转录因子Yin Yang 1表达调节剂作为糖代谢调控剂的制作方法
【专利摘要】本发明是基于YY1因子作用于PKM2的发现，公开Yin Yang 1(YY1)转录因子调控M2型丙酮酸激酶(PKM2)的新用途。根据本发明人的大量实验，无论是在缺氧状态还是在正常状态下，细胞中的转录因子Yin Yang 1被抑制后，M2型丙酮酸激酶的表达被明显抑制；而细胞中的转录因子Yin Yang 1超表达时，M2型丙酮酸激酶表达水平上调。基于上述实验发现，通过抑制或促进转录因子Yin Yang 1表达水平来调节M2型丙酮酸激酶是完全可以实现的。基于此研究发现，申请转录因子Yin Yang 1调控作用于M2型丙酮酸激酶靶标的新用途。
【专利说明】转录因子Yin Yang 1表达调节剂作为糖代谢调控剂
【技术领域】
[0001] 本发明涉及YYl因子的新用途，同时涉及YYl因子作为糖代谢调控剂。
【背景技术】
[0002] 转录因子YinYangl(YYl)，又称为δ、NFEl、UCRBP、CFl，是锌指类转录因子 GLl-Kruppel家族中一员。YYl是多功能蛋白，具有抑制和激活转录的双重功能。目前的一 些研宄认为，转录因子YYl参与调控如发育、分化、复制和细胞增殖等生理过程。另外，YYl 通过调控肿瘤相关基因，在肿瘤的发生、发展中发挥重要作用。
[0003] 肿瘤细胞即使在氧气充足的情况下也会通过糖酵解方式来进行代谢，消耗大量葡 萄糖并最终生成乳酸，这种现象被称为肿瘤的有氧糖酵解，也叫做Warburg效应。在这一过 程中存在一个重要的调节因子，即M2型丙酮酸激酶（PKM2)，该酶催化其上游底物磷酸烯醇 式丙酮酸（PEP)生成丙酮酸。PKM2在大肠癌，肾细胞癌、卵巢癌、肺癌、乳腺癌、胸部恶性肿 瘤和其他癌症患者里呈高表达，并在肿瘤细胞代谢和增殖中发挥重要作用。另外，PKM2的 含量与肿瘤的分期密切相关。肿瘤细胞的糖代谢作为提供能量的细胞的基本活动，与肿瘤 细胞的增殖、抗凋亡能量、EMT、肿瘤细胞的迀移、侵润密切相关。肿瘤细胞糖代谢的抑制可 显著降低肿瘤细胞的增殖和抗凋亡能力。
[0004] RNA 干扰（RNA interference, RNAi)是由小 RNA(small interfering RNA, siRNA) 引起的转录后基因沉默的现象。由于RNA干扰可以高效、特异地抑制其靶标基因的表达，本 专利的实验过程用到了上述技术。
【发明内容】
[0005] 本发明是基于YYl表达调节剂作用于糖代谢功能的发现，公开以YYl表达调节剂 为有效成分的糖代谢调控剂以及YYl表达调节剂的一系列新的用途。
[0006] 为实现本发明目的而采用的技术方案如下：
[0007] 糖代谢调控剂，其特征在于以转录因子YYl表达调节剂为有效成分的细胞糖代谢 的调控剂。值得说明的是，基于本专利发明人的大量实验结果，无论是在缺氧状态还是在 正常状态下，细胞中的YYl表达量变化均可导致乳酸产量以及细胞中葡萄糖的摄入量的改 变。基于上述实验发现，通过转录因子YYl表达调节剂来调控糖代谢是完全可以实现并在 疾病预防和治疗中得到应用。
[0008] 进一步地，上述糖代谢调控剂为PKM2因子的调控剂。值得说明的是，在本专利发 明人的实验中，无论是在缺氧状态还是在正常状态下，细胞中的转录因子YYl被抑制时， PKM2的表达也明显地被抑制；而细胞中的转录因子YYl超表达时，PKM2的表达也明显上升。 基于上述实验发现，通过转录因子YYl表达调节剂来抑制或促进PKM2的表达量是完全可以 实现的。由此带来了转录因子YYl表达调节剂作用于PKM2靶标的新用途。
[0009] 另，实验结果进一步说明了上述转录因子YYl表达调节剂也作为转录因子YYl表 达抑制剂。表达抑制剂具体可以是但不限于本实施例中所使用的及其相应的类似物、衍生 物等，或其它能够被本领域技术人员认识到的、能够抑制转录因子Yin Yang 1表达的药物。 基于对转录因子YYl的抑制作用，所述表达调节剂（表达抑制剂）可以作为通过抑制肿瘤 细胞的PKM2来抑制肿瘤糖代谢的药物，进而达到实现治愈人类或实验动物肿瘤的目的。 当所述调控剂（表达抑制剂）作用于人体或动物时，给药方式包括但不限于将其与他辅料 结合，制作成为符合药学中的片剂、注射剂、胶囊等。患者按照药品说明书指示使用后，肿瘤 细胞中的转录因子YYl表达被抑制，进而，PKM2表达被明显地抑制，肿瘤细胞糖代谢功能降 低，最终肿瘤细胞凋亡。
