一种辅助雷帕霉素治疗多种肿瘤的药物组合物的制作方法

本发明涉及了一种辅助雷帕霉素治疗多种肿瘤的药物组合物，属于生物医学技术领域。

背景技术：

癌症是严重威胁人类生命的常见病和多发病。目前，全世界每年新发生的癌症患者大约1000万，死于癌症的人数近600万，在我国每年新发病患者大约180万，死亡130万，而且发病率逐年上升。我国癌症死亡占各类疾病死因的第2位，在城市已占据首位。癌症不仅给患者造成生理上的巨大伤害，同时在心理上、精神上也给患者带来严重创伤，给无数人的生活带来了磨难，无情地夺去了无数人的生命，破坏了无数人的美满幸福生活，造成了家庭和社会的沉重负担。但癌症的治疗一直是一个世界性的难题，多年来世界各国都在寻找和探索各种有效手段来预防或治疗癌症。药物治疗是癌症治疗的三大疗法之一。传统化学药物治疗恶性肿瘤主要以直接或间接杀伤肿瘤细胞为目的，对正常细胞也有一定程度的杀伤力，毒副作用明显，加之肿瘤细胞耐药性的存在，大大限制了该类细胞毒药物的疗效和应用。

雷帕霉素(rapamycin)是由吸水性链霉菌所产生的一种大环内酯类免疫抑制剂，临床上用于器宫移植的抗排斥反应和自身免疫性疾病的治疗。雷帕霉素主要作用于细胞周期G1，抑制细胞因子和生长因子的DNA在免疫和非免疫细胞内的合成。临床上用于器宫移植的抗排斥反应和自身免疫性疾病的治疗，活性高，用量小(2mg/天，人)，毒性低，美国已在全球80个中心进行1295例肾移植试验，效果显著，副作用小。

目前已经发现，雷帕霉素单用或与化疗药物合用具有抗肿瘤活性。体内外研究表明，雷帕霉素可以诱导多种肿瘤停滞在Gl期，减小肿瘤细胞体裂，诱导肿瘤细胞非p53依赖性凋亡，雷帕霉素通过减少VEGF的产生，阻止VEGF与血管内皮细胞的作用，来显著减少肿瘤血管的生成，降低肿瘤血管密度，使肿瘤发生坏死，延长荷瘤小鼠的生存时间。

雷帕霉素虽然有抗肿瘤活性，但是以雷帕霉素单用其肿瘤效果较差，且长期服用后会产生严重的高脂血症及药物耐受。另外，在已有的雷帕霉素与其他抗肿瘤药物的联合使用文献中，联合使用的成分只涉及到现有的一些人工合成而非天然的抗肿瘤药物，并且这些抗肿瘤药物毒性较大，具有骨髓抑制作用、白细胞减少、还具有引起呕吐、恶心等肠胃反应的作用。目前，还未有报道表明天然食品组分能够辅助雷帕霉素治疗肿瘤。

技术实现要素：

为了解决上述问题，选取天然抗肿瘤食品药物与雷帕霉素组合，增强其抗肿瘤药物和雷帕霉素的活性，减少雷帕霉素及其衍生物的毒副作用是一个重要的解决的手段。因此，本发明通过n-3PUFA辅助雷帕霉素治疗多种癌症，这种活性功能食品组分与药物的组合能获得令人满意的治疗效果。本发明提供了一种具有抗肿瘤活性食品辅助治疗药物组合物，一方面是增强雷帕霉素的抗肿瘤作用，扩大其抗肿瘤的范围(抗瘤谱)，以及/或降低其剂量从而减少用药时间及/或减少对患者潜在的副作用；本发明的另一目的在于提供该药物组合物在肿瘤治疗中的应用。

本发明的第一个目的是提供一种药物组合物，所述药物组合物以A和B为主要活性组分；其中A为雷帕霉素类药物，B为n-3多不饱和脂肪酸。

在本发明的一种实施方式中，所述n-3PUFA为多不饱和脂肪酸，包括α-亚麻酸(α-Linolenicacid，ALA)和/或二十碳五烯酸(Eicosapentaenoicacid，EPA，含5个不饱和键)和/或二十二碳六烯酸(Docosahexaenoicacid，DHA，含6个不饱和键)。

