叶酸靶向超声促发冬凌草甲素脂质微泡及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种叶酸靶向超声促发凌草甲素脂质微泡、制备及其应用。由下述方法制备获得：称取磷脂类成分，胆固醇和叶酸偶联的高分子复合物，加入溶剂溶解，减压蒸发溶剂，脂质在圆底烧瓶底部形成较为均匀的脂质薄膜，再加入适量包含有冬凌草甲素的PBS缓冲液继续旋转0.5h～2h，在4-5℃内放置过夜使其充分水化，加入适量玻璃珠，再充入惰性气体后机械振荡0.5h～2h，制备得到携带冬凌草甲素叶酸靶向脂质微泡。超声介导下对其抗肿瘤活性进行初步研究，体内研究证实其显著抑制叶酸受体高表达的肝癌、乳腺癌和胃癌的生长。
【专利说明】叶酸靶向超声促发冬凌草甲素脂质微泡及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于药物制剂领域，涉及治疗肝癌、乳腺癌和胃癌的的叶酸靶向超声促发 冬凌草甲素脂质微泡体。
【背景技术】
[0002] 全国肿瘤登记中心发布的《2012中国肿瘤登记年报》中获悉，每分钟就有6人确 诊为癌症。原发性肝癌（主要为肝细胞癌，以下简称肝癌）是全球范围内发病率排第6,病 死率排第3位的恶性肿瘤，每年约74. 83万例新发病例，全球每年肝癌死亡病例约70万人。 在亚洲地区，由于乙型肝炎病毒的传播等原因导致肝癌发病率较世界其他地区为高，中国 为肝癌的高发地区，约占全球肝癌病例的55%，其病死率在中国排第2位。肝癌在江苏省发 病和死亡率已都升到第一位。乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，发病率占全身各种恶 性肿瘤的7-10%，在妇女仅次于子宫癌，已成为威胁妇女健康的主要病因。它是一种通常发 生在乳房腺上皮组织，严重影响妇女身心健康甚至危及生命的最常见的恶性肿瘤之一。目 前抽样调查到的北京、上海、天津、哈尔滨、武汉等大城市，乳腺癌已跃居妇女恶性肿瘤发病 的第一位。胃癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，在我国其发病率居各类肿瘤的首位，每年约 有17万人死于胃癌，几乎接近全部恶性肿瘤死亡人数的1/4,且每年还有2万以上新的胃癌 病人产生出来，胃癌确实是一种严重威胁人民身体健康的疾病。胃癌可发生于任何年龄，但 以40?60岁多见，男多于女，约为2:1。胃癌可发生于胃的任何部位，但多见于胃窦部，尤 其是胃小弯侧。未经治疗者平均寿命约为13个月。
[0003] 恶性肿瘤目前主要的治疗方法包括外科手术、化学治疗和放射治疗等。外科手术 是首选的治疗方法，但大部分患者就诊时伴有转移病灶，原发灶手术不能切除，手术无法达 到根治，化疗往往是可供选择的主要治疗方法。许多化疗药物在体外显示出良好的抗肿瘤 活性，而在体内实际应用时效果却不理想。通过传统的注射途径使用化疗药物，药物均匀分 布在全身血液循环中，对肿瘤缺乏特异亲和性，药物在到达肿瘤之前，要经过同血浆蛋白结 合、代谢、分解等步骤，最终只有少量药物到达肿瘤部位。要提高疗效就必须提高肿瘤内化 疗药物浓度，也就必须加大药物剂量，同时也加大了化疗药物的毒副反应。因此有必要将化 疗药物制成能有效到达肿瘤部位，提高疗效、降低毒副作用的靶向制剂。
[0004] 冬凌草甲素（oridonin)是从唇形科（Labtea)香茶菜属（Rabdosia)植物 中分离出的一种贝壳杉稀二猫类天然有机化合物，主要植物来源有：香茶菜Rabdosia amethystoides、显脉叶香茶菜 Rabdosia nervosa、毛叶香茶菜 Rabdosia jabdsia、道 孚香茶菜Rabdosia dow nsis、冬凌草或碎米亚Rabdosia rubescens和延命草Isodon japonicus。该成分具有较强的抗肿瘤活性，对多种移植性肿瘤有效，临床上主要用于肝癌、 食管癌、胰腺癌等的治疗。