[0010] 进一步地，上述转录因子YYl表达抑制剂可作为以转录因子YYl为靶标的RNA干 扰诱导剂。
[0011] 进一步地，上述转录因子YYl表达调节剂为转录因子YYl表达促进剂。表达促进 剂具体可以为但不限于本实施例中所使用的及其相应的类似物、衍生物等，或其它能够被 本领域技术人员认识到的、能够促进转录因子YYl表达的化合物。基于对转录因子YYl的 促进作用，上述表达调节剂（表达促进剂）可以作为通过促进细胞的PKM2来促进其糖代谢 的化合物。当所述表达调节剂（表达促进剂）用于人体或实验动物时，给药方式包括但不 限于将其与他辅料结合，制作为符合药学的片剂、注射剂、胶囊等。患者然后按照药品说明 书指示使用后，体内细胞中的转录因子YYl表达被促进，进而，PKM2表达被明显地促进，细 胞糖代谢功能提尚。
[0012] 进一步地，上述转录因子YYl表达促进剂为转录因子YYl的超表达质粒。
[0013] 进一步地，通过YYl表达调节剂调控PKM2的新用途。
[0014] 上述细胞糖代谢调控是通过调控PKM2的表达水平。进一步，通过转录因子YYl表 达抑制剂抑制PKM2靶标因子的作用机制，从而实现抑制肿瘤细胞的糖代谢功能的新用途。
【专利附图】
【附图说明】
[0015] 图1显示YYl表达被沉默的细胞中YYl蛋白质的表达情况，显示在正常和低氧条 件下细胞中YYl表达显著降低。
[0016] 图2显示在YYl表达被沉默的细胞中，PKM2的mRNA和蛋白表达量在正常和低氧 条件下也是显著降低的。
[0017] 图3是将YYl超表达质粒转染到HCTl 16细胞时，检测在正常和低氧条件下YYl蛋 白质的表达情况，结果显示YYl蛋白表达量显著升高。
[0018] 图4显示在YYl超表达时，PKM2的mRNA以及蛋白表达量在正常和低氧条件下的 表达也明显升高。
[0019] 图5显示在YYl表达被沉默抑制的细胞中，YYl沉默抑制使得在正常和低氧条件 下，肿瘤细胞对葡萄糖的摄入量和乳酸的产生量显著降低。
[0020] 图6显示在YYl表达被抑制的肿瘤细胞中，细胞增殖能力减弱，细胞血管新生因子 表达也显著降低。
【具体实施方式】
[0021] 下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明，但不应该理解为本发明上述主题 范围仅限于下述实施例。在不脱离本发明所述技术思想的情况下，根据本领域普通技术知 识和惯用手段，做出各种替换和变更，均应包括在本发明的保护范围内。
[0022] 本说明书里所述转录因子YYl为Refseq号码ΝΜ_003403· 4的基因，PKM2为Refseq 号码NM_001206799. 1的基因。
[0023] 上述以转录因子Yin Yang I(YYl)表达调控剂为有效成分的糖代谢调控剂也可以 含有高分子、担体、佐剂等药学允许的药用辅料添加剂。
[0024] 本说明书里所述的基因表达调控可以是促进基因的表达，也可以是抑制基因的表 达。上述YYl表达调控剂为YYl表达抑制剂或YYl表达促进剂。
[0025] YY表达抑制剂的种类没有任何限制，例如小分子化合物、以YYl为靶标的反义 RNA、以YYl为靶标的RNA干扰诱导剂等，特别是RNA干扰诱导剂。
[0026] RNA干扰诱导剂的种类没有任何限制，例如体外化学合成的短片段的干扰 RNA(siRNA)、用于体内表达siRNA的siRNA表达质粒等。
[0027] siRNA表达质粒所表达的siRNA可以是使正义链和反义链分别表达的，也可以是 正义链和反义链由一系列基本片段连接的，即发夹型（short hairpin RNA，shRNA)。
[0028] YYl促进剂的种类没有任何限制，例如小分子化合物、YYl超表达质粒等，特别是 YYl超表达质粒。
