氧化还原敏感的透明质酸-多烯紫杉醇共轭物及制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种氧化还原敏感的透明质酸-多烯紫杉醇共轭物及制备方法，是通过以下制备方法制备得到的：将原料药与连接体混合，溶于有机溶剂，并加入缚酸剂，室温下搅拌，真空旋蒸除去有机溶剂。纯化后，将产物溶于适量有机溶剂，加入活化剂和脱水剂在室温下活化生成原料药酸酐活化酯。将载体溶于溶液中，加入活化剂和脱水剂搅拌活化。活化后，加入二硫键交联剂，透析，冻干后得产物。将载体交联产物溶于有机溶剂中。将原料药酸酐酯滴入载体溶液中，孵化一定时间后。透析，冻干得目标产物。本发明制得的共轭物，可有效提高多烯紫杉醇的溶解度，且具有较强的靶向性，其具有制备方法简单、成本低等优点。
【专利说明】氧化还原敏感的透明质酸-多烯紫杉醇共轭物及制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种氧化还原敏感的透明质酸-多烯紫杉醇共轭物及制备方法。
【背景技术】
[0002] 透明质酸（Hyaluronic acid, HA分子量：9. 7kDa)是一种粘多糖，有重要的生物功 能特性，比如稳定细胞外基质、调节细胞黏附性和流动性、干预细胞的增殖和分化。透明质 酸和其衍生物已经作为先进材料用于制药和生物医药领域的研究成熟。与透明质酸键合的 受体CD44和RHAMM在几种高新陈代谢的恶性肿瘤细胞表面过表达，使其在传递药物方面有 靶向性。由于其高的亲水性和多个可修饰的功能团，透明质酸-药物的共轭物已作为生物 材料应用于主动靶向的生物制剂。
[0003] 多烯紫杉醇（D〇cetaXel，DTX)是一种用于治疗卵巢、乳房、结肠、头、颈和非小细 胞肺癌很有效的应用于临床的化学疗法药物。当前的产品，泰素帝含有吐温-80/乙醇溶剂 来提高多烯紫杉醇的水溶性。然而，过敏性和一些与以吐温-80为基底的制剂有关的副作 用可能会在临床应用中发生。多烯紫杉醇与亲水性材料通过共价键结合形成共轭物的方式 传递药物已经在提高多烯紫杉醇的溶解性、提高药效、减少毒性方面日渐成熟。
[0004] 胶束（Micelles)是由疏水性的物质和亲水性的物质通过共价键结合得到的两亲 性的聚合物。一些胶束产品已经用于临床实践和临床前实验。
[0005] 二硫键（Disulfide bonds)又称S-S键，是2个-SH基被氧化而形成的-S-S-形式 的硫原子间的键。二硫键在氧化环境下稳定存在，而在细胞内特别是谷胱甘肽存在的还原 环境下通过硫醇二硫交换反应可断裂二硫键。由于细胞内谷胱甘肽内水平大约为2-10mM， 而细胞外谷胱甘肽水平大概为2-20 μ M，显著地差异使二硫键赋予胶束氧化还原敏感的特 性。
【发明内容】
[0006] 针对上述现有技术，本发明提供了一种氧化还原敏感的透明质酸-多烯紫杉醇共 轭物及制备方法，作为一种氧化还原敏感的胶束，多烯紫杉醇通过二硫键结合到透明质酸 骨架链上，从而产生氧化还原敏感特性。
[0007] 本发明是通过以下技术方案实现的：
[0008] -种氧化还原敏感的透明质酸-多烯紫杉醇共轭物，由以下重量份的原料制成： 原料药多烯紫杉醇20?80份，载体透明质酸3?20份，连接体5?95份，缚酸剂2?20 份，其中，
[0009] 所述连接体为具有二硫键的化合物，酸酐，羧酸，酰肼，胺中的任一种或两种以上 的混合。
[0010] 所述具有二硫键的化合物为胱胺、胱胺的盐酸盐，3, 3' -二硫代丙二酸、3, 3' -二 硫代丙亚氨酸二甲酯中的任一种或两种以上的混合。
[0011] 所述酸酐为丁二酸酐（琥珀酸酐），辛烯基琥珀酸酐，顺丁烯二酸酐、戊二酸酐中 的任一种或两种以上的混合。
[0012] 所述羧酸为丁二酸或3, 3' -二硫代丙二酸中的任一种或两种的混合。