在本发明的一种实施方式中，所述雷帕霉素类药物包括雷帕霉素及雷帕霉素衍生物。

在本发明的一种实施方式中，所述n-3多不饱和脂肪酸包括含有n-3PUFA的食品和/或含有n-3PUFA的营养补充剂。

在本发明的一种实施方式中，所述含有n-3PUFA的食品主要包括鱼油。

在本发明的一种实施方式中，所述药物组合物中A和B的摩尔比为2:1～1:20。

在本发明的一种实施方式中，所述药物组合物中A和B的摩尔比为1:10。

在本发明的一种实施方式中，所述药物组合中，A、B单独或/和结合成固态和/或溶剂化物，即A和B的形态可以相同，也可以不同，A和B的形态可以是固体或者溶剂化物。

本发明的第二个目的是提供一种用于抑制和/或预防和/或治疗肿瘤的药物组合物，所述组合物以A和B为主要活性组分；其中A为抑制和/或预防和/或治疗肿瘤的药物，B为n-3多不饱和脂肪酸。

在本发明的一种实施方式中，所述A为雷帕霉素类药物。

在本发明的一种实施方式中，所述肿瘤包括乳腺癌、前列腺癌、白血病、胃癌、肝癌、卵巢癌、直肠癌和/或结肠癌。

本发明的第三个目的是提供一种用于治疗或/和抑制或/和预防人乳腺癌细胞的药物组合物；所述组合物以A和B为主要活性组分；其中A为抑制和/或预防和/或治疗人乳腺癌细胞的药物，B为n-3多不饱和脂肪酸；所述人乳腺癌细胞包括人乳腺癌MCF-7细胞、T47D、SUM185、BT474、BT-483、600MPE、ZR-75、MDA-MB-468/453/231。

本发明的第四个目的是提供一种用于增强和/或提高肿瘤细胞中p38蛋白质活性的药物组合物，所述药物组合物以A和B为主要活性组分；其中A为雷帕霉素类药物，B为n-3多不饱和脂肪酸。

本发明还提供一种降低和/或抑制Erk1/2蛋白质活性的药物组合物，所述药物组合物以A和B为主要活性组分；其中A为雷帕霉素类药物，B为n-3多不饱和脂肪酸。

本发明还提供一种降低和/或抑制Akt蛋白质活性的药物组合物，所述药物组合物以A和B为主要活性组分；其中A为雷帕霉素类药物，B为n-3多不饱和脂肪酸。

本发明的第五个目的是提供一种检测和/或测试和/或检验和/或实验用于治疗和/或抑制和/或预防药物组合物效果的方法。

在本发明的一种实施方式中，所述方法，是检测Erk1/2蛋白质活性、Akt蛋白质活性和/或p38蛋白质活性；所述方法是通过免疫杂交或Western等方法来检测Erk1/2蛋白质磷酸激酶活性、Akt蛋白质磷酸激酶活性和/或p38蛋白质磷酸激酶活性。

在本发明的一种实施方式中，所述方法中，当分析结果为体外培养的人癌细胞中Erk1/2和/或Akt活性显著降低和/或减少，和/或p38活性显著增加和/或增强，则所述辅助剂有益；若结果为体外培养的人癌细胞中Erk1/2和/或Akt活性显著增加和/或增强，和/或p38蛋白质活性降低和/或减少，则所述辅助剂无益或有害。

在本发明的一种实施方式中，所述人癌细胞包括人乳腺癌、人前列腺癌、人白血病、人胃癌、人肝癌、人卵巢癌、人直肠癌和/或人结肠癌细胞。

在本发明的一种实施方式中，所述有益，是指有益于癌症治疗，是指联合服用该物质时，能降低药物使用剂量和/或增强药物作用效果。

本发明的第六个目的是提供一种分析辅助剂对癌细胞的作用效果的细胞方法，是将n-3PUFA以不同浓度单独和联合雷帕霉素药物添加到正在体外培养的人癌细胞中，来分析辅助剂对体外培养的癌细胞的凋亡和/或增殖的影响，以确定所述辅助剂对体外培养的癌细胞的作用。