[0029] 本说明书里所述的正常条件为正常大气条件，合适的氧气浓度为15%以上30% 以下的条件，更适氧气浓度为18%以上25%以下的条件，最适氧气浓度为20%的条件。* 实施例里正常条件是正常大气条件下。
[0030] 本说明书里所述的缺氧条件为氧气浓度为10%以下的条件，合适的低氧浓度为 7%以下的条件，更适低氧浓度为5%以下的条件，最适低氧浓度为1 %的条件。*实施例里 缺氧条件的氧气浓度大约在1%左右。
[0031] 本说明书里所述的细胞没有任何限制，包括人类细胞、小鼠细胞、大鼠细胞等哺乳 动物由来的细胞。细胞所由来的组织器官没有任何限制，例如皮肤、结肠、神经、脑、肝脏、胆 管、乳腺、子宫颈、心脏、血管、肾脏、卵巢等。细胞的种类没有任何限制，例如上皮细胞、内皮 细胞、间皮细胞等。
[0032] 本说明书里所述的细胞可以是正常组织的细胞，也可以是肿瘤细胞。肿瘤组织包 括良性肿瘤、恶性肿瘤以及肿瘤病变前的细胞。
[0033] 细胞没有任何限制，可以是从组织或器官里提取的细胞，也可以是细胞株。细胞的 来源没有任何限制，可以是直接提取的细胞，自己或其它组织建立的细胞株或稳定表达细 胞，也可以由向American Type Culture Collection(ATCC)等组织或从企业等购买的细 胞。细胞的提取方法，细胞株以及稳定表达细胞的方法没有任何限制，属于根据本领域普通 技术知识和惯用手段。
[0034] 由于YYl能在正常和缺氧的条件下通过调控PKM2从而调控细胞的糖代谢，因此本 说明书里所属的YYl调控剂能通过调控细胞的糖代谢从而对代谢疾病起到预防、缓和以及 治疗的作用。
[0035] 另外，本说明书里所述的YYl调控剂能通过调控肿瘤细胞的糖代谢，从而调控肿 瘤细胞的增殖、凋亡、EMT、迀移、侵润、转移。YYl抑制剂能抑制肿瘤细胞的糖代谢，从而抑 制肿瘤细胞的增殖、凋亡、EMT、迀移、侵润和转移；最终起到预防、控制、缓解和治疗肿瘤的 效果。上述肿瘤细胞没有任何限制，包括良性肿瘤、恶性肿瘤以及肿瘤病变前的细胞。
[0036] 实施例I :
[0037] (1-1) YYl表达抑制的细胞以及抑制试验对照组细胞的构建
[0038] (1-1-1)构建YYl表达被抑制的结肠癌细胞（以下称为HCTl 16/shYYl):
[0039] 本实施例用到的是表达以YYl为靶标的发夹型RNA(以下称为shYYl)的人类 HCT116结肠癌细胞，该细胞系是由该专利 申请人:通过常规实验手段构建成功的。
[0040] 具体方法：HCT116结肠癌细胞用含有10 %胎牛血清（Giblco)和1 %抗生素 (Invitrogen)的McCoy，5A培养基（Invitrogen)培养，HCT116/shYYl细胞株是通过把具有 嘌呤霉素抗药性，由U6启动子驱动的shYYl表达质粒转入HCTl 16细胞，通过嘌呤霉素试剂 筛选建立了 YYl表达稳定抑制的结肠癌细胞。
[0041] (1-1-2)抑制试验对照细胞系的构建
[0042] 对照细胞系是通过把具有嘌呤霉素抗药性，由U6启动子而不表达发夹型RNA的质 粒转入HCT116细胞，通过嘌呤霉素试剂筛选建立了抑制试验对照细胞。
[0043] (1-2)正常条件以及低氧条件培养细胞
[0044] 将上述HCTl 16/shYYl细胞以及抑制试验对照组细胞种于6孔板中，低氧条件处理 细胞是将种有细胞的6孔板放置于含有厌氧包（日本三菱）密封盒中，此时的细胞生长的 氧气浓度大约为1 %，培养在37°C、5% CO2的孵箱中；正常条件培养细胞是直接将细胞培养 在37°C、5% 0)2的孵箱中，此时的细胞生长的氧气浓度为正常的大气氧浓度。
[0045] (1-3)验证所建立的YYl表达抑制的结肠癌细胞
[0046] (1-3-1)蛋白质提取
[0047] 将HCT116/shYYl细胞以及抑制试验对照组细胞进行24小时的低氧或正常培养后 收集，加入RIPA (碧云天）裂解液，冰上裂解30分钟，之后将裂解液于4°C离心20分钟（转 速为12000转/分钟），收集上清，即得到蛋白。将得到的蛋白样品使用BCA蛋白定量（碧 云天），用酶标仪检测所提取蛋白的浓度。
[0048] (1-3-2)蛋白质检测