[0013] 所述酰肼为己二酸二酰肼，间苯二甲酰肼、丁二酸二酰肼中的任一种或两种以上 的混合。
[0014] 所述胺为胱胺，乙二胺、乙二胺盐酸盐，碳二酰亚胺中的任一种或两种以上的混 合。
[0015] 所述脱水剂为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺、碳酰二亚胺盐酸盐中 的任一种或两种的混合。
[0016] 所述缚酸剂为4-二甲氨基吡啶、吡啶、三乙胺中的任一种或两种以上的混合。
[0017] 所述共轭物分散于水中形成的胶束粒径在100?500nm范围内。
[0018] 所述氧化还原敏感的透明质酸-多烯紫杉醇共轭物的制备方法，步骤如下：
[0019] (1)将原料药多烯紫杉醇与连接体混合溶于有机溶剂，加入缚酸剂，室温下搅拌反 应60?84小时（优选72小时），真空旋蒸除去有机溶剂，将产物溶于有机溶剂，加入活化 剂和脱水剂，在室温下活化生成原料药活化酯；
[0020] (2)将载体透明质酸溶于缓冲液或水中，加入活化剂和脱水剂搅拌活化；活化后， 加入连接体（优选有二硫键的化合物），透析，冻干后得载体交联产物，将载体交联产物溶 于有机溶剂中，得载体溶液；
[0021] (3)将原料药活化酯滴入载体溶液中，孵化4?48h后，透析，冻干，得目标产物。
[0022] 所述活化剂为N-羟基丁二酰亚胺，硫醇化N-羟基丁二酰亚胺，4-二甲氨基吡啶、 二环己基碳二亚胺中的任一种或两种以上的混合。
[0023] 所述有机溶剂为二氯甲烷，二甲基亚砜、N，N-二甲基甲酰胺，二甲基亚砜中的任一 种或两种以上的混合。
[0024] 所述缓冲液为PBS缓冲液（pH 7. 4)或MES缓冲液（pH 4. 75)。
[0025] 所述氧化还原敏感的透明质酸-多烯紫杉醇共轭物的另一种制备方法步骤如下：
[0026] (1)取原料药多烯紫杉醇，加入活化剂、缚酸剂、脱水剂、连接体，然后溶于有机溶 齐U，在氮气保护下反应；反应结束后，有机相用盐酸萃取，再用蒸馏水萃取，真空旋蒸除去有 机溶剂，得产物；
[0027] (2)上述产物溶于有机溶剂，加入活化剂、脱水剂和连接体，室温下反应8?12h， 得原料药活化酯；
[0028] (3)将载体透明质酸溶于缓冲液或水中，加入连接体，调整pH至2?7,然后加入 脱水剂，反应1小时，调整pH至8?12,结束反应；透析三天，冻干后得载体交联产物，将载 体交联产物溶于有机溶剂中，得载体溶液；或：将载体透明质酸溶于缓冲液或水中，加入碳 酸氢钠或氢氧化钠，调整PH至8?14,得载体溶液；
[0029] (4)将原料药活化酯滴入载体溶液中，孵化4?48h后，透析，冻干，得目标产物。
[0030] 所述活化剂为N-羟基丁二酰亚胺，硫醇化N-羟基丁二酰亚胺，4-二甲氨基吡啶、 二环己基碳二亚胺中的任一种或两种以上的混合。
[0031] 所述有机溶剂为二氯甲烷，二甲基亚砜、N，N-二甲基甲酰胺，二甲基亚砜中的任一 种或两种以上的混合。
[0032] 所述缓冲液为PBS缓冲液（pH 7. 4)或MES缓冲液（pH 4. 75)。
[0033] 本发明产生的有益效果：
[0034] 多烯紫杉醇水溶性差，现有的注射剂采用吐温-80和乙醇溶液作为混合溶媒，应 用时常引发严重的过敏反应，不利于临床用药，因而研发具有良好溶解性能的多烯紫杉醇 药物输送系统一直是研究的热点。多烯紫杉醇是高亲脂性的药物，键合到高亲水性的材料 上形成两亲性共轭物后在水溶液中容易形成胶束。因此，本发明研究的是具有高氧化还原 敏感性和稳定性多烯紫杉醇的一种新型的氧化还原敏感的靶向胶束制剂。该氧化还原敏感 的共轭物相比于非氧化还原敏感共轭物，显示了更强的细胞摄取作用。本发明的共轭物制 剂在4°C条件下储藏超过六个月显示出良好的稳定性。细胞毒性研究结果显示，氧化还原敏 感的共轭物相比于非氧化还原敏感共轭物，可明显提高多烯紫杉醇对MDA-MB-231细胞的 毒性。本发明的氧化还原敏感的多烯紫杉醇共轭物胶束制剂将来有望成为癌症治疗的新型 药物制剂。
