本发明涉及一种猪繁殖与呼吸综合症病毒疫苗，特别涉及一种含有包埋有灭活的prrsv抗原的聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米颗粒及卡介菌裂解物的猪繁殖与呼吸综合症病毒疫苗，本发明属于生物制药技术领域。
背景技术：
猪繁殖与呼吸综合症(porcinereproductiveandrespiratorysyndrome，prrs)是猪的慢性病，在全球养殖猪的国家流行，国内流行prrs，每年造成经济损失约400亿。猪繁殖与呼吸综合症病毒((porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus，prrsv)是prrs的病原，prrsv是动脉炎病毒科的一双链rna病毒，有二种基因型，欧洲型(i型)和美洲型(ii型)。每种基因型又有多种遗传谱系。prrsv病毒基因型、抗原性变化多样，在自然界容易变异、重组。
prrsv感染机体后2天到数周可重塑免疫系统，通过重要抗病毒细胞因子生成减少和一些负向抑制免疫反应的细胞因子生成增强抑制机体免疫反应。除此之外，猪感染prrsv后，病毒中和抗体生成延迟，感染3-4周后才产生中和抗体且水平低下。自prrsv病毒发现以来，国内外开发了灭活和减毒修饰活疫苗(modifiedlive，prrs-mlv)用于prrsv控制。尽管如此,prrs-mlv对易感猪有传播疫苗突变株的风险，活疫苗株也有毒力返祖的可能，对异型基因病毒攻击保护力低，不能消除病毒感染。灭活疫苗尽管安全性好，但免疫原性弱。因此，急需研制出一种安全、高效、且能够实现对病毒交叉保护的prrsv疫苗。
技术实现要素：
针对目前存在的问题，本发明所要解决的技术问题是提供一种安全、高效、且能够实现对病毒交叉保护的prrsv疫苗。
为了达到上述目的本发明采用了以下技术手段：
本发明的一种猪繁殖与呼吸综合症病毒(porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus，prrsv)纳米颗粒疫苗(命名为np-plga-pkwag)，其特征在于含有聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米颗粒以及佐剂，其中所述的聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米颗粒中包埋有纯化灭活的完整prrsv抗原。
在本发明中，优选的，灭活前的prrsv滴度为1×105-1×107tcid50/ml，灭活后的疫苗中含有20-60μg/ml纯化灭活的完整prrsv抗原。
在本发明中，优选的，包埋有纯化灭活的完整prrsv抗原的聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米颗粒是通过以下方法制备得到的：
称取plga50/50750mg溶于5ml二氯甲烷中，使其终浓度为15％(w/v)，加入含5毫克纯化灭活的完整prrsv抗原的溶液100微升，用匀浆器以6000rpm速度混匀90秒，获得均匀混合物，在混合物中加入60毫升10％(w/w)的聚乙烯醇溶液,匀浆器中混匀5分钟，最后室温搅拌过夜让溶剂挥发，用蒸馏水通过三次11000g离心洗涤3次，湿的纳米颗粒冻干或4℃保存，即得。
其中，优选的，所述的纯化灭活的完整prrsv抗原是通过以下方法制备得到的：
(1)病毒培养
细胞工厂培养marc-145细胞，培养基为含10％灭活胎牛血清、100μg/ml链霉素以及100iu/ml青霉素的dmem培养液，培养条件为37℃，5％co2环境；
marc-145细胞用细胞工厂培养扩大，转入盛有含10％胎牛血清的dmem培养基和微载体cytodex1的生物反应器，37℃培养3-4天，培养液ph7.2±0.2，氧饱和度25±0.1％，搅拌速度中速；prrsv以0.01moi感染，分别在第7、11、15天收获病毒培养液，每收获一次，补加病毒液感染；
(2)澄清
收获的病毒培养液用8μm的聚丙烯预过滤器过滤，再经0.8μm和0.2μm的过滤器过滤澄清，测定病毒滴度；
(3)离子交换层析
澄清的病毒液加入经平衡缓冲液平衡的离子交换层析柱，用洗脱液进行洗脱；
其中，所述的平衡液为含有150mmnacl的20mmtris溶液，ph＝7.5；所述的洗脱液为含有600mmnacl的20mmtris溶液，ph＝7.5；
(4)超滤透析
从离子交换层析柱洗脱的病毒液用100kd膜超滤透析，透析液为含有150mmnacl的20mmtris溶液，ph＝7.5；
(5)蔗糖密度梯度超速离心
30-60％蔗糖密度梯度超速离心病毒液，21000rpm的转速下离心2小时，收集分布在蔗糖区带的病毒液，用ph＝7.5的，含有150mmnacl的50mm磷酸缓冲液稀释至原来体积的12-13倍；
(6)灭活
纯化的病毒用rpmi1640稀释至1×107-1×108tcid50/ml，用0.1m双乙烯亚胺37℃灭活1小时，0.1mm磷酸硫代纳37℃中和2小时；
(7)透析