[0005] 随着生命科学、分子药物学、材料科学及信息科学的迅猛发展，各学科间交叉渗 透，药物制剂的新技术、新工艺、新辅料、新材料、新设备不断涌现，药物剂型已从第一代普 通剂型发展为第四代革巴向给药系统（Targeted Drug Delivery System，TDDS)，TDDS属于新 型给药系统，能够在机体特定部位智能性释放药物，又称为"生物导弹"，特别适合抗肿瘤类 药物的递送。TDDS的策略之一主要是根据各种组织或器官某种特异性受体的高表达来设计 载体材料与生物分子的结合，以利于药物浓集于靶器官、靶组织、靶细胞。常见的药物载体 有病毒、脂质体、脂质微球、多聚复合物等。
[0006] 脂质体作为药物载体满足了治疗上的许多要求，药物由脂质体携带后，能改变其 体内的药动学行为，降低毒副作用和提高疗效。但因稳定性不够，产品包封率较低和靶向性 分布欠佳等不足，因此这些微粒载体只能发挥被动靶向的作用，容易被网状内皮系统的巨 细胞吞，使得其应用受到限制。LCL(Long circulation liposome)是在脂质体的组成 成分中加入一定比例的糖脂或在其磷酸分子上联接保护性聚合物，如两亲性的PEG的二硬 脂酸磷醋酰胺的衍生物-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇（[1，2_(1；[016071-811-817061'0-3-phosphoethanolamine-n- [poly (ethyleneglycol) ]，PEG-DSPE)、聚丙稀酰胺（PAA)、聚乙 烯吡咯烷酮（PVP)等，使一些亲水性的多糖或多羟基基团暴露于脂质体表面，从而减少脂 质体与血浆中调理素的结合，增加其血液稳定性，延长其血浆半衰期和药物在血液中的时 间，成为提高药物疗效及降低药物毒副作用的有效手段。为提高脂质体的靶向性，人们对脂 质体的组成和其表面修饰进行了大量的研宄。
[0007] 近期研宄结果表明，叶酸受体（Folate receptors，FR)[-种由糖基化磷脂 酰肌醇（GPI)连接的胞膜糖蛋白，分子量为38-40kD，主要有a-FR、β-FR和γ-FR三 种亚型]在多数肿瘤细胞表面高表达[鼻咽癌（KB)、子宫颈癌（HeLa，HeLa229)、肝癌 (SMMC7721，Bel7402，HePG-2)、胃癌（SGC-7901)和肺癌（SPC-A-I)]，已成为肿瘤诊断和治 疗研宄的新靶点。将叶酸偶联高分子材料修饰普通脂质体结合制备成叶酸靶向脂质体，因 叶酸类似物与FR特异性接合，可致脂质体主动靶向作用于某些叶酸受体高表达的肿瘤细 胞，通过细胞胞饮途径转入胞内，既可实现药物浓度积聚肿瘤细胞内，又可避免药物对其它 正常组织的非特异性结合，结果提高了抗肿瘤药物的治疗作指数，又降低药物的毒副作用。
[0008] 脂质微泡（Liposome-microbubble)就是包封气体的脂质体。常见的充入气体主 要有：二氧化碳、氧气、空气、大分子的惰性气体（多为氟碳气体，如六氟化碳）。近年来，月旨 质微泡作为超声造影剂的同时，又开始作为药物载体应用于一些疾病的治疗。一方面，载药 超声微泡在受到低频超声辐照时，微泡会发生爆破从而释放其中携载的药物；另一方面，超 声微泡在较低声压作用下产生的空化或声孔效应，可使临近细胞产生瞬间可修复的细胞膜 空隙，从而大大增加药物的细胞摄取和生物利用度。迄今，超声靶向微泡爆破介导药物或基 因的靶向传递已经成为一种新型的给药方法，是目前药物传递系统研宄的热点课题。但该 项技术仍然存在一些技术难题：例如脂质微泡作为药物载体，其载药量不高；抗肿瘤药物 局部浓度低、维持时间短；载药脂质微泡的靶向性有待进一步提高。
【发明内容】