[0035] 本发明的氧化还原敏感的透明质酸-多烯紫杉醇共轭物胶束制剂，可有效提高多 烯紫杉醇的溶解度，且具有较强的靶向性，其具有制备方法简单、成本低等优点。
【专利附图】
【附图说明】
[0036] 图1 :胱胺修饰的透明质酸（HA-CYS);
[0037] 图2 :通过二硫键连接的多烯紫杉醇-透明质酸共轭物质谱图（HA-ss-DTX);
[0038] 图3 :氧化还原敏感的透明质酸-多烯紫杉醇共轭物胶束制剂粒径图，其中，A图中 平均粒径为179. 5nm ;B图中平均粒径在237. 4nm ;
[0039] 图4:静脉注射多烯紫杉醇后血浆浓度对时间的曲线图，小鼠给予多烯紫杉醇 10mg/kg，三条曲线分别代表在吐温-80/乙醇中的多烯紫杉醇（方形），非氧化还原敏感的 胶束制剂（三角形）或者氧化还原敏感的胶束制剂（菱形）。
【具体实施方式】
[0040] 下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
[0041] 实施例1 :制备氧化还原敏感的透明质酸-多烯紫杉醇共轭物
[0042] 步骤如下：
[0043] 称取300mg多烯紫杉醇，与2mg琥珀酸酐混合，溶于4mL二氯甲烧，并加入60 μ L 吡啶，室温下搅拌72h，真空旋蒸（除去二氯甲烷）。纯化得200mg多烯紫杉醇琥珀酸酐衍 生物。将120mg多烯紫杉醇琥珀酸酐衍生物溶于4mL N，N-二甲基甲酰胺，加入45mg N-羟 基丁二酰亚胺和824mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐在室温下活化得 130mg多烯紫杉醇的琥珀酸酐活化酯。
[0044] 将3g透明质酸溶于ImL PBS缓冲液（pH 7.4)中，加入18mg 1-乙基-(3-二甲基 氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐和300mg硫醇化N-羟基丁二酰亚胺搅拌活化。活化后，加入 IOg胱胺盐酸盐，透析72h，冻干后得2. 2g透明质酸二硫键交联产物。将2g透明质酸二硫 键交联产物溶于2. OmL甲酰胺中，得透明质酸溶液，将多烯紫杉醇的琥珀酸酐活化酯滴入 透明质酸溶液中，搅拌孵化。透析，冻干即得目标产物。
[0045] 分别取上述制备的透明质酸二硫键交联产物和目标产物适量冻干粉，加入质谱仪 进行测定。结果如图1为透明质酸二硫键交联产物的质谱图，图2为目标产物的质谱图。
[0046] 实施例2 :制备氧化还原敏感的透明质酸-多烯紫杉醇共轭物
[0047] 步骤如下：
[0048] 称取270mg多烯紫杉醇，与14mg琥珀酸酐混合，溶于3mL二氯甲烷，并加入124 μ L 吡啶，室温下搅拌三天，真空旋蒸（除去二氯甲烷）。纯化得250mg多烯紫杉醇琥珀酸酐衍 生物。将200mg多烯紫杉醇琥珀酸酐衍生物溶于5mL N，N-二甲基甲酰胺，加入68mg N-羟 基丁二酰亚胺和24mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐在室温下活化得 230mg多烯紫杉醇的琥珀酸酐活化酯。
[0049] 将3. 2g透明质酸溶于4mL MES缓冲液（pH 4. 75)中，加入48mg 1-乙基-(3-二 甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐和27mg硫醇化N-羟基丁二酰亚胺搅拌活化。活化后， 加入IOg胱胺盐酸盐，透析72h，冻干后得3g透明质酸二硫键交联产物。将3g透明质酸二 硫键交联产物溶于4. 5mL甲酰胺中，得透明质酸溶液，将多烯紫杉醇的琥珀酸酐活化酯滴 入透明质酸溶液中，搅拌孵化。透析，冻干即得目标产物。