用100kda的膜浓缩6倍，用ph＝7.5的，含有150mmnacl的50mm磷酸缓冲液透析；
经以上方法制备的纯化灭活的完整prrsv抗原的含量相当于灭活前的0.5×106tcid50-2.5×106tcid50/ml。
在本发明的一个具体实施例中，所述的prrsv为高致病性猪繁殖与呼吸综合症病毒hp-prrsv-jxm-f5株，其为在marc-145细胞上传至5代的适应株，其微生物保藏号是：cgmccno.9453，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期2014年7月8日。该病毒株已记载在申请日为2014-12-30，申请号为201410842421.9，发明名称为“一种广谱粘膜免疫防控猪繁殖与呼吸综合症的疫苗组合物及其应用”的专利申请中。
在本发明中，优选的，所述的佐剂为卡介菌裂解物。更优选的，所述的卡介菌裂解物为卡介菌d2bp302s11的裂解物。
在本发明中，优选的，所述的卡介菌裂解物的含量为100-500μg/ml。
在本发明的一个具体实施例中，所述的卡介菌裂解物是通过以下方法制备得到的：
卡介菌用培养基37℃静止培养2-3周，培养物于121℃下30分钟进行杀菌处理，离心收获菌体，pbs洗涤2次，按2g/ml悬浮于含8mmedta、蛋白酶抑制剂、dna酶、rna酶的pbs中，用玻璃珠破碎细菌，期间快速染色观察破碎状况，直到90％菌体破碎，3000g离心沉淀未破碎的细胞、不溶的细胞壁成分，收获裂解上清液获得全菌体裂解物；上清液经0.2μm、低蛋白结合的膜过滤，按3.0g/l加入苯酚，内毒素含量≤0.002μg/mg蛋白，于2-8℃保存，即得。
使用本发明的疫苗组合物经鼻内免疫猪后，采用同型prrsv病毒和异型prrsv病毒进行攻击，结果表明：本发明的疫苗组合物能够激发猪体产生抗prrsv感染的保护性免疫应答，能够抵抗同型病毒和异型病毒的感染，完全清除病毒血症。与使用灭活纯化的完整prrsv抗原(pkwag)免疫比较，本发明的prrsv纳米颗粒疫苗(np-plga-pkwag)可成倍增强抗同型prrsv攻击的体液免疫和细胞免疫，显著、成倍增强猪肺部和血液的病毒中和抗体和iga应答，显著、成倍降低肺部il-10水平。
因此，进一步的，本发明还提出了所述的疫苗在制备预防或治疗猪繁殖与呼吸综合症药物中的用途。
本发明也提供了所述纳米颗粒疫苗的给苗剂量，即10ug/头-100μg/头，优选20ug/头-60ug/头；给苗次数可为1-2次，间隔2-4周，优选2周；给苗途径可为鼻内点滴、鼻内气雾胶、肌肉、皮下，优选鼻内点滴。
相较于现有技术，本发明的有益效果为：
1、本发明所述疫苗中的抗原为具有完整病毒颗粒结构的灭活prrsv病毒抗原，经紫外辐射或bei灭活，由于是完整病毒颗粒，故保留了prrsv功能性免疫表位，在佐剂的作用下，能够高效诱导了th1免疫反应，而一般灭活疫苗只诱导th2反应。
2、本发明所述疫苗中含包埋有灭活的prrsv抗原的聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米颗粒，在本发明中使用生物可降解的聚乳酸-羟基乙酸共聚物(poly(lactideco-glycolide)(plga))作为纳米载体，其可自我组装纳米颗粒，具有良好的重复性。在ph中性环境带有正电荷。纳米颗粒可投递灭活prrsv到目标靶位且具有免疫原性。灭活prrsv包埋于或包裹于纳米颗粒中，可通过水/油/水乳化方法获得。根据多聚化中乳酸和羟基乙酸的使用比例，可获得不同形式的plga。乳酸和羟基乙酸的不同比例适合本发明，如0:10,80:20,70:30,60:40,50:50,40:60,30:70,20:80,10:90，本发明中共多聚体组合中plga50:50含50％乳酸和50％羟基乙酸。在实例中，750mgplga和5mg灭活(或150mgplga和1mg灭活prrsv)混合，包埋或包裹效率不同，在实例中纳米颗粒有50-55％的包埋或包裹效率。
3、抗原一般通常需要佐剂增强免疫反应使疫苗有效。佐剂的组分增强抗原单独引起的免疫反应。本发明所述疫苗中，进一步包括一或多种佐剂，佐剂可以是兽医学和药学接受的组合。优选的，所述的佐剂为bcg疫苗株全菌体裂解物，其具有高度安全性，另外制造工艺简单、造价低廉。
4、本发明的疫苗组合物能够激发猪体产生抗prrsv感染的保护性免疫应答，能够抵抗同型病毒和异型病毒的感染，完全清除病毒血症。与使用灭活纯化的完整prrsv抗原(pkwag)免疫比较，本发明的prrsv纳米颗粒疫苗(np-plga-pkwag)可成倍增强抗同型prrsv攻击的体液免疫和细胞免疫，显著、成倍增强猪肺部和血液的病毒中和抗体和iga应答，显著、成倍降低肺部il-10水平。
5、prrsv起初感染猪的途径是呼吸道和生殖器粘膜，感染靶位是巨噬细胞。鼻内投递疫苗对动物无侵袭性，可在系统部位和粘膜部位，如呼吸道黏膜、生殖道粘膜引起保护性的免疫。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1灭活纯化完整的猪繁殖与呼吸综合症病毒抗原制备