[0009] 本发明的目的在于制备叶酸靶向超声促发冬凌草甲素脂质微泡，确保通过叶酸受 体介导将冬凌草甲素脂质微泡输送至肝脏、乳腺和胃肿瘤细胞内。既解决递药系统靶向性 问题，也克服脂质体在生理状态下难以穿透细胞膜的问题，提高药物的抗肿瘤作用。与现有 传统的叶酸受体介导的给药方法相比，将具有更明显的优越性和广阔的临床应用前景。
[0010] 本发明的目的通过如下技术方案来实现的：
[0011] 叶酸靶向超声促发冬凌草甲素脂质微泡包含如下组份：
[0012] 冬凌草甲素 1份 磷脂类成分 1.0-20份 胆固醇 0.5-10份 叶酸偶联的高分子复合物 0.1-1.5份
[0013] 惰性气体 0.5-4份 PBS缓冲液 10-100份 抗氧剂 0.5-5份
[0014] PBS 缓冲液的 pH 为 7. 0-7. 5。
[0015] 所述磷脂类成分选自蛋黄卵磷脂和大豆卵磷脂。
[0016] 所述叶酸偶联的高分子复合物选自叶酸-聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺（FA-PEG-PE)、 叶酸-聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺（FA-PEG-DSPE)、叶酸-聚乙二醇-二油酰磷脂酰 乙醇胺（FA-PEG-DOPE)、叶酸-聚乙二醇-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺（FA-PEG-DPPE)、叶酸-聚 乙二醇-双肉豆蔻磷脂酰乙醇胺（FA-PEG-DMPE)、叶酸-聚乙二醇-胆固醇（FA-PEG-Chol) 和叶酸-聚乙二醇-胆甾醇半琥珀酸酯（FA-PEG-CHEMS)中的一种或几种。
[0017] 所述惰性气体成分选自氮气、二氧化碳、六氟化硫、氟碳气体一种或几种。
[0018] 所述抗氧剂选自表没食子儿茶素没食子酸酯、维生素 E、维生素 E酯、亚硫酸钠、 亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、硫代硫酸钠、没食子酸丙酯、叔丁基对羟基茴香醚、二叔丁基对甲 酚、半胱氨酸和蛋氨酸。
[0019] 本发明提供了上述叶酸靶向超声促发冬凌草甲素脂质微泡制备方法，按照以下步 骤进行：称取磷脂类成分、胆固醇、叶酸偶联的高分子复合物置于圆底烧瓶中，加入溶剂溶 解，减压蒸发溶剂，脂质在圆底烧瓶底部形成较为均匀的脂质薄膜，再加入适量包含有冬凌 草甲素的PBS缓冲液继续旋转0. 5h?2h，在4-5°C放置过夜使其充分水化，加入适量玻璃 珠，再充入惰性气体后机械振荡〇. 5h?2h，制备得到携带冬凌草甲素脂质微泡。
[0020] 所述溶剂为甲醇、乙醇、丙酮、二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯和石油醚中的一种或 几种。
[0021] 叶酸靶向超声促发冬凌草甲素脂质微泡在抑制肝癌、乳腺癌或胃癌中癌细胞的应 用。
[0022] 与现有技术相比，本发明的优点是：
[0023] 1.本发明制备的叶酸靶向超声促发冬凌草甲素脂质微泡平均粒径600nm左右， 5°C条件下贮藏有良好的稳定性。冬凌草甲素包封率在90%以上。
[0024] 2.在超声介导条件下用于抑制肝癌、乳腺癌或胃癌的癌细胞，达到了极好的抑制 肿瘤的效果。
【具体实施方式】
[0025] 下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
[0026] 实施例1
[0027] 叶酸靶向超声促发冬凌草甲素脂质微泡的制备，按照以下步骤进行：称取大豆卵 磷脂130mg、胆固醇70mg、FA-PEG-DSPE (叶酸偶联的高分子复合物）500mg置于圆底烧瓶中， 加入30mL乙醇溶剂溶解，减压蒸发溶剂，脂质在圆底烧瓶底部形成较为均匀的脂质薄膜， 再加入包含有40mg冬凌草甲素（C 2tlH28O6)和40mg表没食子儿茶素没食子酸酯的PBS缓冲 液30mL继续旋转0. 5h，在冰箱（4-5°C )放置过夜使其充分水化，加入适量玻璃珠，再充入 二氧化碳气体200mg后机械振荡0. 5h，制备得到携带冬凌草甲素脂质微泡。
