一种含细胞纳米纤维支架的制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种含细胞纳米纤维支架的制备方法。该方法可实现可降解生物材料和细胞集成加工，直接利用高压电喷含细胞的纳米纤维支架。具体步骤为：（1）用去离子水配制水溶性可降解高分子聚合物成均一溶液，再加入β-TCP粉末进行混合用震荡球磨机研磨；（2）将上述材料高温蒸汽消毒；（3）将细胞悬液加入到上述消毒后的材料里面，搅拌均匀；（4）用注射器抽取上述含细胞的材料置于微量泵，开启高压电源和微量泵，设置好相应的工艺参数进行电喷，最后得到含细胞的纳米纤维支架。本发明整个制备方法简单易行，对骨缺损等快速修复具有重大的现实意义。
【专利说明】一种含细胞纳米纤维支架的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种含细胞纳米纤维支架的制备方法，属于组织工程纳米纤维支架制备与修复领域。
【背景技术】
[0002]静电纺丝法是近年来兴起的一种能快速、简便制备纳米纤维支架的方法，利用该技术制备的支架材料孔隙率高，孔道连通性好，能够很好的构建细胞生长的微环境。故纳米纤维支架在医学领域有着广泛的应用。目前构建纳米纤维组织工程纳米纤维支架的常见方法是:先制备纳米纤维支架，然后在支架表面种植细胞。但通过该方法得到的组织工程纳米纤维支架存在以下缺点:1)细胞种植密度小，使得新组织的生长速度慢。2)组织一般包含多种细胞，不同种类的细胞定点分布难以实现。3)细胞通过支架的表面向内迀移生长，这种单方向生长与自然组织细胞的三维均衡环境相差很远，影响了细胞-细胞、细胞-支架的相互作用，以及组织的发育。4)不适合构建大尺寸支架，在支架中心部位的细胞由于液体的渗透能力的降低而发生影响不良，导致生长迟缓，缺乏血管化，最终导致“夹心”的现象发生。
[0003]人体组织内的细胞都处于三维空间结构中，接受着周围的信号。该环境为细胞的生长提供了极为有利的条件，均衡的营养和物质能量的交换，使细胞不断增殖和分泌自身的外基质。在体外如何构建这一微环境，实际上就是要解决多种细胞的组合和排列，使细胞、生长因子和外基质成为一个有机的结合体，允许他们之间相互作用从而获得一定的生物学功能。因此，将细胞与基质材料同时组装成形是一个行之有效的方法。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是针对以上问题，提供一种含细胞纳米纤维支架的制备方法，利用高压电喷制备，着力于构建具有生物活性且细胞均匀分布的支架，为医学上的快速修复提供更为先进的技术支持。
[0005]为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案:
一种含细胞纳米纤维支架的制备方法，纳米纤维支架由可降解的高分子聚合物和细胞组成，利用电喷技术一次性制备，包括以下步骤:
1)用电子天秤称取1.5-2.0克水溶性可降解高分子聚合物，在搅拌情况下缓缓加入到15-20克的去离子水中，至充分溶胀后升温到80-100°C加速溶解，并保温3小时，制得均一的高分子溶液后，再加入0.10-0.20克的β -TCP粉末进行混合，并用震荡球磨机研磨2小时；
2)将上述材料在120°C高温蒸汽消毒；
3)将第4代人的干细胞用0.25%的胰蛋白酶消化后收集在50mL离心管，1000 r/min离心5 min，弃上清液，将细胞悬液移至消毒后的上述材料，搅拌均匀，得到含细胞的高分子聚合物溶液；
4)在电喷装置的注射器的针头上加载6-8KV的直流电压，针头和直角不锈钢接收板之间的距离为7-9cm，正极加载在注射器的针头上，负极加载在不锈钢垫板上；微量泵实现将含细胞的高分子聚合物溶液以150-180ul/min稳定流量进行供料，纺丝1_3个小时，最后得到含细胞的纳米纤维支架。
[0006]所述步骤I)的水溶性可降解高分子聚合物为聚乙烯醇或聚氧化乙烯。
[0007]所述步骤3)的干细胞为脂肪干细胞或骨髓间充质干细胞。
[0008]本发明与现有技术相比较，具有如下显而易见的突出实质性特点和显著优点: 本发明将活细胞掺入到材料里面直接进行纳米纤维纺丝，一次性成形具有含细胞的纳米纤维支架，使细胞均匀地分布在纳米纤维支架结构内，有利于细胞支架的信号传递，有利于细胞的黏附，同时也克服了因支架结构孔隙太小限制了细胞迀移。该方法具备工艺简单、可控性好及效率高等优点。