[0050] 实施例3 :制备氧化还原敏感的透明质酸-多烯紫杉醇共轭物
[0051] 步骤如下：
[0052] 称取34mg多烯紫杉醇，与12. 5mg琥珀酸酐混合，溶于2mL二甲基亚砜，并加入 0. 565mL批陡，室温下搅拌72h，真空旋蒸（除去二甲基亚砜）。纯化得30mg多烯紫杉醇琥拍 酸酐衍生物。将20mg多烯紫杉醇琥珀酸酐衍生物溶于5mL N，N-二甲基甲酰胺，加入23mg N-羟基丁二酰亚胺和76mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐在室温下活 化得25mg多烯紫杉醇的琥珀酸酐活化酯。
[0053] 将500mg透明质酸溶于IOmL MES缓冲液（pH 4.75)中，加入48mg 1-乙基-(3-二 甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐和27mg硫醇化N-羟基丁二酰亚胺搅拌活化。活化后， 用0. IM氢氧化钠将pH调至7. 4,然后加入2g胱胺盐酸盐，透析72h，冻干后得460mg透明 质酸二硫键交联产物。将430mg透明质酸二硫键交联产物溶于2. 3mL甲酰胺中，得透明质 酸溶液，将25mg多烯紫杉醇的琥珀酸酐活化酯滴入透明质酸溶液中，搅拌孵化。透析，冻干 即得目标产物。
[0054] 取上述制备的目标产物适量，超声处理制备胶束制剂，用动态光散射法测定其粒 度分布，界面电位分析仪测定胶束溶液的界面电位，结果如图3A所示，粒径在100?400nm 的范围内，电位在1?35mV范围内，分散性良好。
[0055] 实施例4 :制备氧化还原敏感的透明质酸-多烯紫杉醇共轭物
[0056] 步骤如下：
[0057] 称取25mg多烯紫杉醇，与6mg琥珀酸酐混合，溶于0· 2mL二氯甲烷，并加入8 μ L 吡啶，室温下搅拌三天，真空旋蒸（除去二氯甲烷）。纯化得18mg多烯紫杉醇琥珀酸酐衍 生物。将16mg多烯紫杉醇琥珀酸酐衍生物溶于8mL N，N-二甲基甲酰胺，加入13mg N-羟 基丁二酰亚胺和34mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐在室温下活化得 18mg多烯紫杉醇的琥珀酸酐活化酯。
[0058] 将200mg透明质酸溶于5mL MES缓冲液（pH 4.75)中，加入24mg 1-乙基-(3-二 甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐和15mg 4-二甲氨基吡啶搅拌活化。活化后，加入608mg 胱胺盐酸盐，透析三天，冻干后得145mg透明质酸二硫键交联产物。将透明质酸二硫键交联 产物溶于5mL甲酰胺中，得透明质酸溶液，将ISmg多烯紫杉醇的琥珀酸酐活化酯滴入透明 质酸溶液中，搅拌孵化。透析，冻干即得目标产物。
[0059] 实施例5 :制备氧化还原敏感的透明质酸-多烯紫杉醇共轭物
[0060] 步骤如下：
[0061] 称取30mg多烯紫杉醇，与12. 8mg辛烯基琥珀酸酐混合，溶于ImL二氯甲烷，并加 入45 μ L吡啶，室温下搅拌72h，真空旋蒸（除去二氯甲烷）。纯化得27mg多烯紫杉醇琥 珀酸酐衍生物。将产物溶于3mL N，N-二甲基甲酰胺，加入25. 5mg N-羟基丁二酰亚胺和 84. 5mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐在室温下活化得29mg多烯紫杉 醇的辛烯基琥珀酸酐活化酯。