[0028] 经检测，该液体制剂中脂质体的平均粒径为560nm，粒子直径均在IOOOnm以下，粒 径分布狭窄，表明脂质体大小较为均一。冬凌草甲素包封率在91%。该脂质体液体制剂在 室温下可稳定存放数天，5°C下可稳定存放至少4个月，贮存期间观察不到聚集、沉淀或分 层现象。
[0029] 实施例2
[0030] 叶酸靶向超声促发冬凌草甲素脂质微泡的制备，按照以下步骤进行：称取大豆卵 磷脂130mg、胆固醇70mg、FA-PEG-Chol 500mg叶酸偶联的高分子复合物置于圆底烧瓶中， 加入30mL丙酮溶剂溶解，减压蒸发溶剂，脂质在圆底烧瓶底部形成较为均匀的脂质薄膜， 再加入包含有40mg冬凌草甲素和40mg表没食子儿茶素没食子酸酯的PBS缓冲液30mL继 续旋转〇. 5h，在冰箱（4°C )放置过夜使其充分水化，加入适量玻璃珠，再充入二氧化碳气体 200mg后机械振荡2h，制备得到携带冬凌草甲素脂质微泡。
[0031] 经检测，该液体制剂中脂质体的平均粒径为620nm，粒子直径均在IOOOnm以下，粒 径分布狭窄，表明脂质体大小较为均一。冬凌草甲素包封率在90%。该脂质体液体制剂在 室温下可稳定存放数天，5°C下可稳定存放至少4个月，贮存期间观察不到聚集、沉淀或分 层现象。
[0032] 实施例3
[0033] 叶酸靶向超声促发冬凌草甲素脂质微泡的制备，按照以下步骤进行：称取大豆卵 磷脂130mg、胆固醇70mg、FA-PEG-CHEMS叶酸偶联的高分子复合物置于圆底烧瓶中，加入 30mL二氯甲烷溶剂溶解，减压蒸发溶剂，脂质在圆底烧瓶底部形成较为均匀的脂质薄膜，再 加入包含有40mg冬凌草甲素和40mg表没食子儿茶素没食子酸酯的PBS缓冲液30mL继续 旋转0.5h，在冰箱（4°C )放置过夜使其充分水化，加入适量玻璃珠，再充入二氧化碳气体 200mg后机械振荡lh，制备得到携带冬凌草甲素脂质微泡。
[0034] 经检测，该液体制剂中脂质体的平均粒径为480nm，粒子直径均在IOOOnm以下，粒 径分布狭窄，表明脂质体大小较为均一。冬凌草甲素包封率在94%。该脂质体液体制剂在 室温下可稳定存放数天，5°C下可稳定存放至少4个月，贮存期间观察不到聚集、沉淀或分 层现象。
[0035] 对比例1冬凌草甲素脂质微泡制备
[0036] 冬凌草甲素脂质微泡的制备，按照以下步骤进行：称取大豆卵磷脂130mg、胆固醇 70mg置于圆底烧瓶中，加入30mL溶解，减压蒸发溶剂，脂质在圆底烧瓶底部形成较为均匀 的脂质薄膜，再加入适量包含有40mg冬凌草甲素和40mg表没食子儿茶素没食子酸酯的PBS 缓冲液30mL继续旋转0. 5h，在冰箱（4°C )放置过夜使其充分水化，加入适量玻璃珠，再充 入二氧化碳气体200mg后机械振荡lh，制备得到携带冬凌草甲素脂质微泡。
[0037] 对比例2冬凌草甲素脂质体制备
[0038] 冬凌草甲素脂质体的制备，按照以下步骤进行：称取大豆卵磷脂130mg、胆固醇 70mg置于圆底烧瓶中，加入30mL溶解，减压蒸发溶剂，脂质在圆底烧瓶底部形成较为均匀 的脂质薄膜，再加入适量包含有40mg冬凌草甲素和40mg表没食子儿茶素没食子酸酯的PBS 缓冲液30mL继续旋转0. 5h，在冰箱（4°C )放置过夜使其充分水化，加入适量玻璃珠后机械 振荡lh，制备得到携带冬凌草甲素脂质体。
[0039] 对比例3冬凌草甲素注射液的制备
[0040] 冬凌草甲素注射液的制备，按照以下步骤进行：称取40mg冬凌草甲素和40mg表没 食子儿茶素没食子酸酯溶于30mL的0. 5%吐温-80生理盐水溶液中即得。