在本发明的一种实施方式中，将单独n-3多不饱和脂肪酸(主要包括ALA、EPA和DHA)浓度(80μM)，单独雷帕霉素药物(主要包括雷帕霉素及其衍生物)浓度(8μM)，以及雷帕霉素药物(4μM)联合n-3多不饱和脂肪酸(40μM)，分别加入正在体外培养的人癌细胞中，在一定的时间点(如6h、12、24h、48h、72h等)通过检测细胞数目、形态、DNA片段和核破裂和浓缩等来分析辅助剂(食品和/或营养补充剂)对体外培养的癌细胞的凋亡和/或增殖作用，从而分析所述辅助剂是否能辅助该雷帕霉素药物发挥协同作用。

在本发明的一种实施方式中，细胞凋亡可以通过TUNEL、细胞核荧光染色DAPI方法确定，实时定量PCR检测，抗凋亡基因Bcl-2、Bid的表达在脂肪酸和雷帕霉素联合作用后有明显的下降，促凋亡基因Bax、Bak、Bim、Bim-EL、Puma、Noxa在脂肪酸和雷帕霉素联合作用后有明显的上升。

在本发明的一种实施方式中，所述细胞增殖和/或生长通过CCK8方法检测。细胞数目变化可以通过显微镜血球计数板方法进行直接计数，细胞形态可染色显微观察。

本发明的第七个目的是提供一种药物辅助剂，所述辅助剂是n-3多不饱和脂肪酸或者含有n-3多不饱和脂肪酸的物质。

在本发明的一种实施方式中，所述含有n-3多不饱和脂肪酸的物质是含有n-3PUFA的食品和/或是含有n-3PUFA的营养补充剂。

在本发明的一种实施方式中，所述药物辅助剂是雷帕霉素类药物的辅助剂。

本发明的有益效果：

(1)本发明抗肿瘤药物组合物选取雷帕霉素或衍生物和n-3多不饱和脂肪酸为主要成分。通过抗肿瘤活性成份之间的协同作用，达到更好的治疗效果本发明联合治疗肿瘤的效果，对治疗或预防具有指导作用。

(2)本发明将n-3PUFA以不同浓度单独和联合雷帕霉素药物添加到正在体外培养的人癌细胞中，在不同时间点检测细胞生长情况，筛选出明显抑制细胞增殖、促进细胞死亡的单独n-3PUFA和雷帕霉素药物的浓度；再将二者该浓度各减半作为协同作用浓度，可以明显得出协同时比单独添加物质和雷帕霉素药物有更好的抑制细胞增殖、促进细胞死亡的作用。

附图说明

图1：不同浓度脂肪酸对细胞生长的影响；

图2：不同浓度脂肪酸对细胞增殖的影响；

图3：不同浓度雷帕霉素对细胞生长的影响；

图4：不同浓度雷帕霉素对细胞增殖的影响；

图5：脂肪酸与雷帕霉素对细胞生长的影响；

图6：脂肪酸与雷帕霉素对细胞增殖的影响；

图7：脂肪酸与雷帕霉素对细胞凋亡的影响；

图8：脂肪酸与雷帕霉素对细胞凋亡蛋白水平的检验；

图9：脂肪酸与雷帕霉素对细胞凋亡基因水平的检验；

图10：脂肪酸与雷帕霉素处理细胞后ERK、Akt、p38的表达情况。

具体实施方式

来源于动物或植物的食用油包含大量的各种脂肪酸，包括不同碳链长度和不同饱和度的脂肪酸，如饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸。他们为人类或/和动物提供了大量的能量和/或营养来源。其中源于鱼类、特别是原产自寒冷海水的野生种群的油中发现大量n-3多不饱和脂肪酸(n-3PUFA)。养殖鱼类与野生鱼类相比，包含相当低水平的n-3PUFA。深海鱼油的主要成分n-3PUFA，它属于中长链脂肪酸中的不饱和脂肪酸，具有广泛的生理活性和功能。n-3PUFA主要通过非特异性受体GPR120(GPCRs家族)等激活下游ERK1/2、p38MAPK等信号通路来调节代谢疾病发生。研究表明n-3多不饱和脂肪酸一般对人类健康有益，目前发现它具有较好的抗心血管疾病和抗脂肪肝作用，并已开发出降血脂药物。