[0062] 将34mg透明质酸溶于I. 22mL PBS缓冲液（pH 7. 4)中，加入8. 5mg 1-乙基-(3-二 甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐和40mg硫醇化N-羟基丁二酰亚胺搅拌活化。活化后， 加入96. 5mg胱胺盐酸盐，透析72h，冻干后得30mg透明质酸二硫键交联产物。将26mg透明 质酸二硫键交联产物溶于3mL甲酰胺中。将27mg多烯紫杉醇的辛烯基琥珀酸酐活化酯滴 入透明质酸溶液中，搅拌孵化。透析，冻干即得目标产物。
[0063] 实施例6 :制备氧化还原敏感的透明质酸-多烯紫杉醇共轭物
[0064] 步骤如下：
[0065] 称取38.8mg多烯紫杉醇，加入14.6mg 4-二甲氨基吡啶和120mg 1-乙基-(3-二 甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐，16. 8mg 3, 3' -二硫代丙二酸溶于2. 5mL二氯甲烷 (4-二甲氨基吡啶本身是缚酸剂和活化剂），混合物溶液加到三颈瓶中，在氮气保护下反应 60h。结束后，有机相用盐酸萃取三次（每次50mL)，蒸馏水萃取三次（每次50mL)，真空旋蒸 除去二氯甲烷得30mg多烯紫杉醇-二硫代丙二酸衍生物。将25mg多烯紫杉醇-二硫代丙二 酸衍生物溶于3.6mL二甲基亚砜中，加入45mg N-轻基丁二酰亚胺和78mg 1-乙基-(3-二 甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐在室温下反应12h得20g多烯紫杉醇的二硫代丙二酸酐 活化酯。
[0066] 将540mg透明质酸溶于IOmL水中，加入4. 5g 丁二酸二酰肼，反应物溶液的pH用 0. IM的盐酸调到6. 5,然后加入85mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐搅 拌活化，在此pH条件下反应1小时，加入0. IM的氢氧化钠溶液调节pH到9. 0结束反应。 透析72h，冻干后得490g透明质酸-丁二酸二酰肼产物。将400g透明质酸-丁二酸二酰 肼产物溶于16mL甲酰胺中，得透明质酸-己二酸二酰肼溶液，将450mg多烯紫杉醇的二硫 代丙二酸酐活化酯滴入透明质酸-己二酸二酰肼溶液中，搅拌孵化。透析，冻干即得目标产 物。
[0067] 实施例7 :制备氧化还原敏感的透明质酸-多烯紫杉醇共轭物
[0068] 步骤如下：
[0069] 称取40mg多烯紫杉醇，加入67mg 4-二甲氨基吡啶和120mg 1-乙基-(3-二甲基 氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐，4. 5mg 3, 3' -二硫代丙二酸溶于二氯甲烷（4-二甲氨基吡 啶本身是缚酸剂和活化剂），混合物溶液加到三颈瓶中，在氮气保护下反应60h。结束后，有 机相用盐酸萃取三次（每次50mL)，蒸馏水萃取三次（每次50mL)，真空旋蒸除去二氯甲烷。 产物溶于6. 5mL二甲基亚砜中，加入84mg N-轻基丁二酰亚胺和14mg 1-乙基-(3-二甲基 氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐在室温下反应12h得35mg多烯紫杉醇的二硫代丙二酸酐活 化酯。
[0070] 将340mg透明质酸溶于5mL水中，加入4.2g己二酸二酰。反应物溶液的pH用0· IM 的HCl调到6. 5,然后加入85mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐搅拌活 化。在此pH条件下反应1小时，加入0. INaOH调节pH到9. 0结束反应。透析三天，冻干 后得260mg透明质酸-丁二酸二酰肼产物。将240mg透明质酸-己二酸二酰肼产物溶13mL 甲酰胺中。将25mg多烯紫杉醇的二硫代丙二酸酐活化酯滴入透明质酸-己二酸二酰肼溶 液中，搅拌孵化。透析，冻干即得目标产物。
[0071] 实施例8 :制备氧化还原敏感的透明质酸-多烯紫杉醇共轭物