1.1病毒、细胞、培养液
高致病性猪繁殖与呼吸综合症病毒hp-prrsv-jxm-f5株，其为在marc-145细胞上传至5代的适应株，分类命名为高致病性猪繁殖与呼吸综合症病毒，其微生物保藏号是：cgmccno.9453，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期2014年7月8日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。该病毒株已记载在申请日为2014-12-30，申请号为201410842421.9，发明名称为“一种广谱粘膜免疫防控猪繁殖与呼吸综合症的疫苗组合物及其应用”的专利申请中。
稳定无外源因子、符合疫苗抗原生产的marc-145细胞用于疫苗抗原生产和体外分析，细胞维持液为含10％胎牛血清、100μg/ml链霉素以及100iu/ml青霉素的dmem(invitogen)培养液，病毒培养液为含0.1％的马血清mem培养液。
1.2病毒培养
细胞工厂培养marc-145细胞，培养基为含10％灭活胎牛血清、100μg/ml链霉素以及100iu/ml青霉素的dmem(invitogen)培养液。培养条件37℃，5％co2环境。
marc-145细胞用细胞工厂培养扩大，转入盛有含10％胎牛血清的dmem培养基(invitrogen)和微载体cytodex1的生物反应器，37℃培养3-4天，培养液ph7.2±0.2，氧饱和度25±0.1％，搅拌速度中速。猪繁殖与呼吸综合症病毒hp-prrsv-jxm-f5以0.01moi感染，分别在第7、11、15天收获病毒培养液，每收获一次，补加病毒液感染。
1.3澄清
收获液用8μm的聚丙烯预过滤器过滤，再经0.8μm和0.2μm的过滤器过滤澄清，测定病毒滴度(tcid50)。
1.4离子交换层析
澄清的病毒液加入经平衡缓冲液(20mmtris，150mmnacl，ph＝7.5)平衡的离子交换层析柱，用洗脱液(20mmtris，600mmnacl，ph＝7.5)进行洗脱。
1.5超滤透析
从离子交换层析柱洗脱的病毒液用100kd膜超滤透析(20mmtris，150mmnacl，ph＝7.5)。
1.6蔗糖密度梯度超速离心
30-60％蔗糖密度梯度超速离心病毒液，21000rpm的转速下离心2小时，收集分布在蔗糖区带的病毒液，用磷酸缓冲液(50mm磷酸缓冲液，150mmnacl,ph＝7.5)稀释至原来体积的12-13倍。
1.7灭活
纯化的病毒用rpmi1640稀释至108tcid50/ml，用0.1m双乙烯亚胺37℃灭活1小时，0.1mm磷酸硫代纳37℃中和2小时。
灭活验证试验：1ml灭活液加入装有50ml培养液的150cm2细胞瓶，37℃培养1周，换新鲜培养液继续培养1周。同时接种1ml的未灭活病毒液到相同细胞瓶观察细胞病变效应。
1.8透析
用100kda的膜浓缩6倍，用磷酸缓冲液(50mm磷酸缓冲液，150mmnacl,ph7.5)透析。
经以上方法制备的纯化灭活的完整prrsv抗原(pkwag)含量相当于灭活前的0.5×106tcid50-2.5×106tcid50/ml。蛋白含量用商用bca蛋白检测试剂盒(bicinchoninicacidproteinassaykit，购自pierce公司)测定。以亲和层析纯化的猪繁殖与呼吸综合症病毒多克隆抗体为基础建立间接elisa法定量猪繁殖与呼吸综合症病毒的含量，利用平行线法测定猪体中和抗体的水平和纯化全病毒抗原量的关系，结果：纯化灭活猪繁殖与呼吸综合症病毒为20μg可产生保护性中和抗体，定为20单位，通过间接elisa法可估算灭活猪繁殖与呼吸综合症疫苗的效价。
实施例2.np-plga-pkwag的制备
1、材料：
聚乳酸-羟基乙酸共聚物50/50(plga50/50，mol.wt40-75kda)、聚乙烯醇(polyvinylalcohol，mol.wt.30-70kda)(购自sigma-aldrich公司)、二氯甲烷(购自acrosorganics公司)、bca蛋白检测试剂盒(bicinchoninicacidproteinassaykit，购自pierce公司)。
2、np-plga-pkwag的制备
采用标准双乳化溶剂蒸发方法制备，简述如下：
称取plga50/50750mg溶于5ml二氯甲烷中，使其终浓度为15％(w/v)，加入100微升含5毫克hp-prrsv-jxm-f5株纯化灭活蛋白(pkwag，实施例1制备)，用匀浆器以6000rpm速度均匀90秒，获得均匀混合物，在混合物中加入60毫升10％(w/w)聚乙烯醇(10％pva)溶液,匀浆器中均匀5分钟，最后室温搅拌过夜让溶剂挥发，用蒸馏水通过三次11000g离心洗涤3次，湿的纳米颗粒冻干或4℃保存，命名为np-plga-pkwag。
3、纳米颗粒大小、形态以及纳米颗粒包埋蛋白效率