本发明通过n-3PUFA辅助雷帕霉素治疗多种癌症，这种活性功能食品组分与药物的组合能获得令人满意的治疗效果。

下面，体外细胞实验以癌细胞为例，可以证明本药物组合物有好的协同效果：将n-3PUFA以不同浓度单独和联合雷帕霉素药物添加到正在体外培养的人癌细胞中，在不同时间点检测细胞生长情况，筛选出明显抑制细胞增殖、促进细胞死亡的单独n-3PUFA和雷帕霉素药物的浓度；再将二者该浓度各减半作为协同作用浓度，可以明显得出协同时比单独添加物质和雷帕霉素药物有更好的抑制细胞增殖、促进细胞死亡的作用。

实施例1：n-3多不饱和脂肪酸对乳腺癌细胞的生长作用效果

EPA和DHA对癌细胞生长、增殖的抑制，已被很多研究证实，然而对于ALA对乳腺癌细胞的作用，并无明确定论，本发明从生长和增殖两方面，通过两种实验方法验证。

1.取对数生长期癌细胞，接种于6孔培养板中(2×10⁵个/孔细胞)，5％CO₂，37℃孵育，待细胞贴壁后分别加入浓度梯度(10μM、20μM、40μM、80μM)的EPA、DHA和ALA，孵育24小时候显微镜下观察，并拍摄照片。

2.细胞增殖实验：CCK-8实验，具体方法如下：

(1)收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，用96孔板每孔加入100ul，铺板使待测细胞调密度至1000-10000孔，(边缘孔用无菌PBS填充)。

(2)5％CO₂，37℃孵育，细胞贴壁后加入浓度梯度的药物，每孔1ul，设5个复孔。

(3)孵育24小时后，每孔加入10微升CCK-8溶液。设置加了相应量细胞培养液、药物和CCK-8溶液但没有加入细胞的孔作为空白对照。

(4)在细胞培养箱内继续孵育1小时。在450nm测定吸光度，并使用650nm作为参考波长进行双波长测定。

图1是不同浓度的脂肪酸作用细胞后，细胞微观形态的变化比较。图2是对应不同浓度的脂肪酸作用后，细胞增殖情况的变化。由图1的结果可以看出，EPA、DHA和ALA对细胞均有不同程度的损伤，细胞数目大量减少，在脂肪酸浓度达到40μM时，细胞数量有一定较少，而当脂肪酸浓度增至80μM时，细胞数量只有起始量的约1/2。在三种脂肪酸中，EPA作用效果最明显。图2反应了不同浓度脂肪酸处理后，细胞的增殖水平的变化。由结果可看出，三种脂肪酸对细胞的增殖均产生的强烈的抑制作用，其中EPA效果最为明显，此结果与上述结果相符。

实施例2：雷帕霉素对癌细胞的生长作用效果

雷帕霉素作为临床试验研究乳腺癌药物，对于乳腺癌细胞的凋亡作用，已被明确证实，本发明从细胞生长和增殖两方面，通过两种实验方法验证。

1.取对数生长期癌细胞，接种于6孔培养板中(2×10⁵个/孔细胞)，5％CO₂，37℃孵育，待细胞贴壁后加入浓度梯度(1μM、2μM、4μM、8μM)的雷帕霉素，孵育24小时候显微镜下观察，并拍摄照片。

2.细胞增殖实验方法：与上述一致。

图3是不同浓度的雷帕霉素作用细胞后，细胞微观形态的变化比较。由图3的结果可以看出，雷帕霉素对癌细胞有一定增殖抑制，当药物浓度达到8μM时，增殖抑制较为明显，细胞数目减少。图4反应了不同浓度雷帕霉素处理后，细胞增殖水平的变化。由结果可看出，雷帕霉素对细胞的增殖均产生的强烈的抑制作用，其中浓度达到8μM有显著性，此结果与上述结果相符。