[0072] 步骤如下：称取56mg多烯紫杉醇，加入13mg 4-二甲氨基批陡和12mg 1-乙 基-(3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐，14. 6mg 3, 3' -二硫代丙二酸溶于二氯甲烷 (4-二甲氨基吡啶本身是缚酸剂和活化剂），混合物溶液加到三颈瓶中，在氮气保护下反应 60h。结束后，有机相用盐酸萃取三次（每次50mL)，蒸馏水萃取三次（每次50mL)，真空旋蒸 除去二氯甲烧。产物溶于5mL二甲基亚砜中，加入58mg N-轻基丁二酰亚胺和43mg 1-乙 基-(3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐在室温下反应12h得47mg多烯紫杉醇的二硫 代丙二酸酐活化酯。透明质酸脱乙酰化：将400mg透明质酸溶于7mL水，加入7. 8mL(pH = 14)氢氧化钠溶液，磁力搅拌使胶状溶液变为澄清溶液。透析，冻干得340mg脱乙酰基化的 透明质酸。将300mg多烯紫杉醇-二硫代丙二酸酐活化酯溶于12mL N，N-二甲基甲酰胺， 加入到脱乙酰化的透明质酸水溶液中，磁力搅拌，孵化。透析，冻干即得目标产物。
[0073] 实施例9 :制备氧化还原敏感的透明质酸-多烯紫杉醇共轭物
[0074] 步骤如下：称取27. 5mg多烯紫杉醇，加入63mg 4-二甲氨基批陡和12mg 1-乙 基-(3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐，78. 5mg 3,3' -二硫代丙二酸溶于二氯甲烷 (4-二甲氨基吡啶本身是缚酸剂和活化剂），混合物溶液加到三颈瓶中，在氮气保护下反应 60h。结束后，有机相用盐酸萃取三次（每次50mL)，蒸馏水萃取三次（每次50mL)，真空旋 蒸除去二氯甲烷得24. 5mg多烯紫杉醇-二硫代丙二酸衍生物。将多烯紫杉醇-二硫代丙 二酸衍生物溶于二甲基亚砜中，加入25mg N-轻基丁二酰亚胺和63mg 1-乙基-(3-二甲基 氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐在室温下反应12h得25mg多烯紫杉醇的二硫代丙二酸酐活 化酯。将30〇11^透明质酸溶于4〇1^水中，室温放置。加入5〇1^质量分数10%碳酸氢钠后 放置1小时，用质量分数2%氢氧化钠溶液调pH至9. 5。将多烯紫杉醇-二硫代丙二酸酐 活化酯加入到碱性的透明质酸溶液中，剧烈搅拌8h。透析，冻干即得目标产物。
[0075] 实施例10 :制备氧化还原敏感的透明质酸-多烯紫杉醇共轭物
[0076] 步骤如下：称取37mg多烯紫杉醇，加入14. 6mg 4-二甲氨基批陡和12mg 1-乙 基-(3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐，16mg 3, 3' -二硫代丙二酸溶于6mL二氯甲 烷（4-二甲氨基吡啶本身是缚酸剂和活化剂），混合物溶液加到三颈瓶中，在氮气保护下反 应60h。结束后，有机相用盐酸萃取三次（每次50mL)，蒸馏水萃取三次（每次50mL)，真空 旋蒸除去二氯甲烷得多烯紫杉醇-二硫代丙二酸衍生物。将多烯紫杉醇-二硫代丙二酸衍 生物溶于二甲基亚砜中，加入34. 7mg N-羟基丁二酰亚胺和15mg 1-乙基-(3-二甲基氨基 丙基）碳酰二亚胺盐酸盐在室温下反应12h得25mg多烯紫杉醇的二硫代丙二酸酐活化酯。 将560mg透明质酸溶于MES缓冲液（pH 4. 75)中，加入48mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙 基）碳酰二亚胺盐酸盐和27mg硫醇化N-羟基丁二酰亚胺搅拌活化。活化后，加入30g乙 二胺盐酸盐，透析72h，冻干后得500mg透明质酸-乙二胺产物。将480mg透明质酸-乙二 胺产物溶于16mL甲酰胺中。将24mg多烯紫杉醇的二硫代丙二酸活化酯滴入透明质酸-乙 二胺溶液中，搅拌孵化6h。透析，冻干即得共轭物。