【专利附图】
【附图说明】
[0009]图1为制备含细胞的纳米纤维支架系统示意图。
【具体实施方式】
[0010]本发明的优选实施例结合附图详述如下:
如图1所示为制备含细胞的纳米纤维支架系统示意图。其中:计算机控制系统I连接控制器2，控制器2连接高压电源3和微量泵7，直角不锈钢接收板5放置在不锈钢垫板4上，注射器6连接微量泵7，高压电源3的正极加载在注射器6的针头上，负极加载在不锈钢垫板4上。
[0011]实施例1
一种含细胞纳米纤维支架的制备方法，纳米纤维支架由可降解的高分子聚合物和细胞组成，利用电喷技术一次性制备，包括以下步骤:
1)用电子天称称取1.76克的PVA颗粒在搅拌情况下缓缓加入到18.24克的去离子水中，至充分溶胀后升温到90°C左右加速溶解，并保温3小时，制得透明的8.8%PVA溶液后，再加入0.15克的β -TCP粉末进行混合用震荡球磨机研磨2小时；
2)将上述材料120°C进行高温消毒；
3)第4代人的脂肪干细胞用0.25%的胰蛋白酶消化后收集在50mL离心管，1000 r/min离心5 min,弃上清液，将细胞悬液移至消毒后的上述材料搅拌均匀得到含细胞的PVA溶液；
4)将制备含细胞的纳米纤维支架系统连接好，本实施例中直角不锈钢接收板5宽4cm、厚1mm、横边6cm、竖边6cm ;针头距直角不锈钢接收板5水平边外侧的竖直距离是8cm，横向距离是5cm。
[0012]用1mL的无菌注射器抽取8mL含细胞的PVA溶液，开启高压电源3，加载6.5KV的直流电压，针头和无菌的不锈钢直角板之间的距离调为8cm。
[0013]设置微量泵的供料速度为160ul/min，纺丝2小时制备纳米纤维支架。
[0014]纺丝结束后取纳米纤维膜的中间部分，放进培养皿中加入培养液再放入培养箱中进行培养。最后得到含细胞的纳米纤维支架。
[0015]实施例2 本实例与实例I基本相同，不同之处在于:用电子天秤称取2克的PEO颗粒在搅拌情况下缓缓加入到8克的去离子水中，至充分溶胀后升温到60°C左右加速溶解，并保温3小时，制得透明的20%PE0溶液后，再加入0.15克的β -TCP粉末进行混合用震荡球磨机研磨2小时。
[0016] 实施例3
本实例与实例I基本相同，不同之处在于:步骤3)所采用的干细胞为骨髓间充质干细胞。
【权利要求】
1.一种含细胞纳米纤维支架的制备方法，纳米纤维支架由可降解的高分子聚合物和细胞组成，利用电喷技术一次性制备，其特征在于，包括以下步骤: 1)用电子天秤称取1.5-2.0克水溶性可降解高分子聚合物，在搅拌情况下缓缓加入到15-20克的去离子水中，至充分溶胀后升温到80-100°C加速溶解，并保温3小时，制得均一的高分子溶液后，再加入0.10-0.20克的β -TCP粉末进行混合，并用震荡球磨机研磨2小时； 2)将上述材料在120°C高温蒸汽消毒； 3)将第4代人的干细胞用0.25%的胰蛋白酶消化后收集在50mL离心管，1000 r/min离心5 min，弃上清液，将细胞悬液移至消毒后的上述材料，搅拌均匀，得到含细胞的高分子聚合物溶液； 4)在电喷装置的注射器的针头上加载6-8KV的直流电压，针头和直角不锈钢接收板之间的距离为7-9cm，正极加载在注射器的针头上，负极加载在不锈钢垫板上；微量泵实现将含细胞的高分子聚合物溶液以150-180ul/min稳定流量进行供料，纺丝1_3个小时，最后得到含细胞的纳米纤维支架。
2.根据权利要求1所述的含细胞纳米纤维支架的制备方法，其特征在于:所述步骤I)的水溶性可降解高分子聚合物为聚乙烯醇或聚氧化乙烯。
3.根据权利要求1所述的含细胞纳米纤维支架的制备方法，其特征在于:所述步骤3)的干细胞为脂肪干细胞或骨髓间充质干细胞。
【文档编号】A61L27/38GK104491929SQ201410790675
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2014年12月19日 优先权日:2014年12月19日
【发明者】胡庆夕, 陈海萍, 刘媛媛, 向科 申请人:上海大学