实施例3：多不饱和脂肪酸联合雷帕霉素对癌细胞的生长作用效果

前文已经提到，脂肪酸和雷帕霉素单独对乳腺癌细胞抑制增殖作用都已经明确被证实，雷帕霉素的毒副作用以及耐药性在临床上已经成为影响其发挥抗肿瘤作用的重要因素。因此，本发明提出一个新的观点，将二者联合是否能发挥协同的作用，从而降低脂肪酸与雷帕霉素的有效治疗浓度。本发明从细胞生长和增殖两方面，通过两种实验方法验证。

1.取对数生长期癌细胞，接种于6孔培养板中(2×10⁵个/孔细胞)，5％CO₂，37℃孵育，待细胞贴壁后加入单独脂肪酸(EPA、DHA、ALA)浓度(80μM)，单独雷帕霉素药物浓度(8μM)，以及雷帕霉素药物(4μM)联合脂肪酸(40μM)，孵育24小时候显微镜下观察，并拍摄照片。

2.细胞增殖实验方法：与上述一致。

图5是脂肪酸和雷帕霉素单独以及联合作用细胞后，细胞微观形态的变化比较。由图5的结果可以看出，脂肪酸(80μM)和雷帕霉素(8μM)单独对癌细胞数目有一定减少，减半浓度脂肪酸(40μM)和雷帕霉素联合细胞数目减少更多(4μM)。图6反应了脂肪酸和雷帕霉素单独以及联合作用细胞后，细胞的增殖水平的变化。由结果可看出，减半浓度脂肪酸和雷帕霉素联合对细胞的增殖抑制作用明显强于单独脂肪酸和雷帕霉素的作用，此结果与上述结果相符。以上数据说明脂肪酸与雷帕霉素能够发挥协同作用，可以降低脂肪酸与雷帕霉素的有效治疗浓度。

实施例4：脂肪酸联合雷帕霉素对癌细胞的凋亡作用效果

脂肪酸和雷帕霉素分别或联合作用于细胞时，细胞生长增殖被抑制，两者联合对细胞凋亡的效果也进一步被验证。本发明通过凋亡相关的三种实验方法验证。

1、DPAI染色法

a)溶液配制如下：

(1)0.01mol/L(pH7.0)：取0.1mol/L NaH₂PO₄·H₂O 34毫升、0.1mol/L Na₂HPO₄ 66毫升、NaCl 0.9g，溶于900m1双蒸水；

(2)DAPI储存液：将0.5mgDAPI溶于5.0毫升中，分装，低温长期保存；

(3)DAPI工作液：用稀释DAPI储存液，终浓度为0.1ug/毫升。

b)具体染色方法如下：

(1)取对数生长期乳腺癌细胞接种，5％CO₂，37℃孵育，待细胞贴壁后加入浓度梯度药物单独脂肪酸(EPA、DHA、ALA)浓度(80μM)，单独雷帕霉素药物浓度(10μM)，以及雷帕霉素药物(5μM)联合脂肪酸(40μM)，孵育24小时后吸去培养基，PBS洗一次。

(2)用4％的多聚甲醛室温固定15分钟，PBS漂洗3次，每次两分钟；

(3)DAPI染色液室温孵育30分钟，并用锡箔纸包裹，PBS漂洗3次，每次两分钟；

(4)荧光显微镜下观察，用UV波段激发照相。

图7反应了脂肪酸和雷帕霉素单独以及联合作用细胞后，细胞的凋亡DAPI染色情况。由结果可看出，减半浓度脂肪酸和雷帕霉素联合作用后，细胞核DAPI染色荧光强度明显高于单独脂肪酸和雷帕霉素，得出联合作用对细胞的凋亡促进作用优于单独脂肪酸和雷帕霉素的作用。

2、Western Blot(蛋白质免疫杂交印迹)检测PARP蛋白水平

a)溶液配制：

(1)10％(w/v)十二烷基硫酸钠SDS溶液：0.1gSDS，1毫升H2O去离子水配制，室温保存。

(2)分离胶缓冲液：1.5mmol/LTris-HCL(pH8.8):18.15gTris用80毫升水溶解，用HCL调节pH到8.8，加水稀释到100毫升终体积。