[0077] 实施例11 :制备非氧化还原敏感的透明质酸-多烯紫杉醇共轭物
[0078] 步骤如下：称取30. 5mg多烯紫杉醇，与24mg琥珀酸酐混合，溶于4mL二氯甲烷，并 加入吡啶，室温下搅拌72h，真空旋蒸（除去二氯甲烷）。纯化得27.5mg多烯紫杉醇-琥珀 酸酐衍生物。将25. 5mg多烯紫杉醇-琥珀酸酐衍生物溶于6mL N，N-二甲基甲酰胺，加入 32mg N-羟基丁二酰亚胺和8mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐在室温 下活化得29mg多烯紫杉醇的琥珀酸酐活化酯。将37mg透明质酸溶于水中，加入Ig己二酸 二酰。反应物溶液的pH用0· IM的HCl调到6. 5,然后加入40mg 1-乙基-(3-二甲基氨基 丙基）碳酰二亚胺盐酸盐。在此PH条件下反应1小时，加入质量分数为0. 1 % NaOH调节 pH到9.0结束反应。透析72h，冻干后得35mg透明质酸-己二酸二酰肼产物。将30mg透 明质酸-己二酸二酰肼产物溶于5mL甲酰胺中。将25mg多烯紫杉醇的琥珀酸酐活化酯滴 入透明质酸-己二酸二酰肼溶液中，搅拌孵化。透析，冻干即得非氧化还原敏感的共轭物。
[0079] 试验例1 :稳定性试验
[0080] 按照实施例3制备氧化还原敏感的透明质酸-多烯紫杉醇共轭物胶束制剂，4°C下 存储，根据载药量和粒子大小推测其稳定性。
[0081] 结果：该胶束在4°C条件下储存6个月后，水中自组装形成的胶束，其平均直径及 载药量与新鲜制备的胶束制剂相比无显著变化（如图3A所示）。
[0082] 试验例2 :稳定性试验
[0083] 按照实施例7制备氧化还原敏感的透明质酸-多烯紫杉醇共轭物胶束制剂，4°C下 存储，根据载药量和粒子大小推测其稳定性（如图3B所示）。
[0084] 试验例3 :细胞毒性试验
[0085] 按照实施例3制备的氧化还原敏感的透明质酸-多烯紫杉醇共轭物胶束制剂和实 施例11制备的非氧化还原敏感的透明质酸-多烯紫杉醇共轭物胶束制剂，用3-(4, 5-二甲 基-2-噻唑基）-2, 5-联苯四唑溴化物（MTT)实验来测定细胞毒性。在药物治疗前24小时 将KB细胞转移至96孔培养板中，每孔I X KT4个细胞。不同的多烯紫杉醇制剂包括转氧化 还原敏感的透明质酸-多烯紫杉醇共轭物胶束制剂、非氧化还原敏感的胶束制剂或者是吐 温-80/乙醇溶液，将其用培养液（RPMI-1640)稀释到后以每孔100 μ 1加入到KB细胞中。 细胞在37°C下培养2h后，除去含有不同多烯紫杉醇制剂的培养液。所有细胞用磷酸盐缓冲 液（pH 7.4)洗两次后，加入新的培养液再培养72h。将四甲基偶氮唑盐（MTT)原液（50mg/ mL，20 μ 1)加入到每孔中在37°C下培养4h。除去培养液，加入二甲基亚砜（DMSO)溶解MTT 中蓝色结晶物。所得溶液用酶标仪在570nm处测定吸光度，推测细胞的存活率。
[0086] 结果：如表1所示，氧化还原敏感的透明质酸-多烯紫杉醇共轭物胶束制剂的细胞 半数抑制率比非氧化还原敏感的胶束制剂和吐温-80/乙醇制剂分别低3. 8、2. 1倍。
[0087] 表IMTT实验测试多烯紫杉醇在KB细胞系中的细胞毒性
[0088]
【权利要求】
1. 一种氧化还原敏感的透明质酸-多烯紫杉醇共轭物，其特征在于：由以下重量份的 原料制成：原料药多烯紫杉醇20?80份，载体透明质酸3?20份，连接体5?95份，缚酸 剂2?20份；其中，所述连接体为具有二硫键的化合物，酸酐，羧酸，酰肼，胺中的一种或两 种以上的混合；所述的缚酸剂为吡啶、三乙胺中的任一种或两种的混合。