用扫描电镜测定、观察纳米颗粒大小、形态(电镜hitachis-3500n)。待测冻干纳米颗粒使用离子包被仪置于金铂包被的粘附片上，在电镜上10kv观察。纳米包埋蛋白效率：冻干np-plga-pkwag(10mg)加入0.1nnaoh，37℃处理1小时，涡旋收获上清，用0.1nnaoh配制bsa和bca蛋白检测试剂盒(购自美国pierce公司)检测蛋白浓度。
4、包埋纯化灭活prrsv的纳米疫苗np-plga-pkwag的特征
扫描电镜观察plga包埋纯化灭活prrsv的纳米颗粒np-plga-pkwag为光滑圆球状，大小在200-600nm之间。以plga多聚体的使用量为准，纳米颗粒的产率为82.32±3.3％，纳米颗粒np表面静电荷-26mv。以包埋使用的prrsv总蛋白为准，纳米颗粒中平均蛋白含量0.50-0.55％(w/w)，代表包裹或包埋效率50-55％。在pbs中np-plga-pkwag重新扩散，在48小时prrsv缓慢释放，在接下来5周，也有释放。
5、聚焦显微镜下np-plga-pkwag的特征
3头4-6周龄、健康的spf猪支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolarlavagefluid，bal)分离收集巨噬细胞(bal-mnc)，接种24孔板，接种浓度1×106细胞/ml。24孔板含包被多聚l-赖氨酸的盖玻片，bal-mnc板37℃5％co2孵育1小时，倒去没有结合的细胞液，盖玻片用pbs轻轻洗涤。将冻干的np-plga-pkwag重悬于含10％fbs的dmem中，使其浓度达到0.2微克/ml。加入含bal-mnc的培养板，37℃孵育3小时。未感染prrsv或以0.1moi感染prrsv(hp-prrsv-jxm-f5)的bal-mnc板在37℃5％co2孵箱孵育12小时，用3％多聚甲醛在冰上固定15分钟，用0.1％tritonx-100浸透15分钟，室温下用含5％bsa、0.2％tritonx-100pbs封闭1小时。接着细胞加入抗prrsv核衣壳特异性单克隆抗体mabsdow17(美国农村技术有限公司产品)和内源交叉反应的抗猪人抗体(溶于含1％bsa、0.1％tritonx-100的pbs，购自美国santa-cruz公司)，室温放置1小时，加入羊抗鼠iggalexaflour488和驴抗羊抗体alexaflour633(购自美国invitrogen公司)，室温孵育1小时。在加入抗体步骤之间细胞洗涤且用含2.5％dabco(购自美国sigma公司)的液体处理。染色的盖玻片移到玻片在leica聚焦显微镜下观察，图像使用leica聚焦软件分析。用u型底的96孔板，每孔含1×106bal-mnc板也可用上述类似处理，获得类似可比结果。
6、流式细胞仪确定cd80/86细胞体外吸收np-plga-pkwag
抗原递呈细胞cd80/86接种24孔板，接种浓度1×106细胞/ml。分别向cd80/86中加入pkwag(纯化灭活的prrsv抗原)或np-plga-pkwag，使prrsv蛋白含量分别达到2、0.2、0.02微克/ml。在37℃5％co2孵箱孵育3小时。以0.1moi感染prrsv(hp-prrsv-jxm-f5)，在37℃5％co2孵箱孵育12小时。以未感染prrsv的cd80/86板细胞作为对照。洗涤后用生物素结合人ctla4鼠免疫球蛋白融合蛋白(购自美国ancell公司)、pe-结合cd172(购自美国southernbiotech公司)和streptavidinpercp-cy5.5依次染色，用1％多聚甲醛固定，使用facsariaii流式细胞仪(购自bdbiosciences公司)分析。
上述体外试验显示在正常生理条件下，纳米颗粒np-plga-pkwag在数周内间歇释放已经包埋或包裹的prrsv抗原，相比较未包裹的抗原pkwag，能够被猪肺泡巨噬细胞以及抗原递呈细胞cd80/86有效吸收。
实施例3卡介菌全菌体裂解物制备和检定
菌种卡介菌d2bp302s11，由中国药品和生物制品检定研究院提供，按生物制品生产检定用菌种管理规程建立种子批。工作种子批至菌体收集不应超过12代，在苏通培养基上卡介菌应浮于表面，为多皱、为黄色的菌膜，毒力试验、无有毒卡介菌试验结果阴性，冻干菌种于2-8℃保存，液体菌种-70℃以下保存。
卡介菌d2bp302s11用改良苏通综合培养基37℃静止培养2-3周，培养物于121℃下30分钟进行杀菌处理，用制备型低速离心机收获菌体，pbs(ph7.4)洗涤2次，按2g/ml悬浮于含8mmedta、蛋白酶抑制剂、dna酶、rna酶的pbs中，用玻璃珠破碎细菌，期间快速染色观察破碎状况，直到90％菌体破碎，3000g离心沉淀未破碎的细胞、不溶的细胞壁成分，收获裂解上清液获得全菌体裂解物(wcl)，上清液经0.2μm、低蛋白结合的膜过滤，按3.0g/l加入苯酚。bcg的裂解物wcl原液中含水溶性蛋白、脂类以及碳水化合物，内毒素水平应不高于0.002μg/mg蛋白，于2-8℃保存。bcg的裂解物wcl原液在2-8℃保存可保存5年，和prrsv灭活抗原配制疫苗时所用稀释液为0.01m/lpbs(ph7.2-7.4，含0.0005％聚山梨酯80及3.0g/l苯酚)。