[0049] 蛋白质检测：本实验对蛋白检测使用的是最经典的SDS-PAGE Western blot方法。 首先利用聚丙烯酰胺凝胶将蛋白根据大小的不同而分开，然后将蛋白转移到聚丙二氟乙烯 膜上。转膜后将膜用 YYl 抗体（YYlantibody，H-10, SANTA CRUZE)和 β-Actin 抗体（Cell Signaling)孵育，显影后即得到1图。从图中得出，在正常和低氧条件下，HCT116/shYYl 细胞中YYl的蛋白水平明显低于抑制试验对照组细胞里的YYl的蛋白水平，而作为内参的 β -Actin的蛋白水平在两组细胞之间没有明显的差异。
[0050] (1-4)解析抑制YYl表达对ΡΚΜ2表达的影响
[0051] (1-4-1)解析抑制YYl表达对PKM2mRNA表达水平的影响
[0052] (1-4-1-1)提取HCTl 16/shYYl以及抑制试验对照组细胞的总RNA
[0053] 将HCTl 16/shYYl以及抑制试验对照组细胞在正常和低氧条件下培养12小时，然 后收集细胞，并用Trizol(Invitrogen)提取细胞总RNA。
[0054] (1-4-1-2)获取HCTl 16/shYYl以及抑制试验对照组细胞的cDNA
[0055] 将1-4-1-1中提取的总RNA作为模板，利用反转录试剂盒（Thermo)按照下面表1 计量依次加入各试剂后，在65°C反应5分钟置于冰上。然后按照下面表2计量加入反转录 反应液，混合均匀，在42°C反应60分钟后将反应液置于70°C反应5分钟终止反应，从而获 得 cDNA。
[0056]表 I
【权利要求】
1. 转录因子Yin Yang 1表达调节剂作为糖代谢调控剂，其特征在于：以转录因子Yin Yang 1(YY1)表达调节剂为有效成分的细胞糖代谢调控剂。
2. 根据权利要求1所述的转录因子Yin Yang 1表达调节剂作为糖代谢调控剂，其特 征在于：所述转录因子Yin Yang 1(YY1)表达调节剂在正常或低氧条件下调控细胞的糖代 谢。
3. 根据权利要求1所述的转录因子Yin Yang 1表达调节剂作为糖代谢调控剂，其特征 在于：所述糖代谢调控剂为M2型丙酮酸激酶（PKM2)表达的调控剂。
4. 根据权利要求1、2或3所述的转录因子Yin Yang 1表达调节剂作为糖代谢调控剂， 其特征在于：所述转录因子Yin Yang 1(YY1)表达调节剂为转录因子Yin Yang 1表达抑制 剂。
5. 根据权利要求4所述的转录因子Yin Yang 1表达调节剂作为糖代谢调控剂，其特征 在于：所述转录因子Yin Yang 1表达抑制剂为以转录因子Yin Yang 1为革E1标的RNA干扰 诱导剂。
6. 根据权利要求1、2或3所述的转录因子Yin Yang 1表达调节剂作为糖代谢调控剂， 其特征在于：所述转录因子Yin Yang 1(YY1)表达调节剂为转录因子Yin Yang 1表达促进 剂。
7. 根据权利要求4所述的转录因子Yin Yang 1表达调节剂作为糖代谢调控剂，其特征 在于：所述调控剂为抑制肿瘤细胞糖代谢功能的化合物。
8. 转录因子Yin Yang 1表达调节剂调控M2型丙酮酸激酶的新用途。
9. 根据权利要求8所述的转录因子Yin Yang 1表达调节剂调控M2型丙酮酸激酶的新 用途，其特征在于：通过转录因子Yin Yang 1表达调节剂抑制或促进M2型丙酮酸激酶PKM2 表达的作用，实现转录因子Yin Yang 1调控剂调控糖代谢的新用途。
10. 根据权利要求8所述的转录因子Yin Yang 1表达调节剂调控M2型丙酮酸激酶的 新用途，其特征在于：通过转录因子Yin Yangl表达调节剂抑制M2型丙酮酸激酶PKM2表达 的作用，实现抑制肿瘤细胞糖代谢功能的新用途。
【文档编号】A61K48/00GK104436216SQ201410633172
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年11月7日 优先权日:2014年11月7日
【发明者】吴寿荣, 江崎慧, 贾慧珍, 张静, 黄灿 申请人:重庆大学