择性并且释放于胰蛋白酶靶向位点，为负载特定药物用于治疗疾病等创造有利的条件。
【专利附图】
【附图说明】
[0009]图1为鱼精蛋白(PT)浓度为0.05mg/mL时，主体磺化环糊精(S⑶)的临界聚集浓度图。
[0010]图2为磺化环糊精(S⑶)浓度为0.018 mmol/mL时，客体鱼精蛋白(PT)的临界聚集浓度图。
[0011]图3为该二元超分子纳米粒子的动态光散射图。
[0012]图4为该二元超分子纳米粒子的高分辨透射电子显微镜图。
[0013]图5为该二元超分子纳米粒子的原子力显微镜图。
[0014]图6为该二元超分子纳米粒子的ZETA电位图。
[0015]图7为该二元超分子纳米粒子450 nm波长处透射率随时间变化的曲线图。
[0016]图8为该二元超分子纳米粒子中加入0.2 mg/mL胰蛋白酶导致体系在450 nm处的透过与加入胰蛋白酶之前相比的变化图。
[0017]图9为该二元超分子纳米粒子中加入0.2 mg/mL胰蛋白酶五小时后的高分辨透射电子显微镜图。
[0018]图10为HPTS随时间释放曲线图，分别为负载有HPTS的该二元超分子纳米粒子随时间释放出HPTS的百分率；负载有HPTS的该二元超分子纳米粒子中加入0.2 mg/mL胰蛋白酶(trypsin)溶液后溶液释放出HPTS的百分率随时间变化图；负载有HPTS的该二元超分子纳米粒子中加入0.5 U/mL 丁酰胆碱酯酶(BChE)溶液后溶液释放出HPTS的百分率随时间变化图。
[0019]图11为该二元超分子纳米粒子中加入0.2 mg/mL经过在沸水中煮I小时的死胰蛋白酶导致体系在450nm处的透过的改变值，其中Oh处的值代表加入死酶之前体系在450nm处的透过值，111、211、311、411、511处的值分别代表加入死酶111、211、311、41511后体系在450=111处的透过值。
[0020]图12为该二元超分子纳米粒子中加入0.5 葡萄糖氧化酶((^^)导致的体系在45011111处的透过的改变值，其中011处的值代表加入⑶X之前体系在45011111处的透过值，111、211、311、411、511处的值分别代表加入⑶X 11213141511后体系在450110处的透过值。图12为在该二元超分子纳米粒子中加入0.5 丁酰胆碱酯酶(8(^2)导致的体系透过随时间变化的曲线图。
[0021]图13为往该二元超分子纳米粒子体系中加入0.5 丁酰胆碱酯酶(8(^2)导致体系在45011111处的透过的改变值，其中011处的值代表加入8012之前体系在45011111处的透过值，111、211、311、411、511处的值分别代表加入8012 11213141511后体系在4501^处的透过值。
【具体实施方式】
[0022]实施例:
一种酶调控的二元超分子纳米粒子，其构筑单元以磺化环糊精(30))为主体，以鱼精蛋白$1)为客体，通过主-客体包结配位作用构筑超分子组装体。
[0023]一种所述酶响应的二元超分子纳米粒子的制备方法，将磺化环糊精和鱼精蛋白溶解于水中，均匀混合后得到酶响应的二元超分子纳米粒子溶液；所述酶响应的二元超分子纳米粒子溶液中磺化环糊精的浓度为18臟01?匕鱼精蛋白的浓度为0.02呢/此。
[0024]图1为鱼精蛋白$10浓度为0.05^1时，主体磺化环糊精(3⑶)的临界聚集浓度图。图中表明:主体磺化环糊精(3⑶)的临界聚集浓度为0.010臟01^1匕
[0025]图2为磺化环糊精(3⑶)浓度为0.018臟01^1[时，客体鱼精蛋白(户丁)的临界聚集浓度图。图中表明:鱼精蛋白(冗)的临界聚集浓度为0.02 1118/1111，从而得到磺化环糊精和鱼精蛋白的最佳聚集浓度比。
[0026]该二元超分子纳米粒子的粒径和形貌:
分别通过动态光散射、高分辨透射电子显微镜、原子力显微镜以及221八电位进行表征。
[0027]图3为磺化环糊精和鱼精蛋白超分子组装的酶响应纳米粒子的动态光散射图，图中显示:纳米粒子平均粒径为190.511111。
[0028]图4为磺化环糊精和鱼精蛋白超分子组装的酶响应纳米粒子的高分辨透射电子显微镜图；图5为磺化环糊精和鱼精蛋白超分子组装的酶响应纳米粒子的原子力显微镜图；图6为磺化环糊精和鱼精蛋白超分子组装的纳米粒子的221八电位图，图中显示:纳米粒子表面电位为+4.94 ―。
[0029]图7为构筑的磺化环糊精和鱼精蛋白组装的超分子纳米粒子体系450 11111波长处透射率随时间变化的曲线图，图中显示:该二元超分子纳米粒子组装体在450 波长处的透光率随时间基本不发生变化，表明该超分子纳米粒子具有很好的稳定性。