wcl中的蛋白含量的测定采用凯氏定氮法(中国药典三部，2005年版附录vib)；wcl中内毒素水平依法检测(中国药典三部，2005年版附录xiie)；多糖含量测定、无有毒卡介菌试验、鉴别试验、致敏效应试验按中国药典三部(2005年版)p254-p255的方法进行；核酸含量测定采用紫外-可见分光光度法(中国药典三部(2005年版)附录iia；无菌检测按中国药典三部(2005年版)附录xiia的方法；异常毒性检测按中国药典三部(2005年版)附录xiif依法检查。
实施例4灭活纯化猪繁殖与呼吸综合症全病毒疫苗抗原纳米颗粒在猪体上安全、剂量、效果
1、猪繁殖与呼吸综合症病毒纳米颗粒疫苗的制备
1.1猪繁殖与呼吸综合症病毒纳米颗粒疫苗np-plga-pkwag(不含佐剂)的制备
按照实施例2方法制备得到。
1.2含有卡介菌全菌体裂解物的猪繁殖与呼吸综合症病毒纳米颗粒疫苗的制备
在实施例2制备得到的猪繁殖与呼吸综合症病毒纳米颗粒疫苗np-plga-pkwag的基础上，加入实施例3制备得到的卡介菌全菌体裂解物(佐剂)，使得每毫升疫苗(一剂)中含有灭活纯化完整prrsv抗原5-30μg，含有卡介菌裂解物500μg。
2、免疫效力实验
2.1方法
普通断奶，年龄在3-4周的猪在山西隆克尔生物制药有限公司bsl-2级猪舍饲养，经检验确证prrsv、猪呼吸冠状病毒、传染性胃肠炎病毒、猪流感病毒、猪口蹄疫病毒、猪圆环病毒、猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪细小病毒、猪戊型肝炎病毒阴性，且血清中无prrsv抗体。
np-plga-pkwag疫苗鼻内免疫猪，用同型prrsv病毒攻击进行评估。结果显示：和未免疫猪、纯化灭活prrsv疫苗抗原(pkwag)免疫猪比较，np-plga-pkwag疫苗免疫猪发生强烈的体液免疫和细胞免疫，病毒血症被完全清除。np-plga-pkwag疫苗免疫猪肺、血液的中和抗体、iga显著提升；np-plga-pkwag疫苗免疫猪肺裂解物含高水平的ifn-.gamma，低水平il-10；总之，结果显示：plga包埋纯化灭活prrs抗原形成的纳米疫苗np-plga-pkwag鼻内免疫在粘膜和系统部位安全、可激发强烈、丰足的免疫反应，可清除猪的病毒血症。
经筛选获得100头猪随机分成6组(n＝10头/每组)，鼻内分别免疫表1所示不同配方疫苗二剂，2ml/每头/每次,二次间隔2周，见表1，所有猪在免疫后28天鼻内感染攻击异型基因prrsv病毒(vr-2385基因i型)，感染剂量5×105tcid50/头，佐剂、抗原、单独配制、包埋，使用前配制。低剂量疫苗含抗原10μg/剂，高剂量疫苗含抗原30μg/剂，低剂量疫苗抗原含0.5×106tcid50灭活纯化prrsv，高剂量疫苗抗原含2.5×106tcid50灭活纯化prrsv，在纳米颗粒中包埋或不包埋。猪每日观察和检测呼吸症状。感染攻击后每隔3天测量肛门温度和体重并记录，在感染攻击第15天麻醉，进行进一步取样观察。
表1
2.2猪肺部肉眼损伤和病理观察
对上述所有病毒攻击后的猪的肺叶的肉眼损伤进行观察。从右边上肺叶取样本，用中性缓冲液配制的10％福尔马林固定，进行切片，切片厚度5微米，用苏木精和伊红染色，观察并对prrsv诱导的炎症打分。
2.3疫苗免疫作用评估
2.3.1支气管肺泡灌洗液收集、肺匀浆液制备、肺单核细胞分离
尸检收集猪肺，用25-30ml含抗生素和edta冷pbs洗涤气道，收集猪支气管肺泡灌洗(bronchoalveolarlavage，bal)液。收集液在4℃以2,851×g离心15分钟，获得澄清液分装贮存于-70℃备用。
每头猪收集1克从顶部右肺叶获得的组织，加到5毫升冰冷的dmem(dulbecco’smodifiedeagle’smedium，dmem)中，使用混合器破碎研磨、搅匀(stomacher400实验室混合器，购自英国seward有限公司)10分钟，(肺匀浆/非裂解物)澄清上清分装、贮存-70℃备用。各猪肺收集后，用胶原蛋白、dnase处理、研磨、分离获得肺单核细胞(lungmononuclearcells，lmncs)。
2.3.2总免疫球蛋白(immunoglobulin，ig)评估
猪总的同型特异性抗体水平用elisa评估。预先定量含羊抗猪igm、igg、iga液，按1：1000稀释，室温下包被96孔板，孵育过夜。96孔板封闭后，10倍稀释肺部匀浆物确定各同型抗体的量。用肺部匀浆物优化稀释度所测定的光密度(opticaldensity，od)值与所推算的同型抗体质量在一定范围值作为标准曲线，筛选所有测试样本。测定igm时，样本按1:200稀释，测定iga时，样本按1:3,000稀释。测定igg样本按1:100,000稀释。含1,000ng/mliga和igm、500ng/mligg的猪血清参考品用作各同型抗体的标准曲线，和各同型抗体标准曲线对比、调整稀释因子计算出肺组织同型抗体浓度，以mg/gm肺组织表示。
肺部prrsv特异同型抗体igg和iga