(3)浓缩胶缓冲液：0.5mmol/LTris-HCL(pH6.8):6.05gTris溶于80毫升水中，用约HCL调至pH6.8，加水稀释到100毫升终体积。

(4)SDS-PAGE加样缓冲液：pH6.80.5mol/LTris缓冲液8毫升，甘油6.4毫升，10％SDS 12.8毫升，巯基乙醇3.2毫升，0.05％溴酚蓝1.6毫升，H2O 32毫升混匀备用。

(5)Tris-甘氨酸电泳缓冲液：30.3gTris，188g甘氨酸，10gSDS，用蒸馏水溶解至1000毫升，临用前稀释10倍。

(6)转膜缓冲液：称取14.4g甘氨酸、6.04gTris，并加入200毫升甲醇，加水至总量1L。

(7)Tris缓冲盐溶液(TBS)：20mmol/LTris/HCL(pH7.5)，500mmol/LNaCl。

b)具体步骤如下：

将乳腺癌细胞用PBS清洗3次，加入裂解液，直接煮沸5分钟，冰上冷却后，12000rpm离心2min，取上清，-20保存备用。

(一)SDS-PAGE凝胶电泳

(1)清洗后的玻璃板对齐后放入夹中卡紧，然后垂直卡在架子上准备灌胶。

(2)配10％分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶，随即用乙醇液封，胶充分凝固就可倒去胶上层乙醇并用吸水纸吸干。

(3)配5％的浓缩胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。待到浓缩胶凝固后，竖直向上轻轻将其拔出。

(5)将其放入电泳槽中，加足够的电泳液后开始准备上样。蛋白质样品测完蛋白含量后，加入5×SDS上样缓冲液至终浓度为1×，在沸水中煮3min混匀后上样，总蛋白量35μg。

(6)恒压80V电泳跑胶，当样品进入下层胶后恒压120V电泳直至溴酚蓝达到凝胶底部为止，进行转膜。

(二)转膜：

(1)切胶：将玻璃板撬掉，除去小玻璃板后，将浓缩胶刮去，根据实验需要按照蛋白的分子量，以Marker为对照进行切胶。

(2)备膜：裁剪PVDF膜和滤纸，将切好的PVDF置于80％甲醇溶液中激活30s。

(3)装膜：将转膜用的夹子打开使黑的一面(负极)保持水平。在上面垫一张海绵垫，加入转膜液浸湿，在垫子上垫上中浸泡好的滤纸，随后按照凝胶—硝酸纤维素膜—滤纸—海绵垫的顺序依次叠放。最后将白色板(正极)盖好装入转膜槽中。

(4)转膜：将夹子放入转移槽槽中，要使夹的黑面对槽的黑面，夹的白面对槽的红面。4℃转膜，恒流400mA。

(5)转完后将膜取下，标记一角。

(三)免疫反应

(1)封闭：将膜用TBST中漂洗3次，每次5min。漂洗后将硝酸纤维素膜放入5％脱脂奶粉中，室温下摇床1h。

(2)加一抗：将封闭后的硝酸纤维素膜放入含有TBST的洗缸中摇床上漂洗3次，每次5min。放入加有一抗的平皿中4℃过夜孵育。

(3)加二抗：回收一抗，将硝酸纤维素膜在TBST洗缸中室温摇床漂洗3次，每次5min，然后将漂洗过的硝酸纤维素膜放入加有二抗的平皿中，避光室温孵育45min。孵育后将硝酸纤维素膜在TBST洗缸中洗3次，每次5min。

(四)化学发光

(1)将A和B两种试剂在小离心管里按照发光试剂盒说明书操作将其混合，加到硝酸纤维素膜上，用化学发光成像仪显色。

脂肪酸和雷帕霉素单独以及联合作用细胞后，提取总蛋白进行Western Blot检测PARP蛋白水平。图8反映了在不同时间段(12h、24h、48h)，脂肪酸和雷帕霉素联合作用时剪切形式的PARP有明显的上升，24h只有EPA与雷帕霉素联合有剪切形式的PARP蛋白的出现；而到48h时，三种脂肪酸联合雷帕霉素都出现了明显的剪切形式PARP，这代表随着时间的推迟，验证脂肪酸和雷帕霉素联合作用有明显的细胞凋亡发生。