[0041] 实施例1-3和对比例1-3在超声条件下体内抑瘤作用
[0042] 超声促发冬凌草甲素脂质微泡抑制裸鼠体内人肝癌、乳腺癌和胃癌的作用
[0043] 将人肝癌HePG-2细胞、乳腺癌MCF-7细胞及胃癌MGC-803细胞分别接种于裸鼠 右前肢根部皮下，建立荷人肝癌、乳腺癌和胃癌裸鼠皮下移植瘤模型，进行体内抑瘤试验。 考察叶酸靶向超声促发冬凌草甲素脂质微泡、冬凌草甲素脂质微泡、冬凌草甲素脂质体和 冬凌草甲素注射液小鼠尾静脉给药，给药后超声辐照（频lOOOkHZ，声强0. 75w/cm2,时间 Imin)。每天治疗一次，连续治疗10天后处死裸鼠，剥离肿瘤计算荷人肝癌、乳腺癌和胃癌 裸鼠的抑瘤率。结果见表1?3。
[0044] 表1各组药物对荷人肝癌裸鼠肿瘤生长抑制率的影响
[0045]
【权利要求】
1. 一种叶酸靶向超声促发冬凌草甲素脂质微泡，其特征在于，以重量份计，包含如下组 分组成：
2. 如权利要求1叶酸靶向超声促发冬凌草甲素脂质微泡，其特征在于，所述的PBS缓冲 液的 pH 为 7. 0-7. 5。
3. 如权利要求1叶酸靶向超声促发冬凌草甲素脂质微泡，其特征在于，所述磷脂类成 分选自蛋黄卵磷脂和大豆卵磷脂。
4. 如权利要求1叶酸靶向超声促发冬凌草甲素脂质微泡，其特征在于，所述叶酸偶联 的高分子复合物选自叶酸-聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺、叶酸-聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙 醇胺、叶酸-聚乙二醇-二油酰磷脂酰乙醇胺、叶酸-聚乙二醇-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、叶 酸-聚乙二醇-双肉豆蔻磷脂酰乙醇胺、叶酸-聚乙二醇-胆固醇和叶酸-聚乙二醇-胆 甾醇半琥珀酸酯中的一种或几种。
5. 如权利要求1叶酸靶向超声促发冬凌草甲素脂质微泡，其特征在于，所述惰性气体 选自氮气、二氧化碳、六氟化硫和氟碳气体中的一种或几种。
6. 如权利要求1叶酸靶向超声促发冬凌草甲素脂质微泡，其特征在于，所述抗氧剂选 自表没食子儿茶素没食子酸酯、维生素E、维生素E酯、亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、 硫代硫酸钠、没食子酸丙酯、叔丁基对羟基茴香醚、二叔丁基对甲酚、半胱氨酸和蛋氨酸中 的一种或几种。
7. 如权利要求1-6任一所述的叶酸靶向超声促发冬凌草甲素脂质微泡的制备方法， 其特征在于，按照以下步骤进行：称取磷脂类成分、胆固醇、叶酸偶联的高分子复合物置 于容器，加入溶剂溶解，减压蒸发溶剂后再加入包含有冬凌草甲素的PBS缓冲液继续旋转 0. 5h?2h，在4-5 °C下放置过夜使其充分水化，加入玻璃珠，再充入惰性气体后机械振荡 0. 5h?2h，制备得到携带冬凌草甲素脂质微泡。
8. 如权利要求7所述的叶酸靶向超声促发冬凌草甲素脂质微泡的制备方法，其特征在 于，所述溶剂为甲醇、乙醇、丙酮、二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯和石油醚中的一种或几种。
9. 如权利要求1-6任一所述的叶酸靶向超声促发冬凌草甲素脂质微泡在抑制肝癌、乳 腺癌或胃癌中的癌细胞的应用。
10. 如权利要求9所述的应用，其特征在于，包括人在内的哺乳动物。
【文档编号】A61K47/34GK104490784SQ201410790575
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2014年12月18日 优先权日:2014年12月18日
【发明者】李伟, 王传金, 张哲 , 徐悦 申请人:南京理工大学