elisa板用预先测定的猪繁殖与呼吸综合症病毒hp-prrsv-jxm-f5株纯化灭活抗原pkwag(在碳-双碳缓冲液中，浓度5μg/ml，ph8.8)包被、封闭，肺匀浆液或bal液10倍系列稀释，用1；2000稀释的辣根过氧化物酶结合羊抗猪iga或igg(美国kpl公司产品)检测，用含0.3％h2o2abts溶液(2,2′-azinobis[3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonicacid]-diammoniumsalt,2,2′二联氨-[3乙苯)咪唑-6磺酸二胺盐]]和显色，用1％十二烷基磺酸钠(sodiumdodecylsulfate，sds)终止显色反应,在od405nm读板，根据背景和10倍稀释对照样本od值计算抗体水平。
2.3.3肺部prrsv特异性抗体的亲和性
bal(1:1)稀释液和肺匀浆1:10稀释液加入prrsv抗原包被和封闭好的板孔,室温孵育2小时，洗涤4次，2倍系列稀释硫代氰酸铵(ammoniumthiocyanate，nh4cn)使终浓度在5-0.313摩尔，每孔加入100μl，室温孵育10分钟，洗涤4次，按以上描述elisa方法进行其余步骤。nh4cn-微处理板孔(0m)有100％吸收(prrsv特异性抗原和抗体反应)，不同摩尔浓度nh4cn的od值和100％吸收值比较用以计算抗原和抗体相互反应。
2.3.4prrsv特异性igg1和igg2亚型评估
肺匀浆物10倍系列稀释加入封闭pkwag包被板，分别用鼠抗猪igg1或igg2亚型(购自美国abd血清公司)作为第二抗体，按1:250稀释使用，检测病毒特异性igg1或igg2亚型。洗涤板三次，辣根过氧化物酶结合羊抗鼠igg-hrp(购自美国sigma-aldrich公司)按1:10,000稀释加入，用tmb(3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine，四氨基联苯，购自美国kpl,公司)作为底物，1m磷酸作为终止液，在od450nm读数。待测样本按1：500稀释获得od值体现待检测样本prrsv特异性igg1和igg2抗体水平。
2.3.5酶联免疫点(enzyme-linkedimmunospot，elispot)法检测prrsv特异性ifn-γ分泌细胞
96孔板(multiscreenemd板，购自美国millipore公司)，预先过夜包被浓度为10μg/ml鼠抗猪ifn-γ单克隆抗体(购自bd生物科学公司),分离的lmncs加入丰富rpmi-1640培养基中，按5×105细胞/孔加入板中，加入hp-prrsv-jxm-f5纯化灭活全病毒抗原pkwag(50μg/ml)刺激24小时，洗板三次，加入用生物素标记浓度为3μg/ml抗猪ifn-γ抗体，加入链霉亲和素-辣根过氧化物酶结合物，加入3-氨基9-乙基咔唑(3-amino-9-ethylcarbazole，aec)底物(购自美国sigma-aldrich公司)。prrsv特异性免疫刺激细胞点(iscsspots)用读数仪计数(
2.3.6elisa评估不同细胞因子
肺匀浆物用于分析猪细胞因子。th1细胞反应的ifn-γ、il-12,炎症前期分子il-6，免疫抑制细胞因子il-10、β-转化生长因子(transforminggrowthfactorbeta，tgf-β)分别用elisa法或商用elisa试剂盒检测。
2.3.7流式细胞仪分析
洗涤分离的lmnc，用含10μmcfse的pbs(carboxyfluoresceindiacetatesuccinimidylester,cfse)在室温染色15分钟，用含10％fbs的冰冷rpmi终止反应，并洗涤2次，重悬于10％fbs的rpmi，37℃孵育30分钟，在平底96孔板上调整细胞浓度使每孔含有5×105细胞。
免疫染色lmncs中淋巴、骨髓t细胞的以及在免疫应答反应5000多次事件的表型以及发生频率采用流式细胞分析。上述hp-prrsv-jxm-f5纯化灭活全病毒抗原pkwag(50μg/ml)刺激lmncs孵育48小时或未用抗原刺激的lmncs孵育48小时，在孵育到42小时加入莫能菌素(monensin，golgiplug,购自bd生物科学公司)。用特异性、荧光素结合的不同猪淋巴细胞单克隆抗体染色使lmncs中cd3ε、cd4α、cd8α、cd56、tcr1n4细胞首先着色。细胞用1％多聚甲醛固定，用细胞透化缓冲液(85.9％去离子水、11％不含钙离子、镁离子的去离子pbs、0.1％不含钙离子、镁离子的福尔马林溶液、0.1％皂角素)4℃透化过夜处理。细胞洗涤三次，用荧光素标记的抗猪或用含0.1％皂角素的荧光素激活细胞分选(fluorescenceactivatedcellsorting，facs)缓冲液配制对照同型单克隆抗体(购自美国bd生物科学公司)染色。用facsariaii(购自美国bd生物科学公司)获得经过免疫染色lmncs，使用flowjo软件分析(software(美国treestar有限公司产品)。所有特异性免疫细胞频率用占总淋巴细胞或骨髓细胞百分比表示。