3、RT-PRC检测凋亡相关基因水平

a)RNA的提取

在35mm培养皿中加1毫升Trizol并反复吹打，然后将细胞裂解液转移至1.5毫升Eppendorf管中，室温放置5分钟，使其充分裂解。按每1毫升Trizol加入200μ1氯仿，剧烈振荡混勾15秒后室温放置3分钟。接着4℃12000g离心15分钟。可见上层无色水相，中间混合相，下层红色酷相。吸取上层水相，转至另一新的Eppendorf管中。按每1毫升-Trizol加入0.5毫升异丙醇，颠倒混勾，室温放置10分钟。然后4℃12000g离心10分钟，弃上清，可见RNA沉淀于管底。按每1毫升Trizol加入1毫升75％乙醇，剧烈混勻。接着4℃7500g离心5分钟，弃上清。将RNA沉淀室温瞭干或真空干燥5-10分钟。最后将其溶解在30μlDEPC处理水中，在-80℃保存待用。RNA纯度和浓度用分光光度计分别在A260和A260/280处测值检测。

b)反转录

将提取的RNA反转录成cDNA用TaKaRa公司的PrimescriptTM RT reagent kit试剂盒。反应液配制在冰上进行。

表1反应体系

反转录反应条件为：37℃15分钟(反转录反应)；85℃10秒(反转录酶的失活反应)

c)实时定量PCR

用SYBR Green I荧光染色法进行实时定量PCR。PCR反应体系为20μl，反应液配制在冰上进行，配制PCR反应液时应避免强光照射，尽量避免污染。

表2PCR反应体系

扩增条件为：95℃预变性30s，然后95℃变性10秒，60℃退火/延伸，30s，共40个循环，扩增产物的特异性用溶解曲线监测。以β-actin的mRNA表达水平将各组目的基因mRNA表达量标准化，然后用目的基因的mRNA表达水平与对照组mRNA表达水平的比值来反映目的基因mRNA的表达量，实验重复3次。

脂肪酸和雷帕霉素单独以及联合作用细胞后，提取RNA进行RT-PRC检测凋亡相关基因水平。图9反映了，抗凋亡基因Bcl-2、Bid在脂肪酸和雷帕霉素联合作用后有明显的下降，促凋亡基因Bax、Bak、Bim、Bim-EL、Puma、Noxa在脂肪酸和雷帕霉素联合作用后有明显的上升。从上述结果，进一步说明脂肪酸和雷帕霉素联合作用有明显的促进细胞凋亡作用。

实施例5：脂肪酸联合雷帕霉素对AKT、ERK1/2、p38信号的作用

Akt又称PKB或Rac，在细胞存活和凋亡中起重要作用。胰岛素等生长和存活因子都可以激活Akt信号途径，Akt的Ser473可以被PDK1磷酸化。

ERKs调节着细胞的增殖、分化和存活，是多种生长因子(EGF、NGF、PDGF等)的下游蛋白，ERK和其信号途径在肿瘤侵袭和转移过程中起中介和放大信号的作用，一方面接受大量来自生长因子、丝裂原、环境刺激等的信号，另一方面通过ERK信号级联反应作用于核转录因子如AP-1、NF-кB等，调控基因表达。在许多人类的癌症(如乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、白血病、口腔癌、黑色素瘤等)中都可发现ERK的过度激活。

p38信号通路是MAPK通路的一重要分支，它在炎症、细胞应激、凋亡、细胞周期和生长等多种生理和病理过程中起重要作用。4种已知的p38异构体包括p38α、p38β、p38γ和p38δ.多年来已发现p38MAPK通路可以由应激包括高渗、热休克、放射线和其他应激反应活化。因此，p38MAPK通路参与了多种刺激引起的信号级联反应，表明它在引起多种细胞反应中起重要作用，并且，p38在细胞凋亡中也显示调节效应。

本发明采用western blotting的方法对AKT、ERK1/2、p38信号通路进行验证。

图10是脂肪酸和雷帕霉素联合作用细胞后的AKT、ERK1/2、p38信号磷酸化水平的变化。由图9可看出，脂肪酸处理后，p38活性上调，AKT、ERK1/2活性下降。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。