2. 根据权利要求1所述的氧化还原敏感的透明质酸-多烯紫杉醇共轭物，其特征在于： 所述共轭物分散于水中形成的胶束粒径在100?500nm范围内。
3. 根据权利要求1所述的氧化还原敏感的透明质酸-多烯紫杉醇共轭物，其特征在于： 所述具有二硫键的化合物为胱胺、胱胺盐酸盐、3, 3'-二硫代丙二酸、3, 3'-二硫代丙亚氨 酸二甲酯中的一种或两种以上的混合。
4. 根据权利要求1所述的氧化还原敏感的透明质酸-多烯紫杉醇共轭物，其特征在于： 所述的连接体中酸酐为丁二酸酐，辛烯基琥珀酸酐，顺丁烯二酸酐、戊二酸酐中的一种或两 种以上的混合；羧酸为丁二酸，3, 3' -二硫代丙二酸中的任一种或两种的混合；酰肼为己二 酸二酰肼，间苯二甲酰肼、丁二酸二酰肼中的任一种或两种以上的混合；胺为胱胺，乙二胺、 碳二酰亚胺中的任一种或两种的混合。
5. 如权利要求1所述氧化还原敏感的透明质酸-多烯紫杉醇共轭物的制备方法，步骤 如下： (1) 将原料药多烯紫杉醇与连接体混合溶于有机溶剂，加入缚酸剂，室温下搅拌反应 60?84小时，真空旋蒸除去有机溶剂，将产物溶于有机溶剂，加入活化剂和脱水剂，在室温 下活化生成原料药活化酯； (2) 将载体透明质酸溶于缓冲液或水中，加入活化剂和脱水剂搅拌活化；活化后，加入 连接体，透析，冻干后得载体交联产物，将载体交联产物溶于有机溶剂中，得载体溶液； (3) 将原料药活化酯滴入载体溶液中，孵化4?48h时间后，透析，冻干，得目标产物； 所述活化剂为N-羟基丁二酰亚胺，硫醇化N-羟基丁二酰亚胺，4-二甲氨基吡啶、二 环己基碳二亚胺中的任一种或两种以上的混合；所述有机溶剂为二氯甲烷，二甲基亚砜、 N，N-二甲基甲酰胺，二甲基亚砜中的任一种或两种以上的混合；所述缓冲液为pH 7. 4的 PBS缓冲液或pH 4. 75的MES缓冲液。
6. 如权利要求5所述氧化还原敏感的透明质酸-多烯紫杉醇共轭物的制备方法，其特 征在于，所述步骤（2)中连接体为胱胺、胱胺盐酸盐，3, 3' -二硫代丙二酸、3, 3'-二硫代 丙亚氨酸二甲酯中的任一种或两种以上的混合。
7. 如权利要求5所述氧化还原敏感的透明质酸-多烯紫杉醇共轭物的制备方法，其特 征在于，所述步骤（1)中室温下搅拌反应72小时，真空旋蒸除去有机溶剂。
8. 如权利要求1所述氧化还原敏感的透明质酸-多烯紫杉醇共轭物的制备方法，其特 征在于，步骤如下： (1) 取原料药多烯紫杉醇、活化剂、缚酸剂、脱水剂、连接体，溶于有机溶剂，在氮气保 护下反应；反应结束后，有机相用盐酸萃取，再用蒸馏水萃取，真空旋蒸除去有机溶剂，得产 物； (2) 上述产物溶于有机溶剂，加入活化剂、脱水剂和连接体，室温下反应8?12h，得原 料药活化酯； (3) 将载体透明质酸溶于缓冲液或水中，加入连接体，调整pH至2?7,然后加入脱水 齐U，反应1小时，调整pH至8?12,结束反应；透析三天，冻干后得载体交联产物，将载体交 联产物溶于有机溶剂中，得载体溶液； (4)将原料药活化酯滴入载体溶液中，孵化4?48h后，透析，冻干，得目标产物； 所述活化剂为N-羟基丁二酰亚胺，硫醇化N-羟基丁二酰亚胺，4-二甲氨基吡啶、二 环己基碳二亚胺中的任一种或两种以上的混合；所述有机溶剂为二氯甲烷，二甲基亚砜、 N，N-二甲基甲酰胺，二甲基亚砜中的任一种或两种以上的混合；所述缓冲液为pH 7. 4的 PBS缓冲液或pH 4. 75的MES缓冲液。
9.如权利要求8所述的氧化还原敏感的透明质酸-多烯紫杉醇共轭物的制备方法，其 特征在于，所述步骤（2)中用碳酸氢钠或氢氧化钠调整pH。
【文档编号】A61P35/00GK104306983SQ201410606131
【公开日】2015年1月28日 申请日期:2014年10月31日 优先权日:2014年10月31日
【发明者】翟光喜, 张海群, 杨小叶 申请人:山东大学