2.3.8prrsv载量、病毒中和抗体滴度、rna拷贝数
肺匀浆物和bal液中prrsv滴度、中和抗体滴度采用间接免疫荧光法检测。marc-145细胞培养达80-90％单层铺满时，加入倍比稀释的待测样本，继续培养48小时。为检测prrsv特异中和抗体滴度，待测样本56℃水浴灭活30分钟，254nm的紫外光灭活45分钟，2倍系列稀释样本与hp-prrsv-jxm-f5株病毒液、prrsvvr2385株病毒液之一混合，加入板孔在37℃孵育2小时，与hp-prrsv-jxm-f5株病毒混合时，每孔hp-prrsv-jxm-f5株病毒量为250tcid50；与prrsvvr2385株病毒混合时，每孔含prrsvvr2385株病毒量为200tcid50。prrsvn蛋白抗体(美国llc产品),作为第一抗体，按1：5000稀释使用，alexafluor488结合抗鼠igg(h+l)(美国生命技术公司产品)作为第二抗体，使用按1：3000稀释。细胞固定后进行荧光灶单位检测。经以上处理的板子用60％甘油-pbs(ph8)处理后在倒置荧光显微镜下观察。
肺匀浆物和bal液中prrsvrna提取采用magmaxtm96-病毒分离试剂盒(购自美国生命技术公司)，操作按厂家提供的说明书进行，cdna获得采用逆转录试剂盒(美国qiagen公司产品),cdna含量用定量实时多聚酶链反应法(quantitativereal-timepolymerasechainreaction，qpcr)，使用perfectasybr绿色快速混合试剂盒(美国quanta生物科学公司产品)，内含引物为prrsvorf-6引物，正向引物gataaccacgcatttgtcgtc，反向引物tgccgttgttatttggcata。用hp-prrsv-jxm-f5病毒液10倍稀释液制作病毒滴度与病毒rna定量的标准曲线，病毒液起始浓度为107tcid50/μl。
2.3.9统计分析
所有数据均为10头猪平均数，以平均数±标准误表示。统计用graphpadinstat5软件(美国lajolla公司产品)，采用方差单向、tukey’s多重比较检验或非配对t-检验分析。不同组比较p值小于0.05可认为有统计学显著意义。a表示2组与3组；b表示表示2组与4组；c表示2组与5组；d表示2组与6组；e表示3组与4组；f表示3组与5组；g表示3组与6组；h表示4组与5组；i表示4组与6组；表示5组与6组；
3结果
3.1含有bcgwcl作为佐剂的np-plga-pkwag疫苗能够显著减小肺部肉眼观察病理
苏木精、伊红染色肺切片进行显微观察有助于辨识肺炎症损伤部位的强度和范围。观察显示第6组猪肺部显示明显的有严重肺损伤，肺间质内伴有单核细胞大量浸润。而3-5组猪肺肉眼损伤与模拟6组猪肺有差别，且猪在感染攻击后一周内没有进食减少、不规则发热。4组猪肺肉眼观察到损伤介于3和5组猪肺损伤之间。相反在1组和2组猪肺观察到肉眼损伤、可检测到显微病理，损伤程度介于6组和3-5组之间。3-5组(np-plga-pkwag+bcgwcl)疫苗免疫猪肺损伤中等减小说明包埋有纯化灭活的完整prrsv抗原的聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米颗粒与佐剂组合能够最大限度的介导保护性免疫反应。
3.2prrsv感染攻击后猪肺的体液免疫反应
10μg和60μg/头剂量免疫组在感染攻击后的15天收集肺匀浆和bal液样本，通过elisa评估分析总igm、总igg、总iga，用elisa分析和评估prrsv特异性iga、prrsv特异性igg。prrsv特异性抗体量取3头猪(n＝10)od405nm平均值，以平均值±标准误表示；总抗体量取10头猪(n＝10)od405nm平均值，以平均值±标准误表示；p小于0.05可认为统计学显著差别。
1组到5组在2周内全部免疫，感染攻击后总igg的量都有2-3倍的增加。肺部匀浆总igm和iga量在prrsv感染攻击猪中都有差别。尽管如此，在肺匀浆物和bal液中igg水平、1组到5组在bal中igm和iga水平均高于空白免疫6组的4-5倍。重要的是np-plga-pkwag+bcgwcl疫苗免疫组(4组)猪肺匀浆物中总igg水平和pkwag+bcgwcl疫苗免疫组(1组)比较显著提高，prrsv同型特异iga抗体和prrsv同型特异igg抗体显著提高，结果如下表2所示。
表2.疫苗诱导的体液免疫反应和异型基因prrsv中和抗体(免疫后15天)
在低剂量疫苗(10μg/头)免疫3组和高剂量免疫((60μg/头)5组猪bal液、肺匀浆物中，prrsv特异性iga反应与其1组、2组比较显著提高。各病毒感染攻击组bal液中，病毒特异性igg水平有差异。低剂量或高剂量免疫2组和5组猪肺匀浆中，有高水平病毒特异性igg检出，病毒特异性igg水平显著提高。这表明佐剂-np-pkwag疫苗免疫组(3-5组)在气道表面(bal液中)病毒特异性iga是主要的同型抗体，iga和igg同型抗体在肺粘膜发挥重要作用。