[0030]所述酶响应的二元超分子纳米粒子的应用，将模型分子胰蛋白酶8-羟基芘-1，3，6-三磺酸三钠盐负载到二元超分子纳米粒子溶液中并实现可控释放，负载方法是:将8-羟基芘-1，3，6-三磺酸三钠盐滴加到含有磺化环糊精(3⑶)和鱼精蛋白(PT)的二元超分子纳米粒子溶液中直至纳米粒子完全解聚，溶液中8-羟基芘-1，3，6-三磺酸三钠盐、磺化环糊精和鱼精蛋白的浓度分别为0.0lmM、18 mmol/mL和0.02 mg/mL，然后将溶液用截留分子量为3500透析袋透析纯化即可。
[0031]该二元超分子纳米粒子的胰蛋白酶高选择相应性的实验验证:
图8为往构筑的磺化环糊精和鱼精蛋白组装的超分子纳米粒子体系中加入0.2 mg/mL胰蛋白酶导致体系透过随时间变化的曲线图，图中表明:在超分子纳米粒子溶液中加入胰蛋白酶导致其在450 nm波长处透光率升高，五小时后透光率达到94%以上，证明加入的胰蛋白酶可以使纳米粒子随时间逐渐完全解聚。
[0032]图9为往构筑的磺化环糊精和鱼精蛋白组装的超分子纳米粒子体系中加入0.2mg/mL胰蛋白酶五小时后的高分辨透射电子显微镜图，也证实了纳米粒子的完全解聚。
[0033]模型分子HPTS负载实验:
HPTS全称为8-羟基芘-1，3，6-三磺酸三钠盐，是一种亲水性的具有荧光的分子，此工作中以HPTS为模型分子，负载在磺化环糊精和鱼精蛋白超分子组装的纳米粒子内部，向负载有HPTS的纳米粒子体系中加入胰蛋白酶可以实现HPTS的释放。
[0034]图10为HPTS随时间释放曲线图，分别为负载有HPTS的磺化环糊精和鱼精蛋白超分子组装的纳米粒子随时间释放出HPTS的百分率；往负载有HPTS的磺化环糊精和鱼精蛋白超分子组装的纳米粒子中加入0.2 mg/mL胰蛋白酶溶液后溶液释放出HPTS的百分率随时间变化图；往负载有HPTS的磺化环糊精和鱼精蛋白超分子组装的纳米粒子中加入0.5U/mL丁酰胆碱酯酶溶液后溶液释放出HPTS的百分率随时间变化图；从图13可以看出胰蛋白酶可以使负载在纳米粒子内部的HPTS被释放出来，随着时间推移，释放率可以达到80%以上。以上实验结果表明，此酶响应纳米粒子可以用于负载药物，并且可以在胰蛋白酶分泌过多部位将药物可控释放，此发明具有重要应用价值。
[0035]对比试验:
图11为往构筑的磺化环糊精和鱼精蛋白组装的超分子纳米粒子体系中加入0.2 mg/mL经过在沸水中煮I小时的死胰蛋白酶导致体系透过随时间变化的曲线图，可以看出加入失活的胰蛋白酶随着时间溶液在450 nm处的透过并没有发生明显变化，表明在实验8中引起纳米粒子解聚的主要原因即为胰蛋白酶的活性导致。
[0036]图12为往构筑的磺化环糊精和鱼精蛋白组装的超分子纳米粒子体系中加入0.5U/mL葡萄糖氧化酶(GOx)导致的体系透过随时间变化的曲线图，可以看出溶液在450 nm处的透过并没有因为葡萄糖氧化酶的加入而发生明显变化。
[0037]图13为往构筑的磺化环糊精和鱼精蛋白组装的超分子纳米粒子体系中加入0.5U/mL 丁酰胆碱酯酶(BChE)导致的体系透过随时间变化的曲线图，也可以看出溶液在450nm处的透过并没有因为葡萄糖氧化酶的加入而发生明显变化。以上两个实验表明此酶响应的纳米粒子对于胰蛋白酶具有专一响应的特点，其并不会因为这些其他类型的酶的加入而解聚。
【权利要求】
1.一种酶响应的二元超分子纳米粒子，其特征在于:构筑单元以磺化环糊精(SCD)为主体，以鱼精蛋白(PT)为客体，通过主-客体包结配位作用构筑超分子组装体。
2.一种如权利要求1所述酶响应的二元超分子纳米粒子的制备方法，其特征在于:将磺化环糊精和鱼精蛋白溶解于水中，均匀混合后得到酶响应的二元超分子纳米粒子溶液；所述酶响应的二元超分子纳米粒子溶液中磺化环糊精的浓度为18 mmol/mL,鱼精蛋白的浓度为 0.02 mg/mL。
3.—种如权利要求1所述酶响应的二元超分子纳米粒子的应用，其特征在于:将模型分子胰蛋白酶8-羟基芘-1，3，6-三磺酸三钠盐(HPTS)负载到二元超分子纳米粒子溶液中并实现可控释放，负载方法是:将8-羟基芘-1，3，6-三磺酸三钠盐(HPTS)滴加到含有磺化环糊精(S⑶)和鱼精蛋白(PT)的二元超分子纳米粒子溶液中直至纳米粒子完全解聚，溶液中8-羟基芘-1，3，6-三磺酸三钠盐、磺化环糊精和鱼精蛋白的浓度分别为0.01mM、18mmol/mL和0.02 mg/mL,然后将溶液用截留分子量为3500透析袋透析纯化即可。
【文档编号】A61K47/42GK104288125SQ201410481473
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2014年9月21日 优先权日:2014年9月21日
【发明者】刘育, 侯小芳, 陈湧, 陈旭漫 申请人:南开大学