抗原对异源抗体的结合强度为抗体的亲和性。np-plga-pkwag+bcgwcl疫苗免疫的猪，无论低剂量或高剂量免疫，在bal液中的特异性iga亲和性显著提高，只有低剂量免疫猪(3组)肺匀浆物中，特异性iga亲和性显著提高。高剂量疫苗免疫猪(5组)肺匀浆物中病毒特异性iga亲和性和所有免疫猪病毒特异iga亲和性水平相当。这些数据表明：prrsv特异iga亲和性增强，且在np-plga-pkwag+bcgwcl疫苗免疫猪气道表面维持较长时间。
通过定量检测抗原特异性igg亚型确定是否发生th1或th2为主的免疫反应。在猪的免疫反应中，高水平igg2表明疫苗诱导th1为主的免疫反应。高水平igg1表明疫苗诱导th2为主的免疫反应。在5组猪肺匀浆中igg2和igg1水平显著提高，igg1:igg2比例大于1为th2介导免疫反应，小于1为th1介导免疫反应。np-plga-pkwag+bcgwcl疫苗免疫的猪(3-5组)在感染攻毒15天后(pc15)，在肺匀浆物检测igg1和igg2，igg1:igg2比例接近1。在1组猪中，尽管igg1:igg2比例接近1，但检测到病毒特异igg1和igg2亚型抗体数量低。
除过6组(空白模拟组)，其他组所有猪用基因i型prrsvvr-2385株感染攻击，该毒株和疫苗株hp-prrsv-f5株(ii型)基因组序列有50％的差别。分析bal液和肺匀浆物中抗hp-prrsv-jxm-f5中和抗体，与bal液和肺匀浆物中抗prrsvvr2385中和抗体比较。在2-5组的猪中，bal液、肺匀浆物中抗hp-prrsv-jxm-f5中和抗体滴度平均为16、32，显著高于1组。5组接受高剂量免疫猪抗prrsvvr2332、抗prrsvvr2385中和抗体滴度显著高于4组、3组。pkwag和可溶性bcgwcl免疫猪(1组)的抗prrsvvr2385中和抗体滴度，显著低于5组猪抗vr-2385中和抗体滴度。
以上结果表明卡介菌全菌体可溶性裂解物(bcgwcl)佐剂纳米颗粒疫苗(np-pkwag)激发了广谱交叉反应中和抗体滴度。
3.3np-plga-pkwag+bcgwcl疫苗免疫猪肺中上调th1反应、下调免疫抑制细胞因子
在实际的应用中，通过elispot确定病毒特异iscs的频率检测抗prrsvcmi反应，是一种标准且商业化的方法。2-3组低剂量免疫猪的lmncsiscs与1组和4组、5组高剂量免疫猪比较，iscs的频率显著提高。5组猪肺匀浆物ifn-γ含量显著高于2组、4组和3组免疫猪。另外一种重要th1细胞因子il-12量在高剂量免疫猪中(5组)没有显著变化，但4组、3组猪的il-12量明显高于1组、6组、5组。所有免疫组肺重要的炎症前体细胞因子il-6量，与空白模拟感染攻击组(6组)比较，显著减少。
细胞因子il-10、细胞因子tgf-β在prrsv引起的病理和免疫抑制过程中具有关键作用。5组tgf-β量与2组比较显著减少。所有疫苗免疫组il-10量都有显著差异。
3.4np-plga-pkwag+bcgwcl疫苗免疫猪肺中ifn-γ分泌淋巴细胞亚群和抗原递呈细胞(apcs)频率增大
5组猪疫苗免疫，从猪分离lmnc免疫染色分析淋巴细胞、骨髓细胞、difn-γ+产生淋巴细胞分析。用hp-prrsv-jxm-f5抗原刺激或不做刺激细胞内fn-γ+产生细胞频率经辨识为病毒特异性回忆淋巴反应。在5组免疫猪cd4+和cd8+亚群中的prrsv特异回忆ifn-γ反应显著提高。表明在5组猪肺中辅助t细胞、细胞毒杀伤反应被强力激活。和1-4组比较，这些细胞经再次刺激，prrsv特异ifn-γ分泌淋巴亚群频率显著提高；5组与2组比较，cd4+cd8-ifn-γ+细胞频率显著提高。5组cd4+cd8-ifn-γ+细胞频率与2组、3组、4组比较显著提高。同样5组cd4+cd8-ifn-γ+细胞ifn-γ+γδt细胞频率显著高于2组、3组、4组。5组激活γδt细胞频率与其他组比较显著提高。尽管各组猪总自然杀伤细胞(naturalkiller，nk)(cd56+)频率没有变化，但5组与其他组比较，ifn-γ+nk细胞频率显著提高。除此之外，4组和5组猪apc群中，巨噬细胞(cd172+cd163+slaii+)和树突状细胞(cd172+cd11c+slaii+)含量丰富，显著高于2组免疫猪，表明佐剂np-pkwag疫苗免疫猪在肺部病毒有完全清除的趋势或免疫反应。
3.5prrsv载量、rna拷贝数
5组和3组免疫猪bal液可检测复制的prrsv相对减少，与1组和6组比较显著差别。5组可检测复制prrsv和2组有显著差别。3组疫苗免疫猪的肺匀浆物中，可检测复制prrsv病毒载量与模拟-感染攻击猪(6组)比较，显著减小。5组疫苗免疫猪与1组和3组猪可检测复制病毒载量有显著差异。进一步对3组和4组疫苗免疫猪bal液和肺匀浆物的prrsvrna拷贝数用qpcr定量，prrsvrna拷贝数减少，但与疫苗免疫5组比较无显著差异。4组和5组疫苗免疫猪bal液和肺匀浆物的prrsvrna载量与1组疫苗免疫动物比较显著减少5-10倍，结果如表3所示。
表3攻毒后15天prrsv载量、rna拷贝数统计