一种全氟碳乳液及其制备方法与应用与流程

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种全氟碳乳液及其制备方法与应用，尤其是在提高肿瘤含氧量中的应用。

背景技术：

肿瘤(tumour)是指机体在各种致瘤因子作用下，局部组织细胞增生所形成的新生物(neogrowth)，因为这种新生物多呈占位性块状突起，也称赘生物(neoplasm)。根据新生物的细胞特性及对机体的危害性程度，又将肿瘤分为良性肿瘤和恶性肿瘤两大类，而癌症即为恶性肿瘤的总称。与良性肿瘤相比，恶性肿瘤生长速度快，呈浸润性生长，易发生出血、坏死、溃疡等，并常有远处转移，造成人体消瘦、无力、贫血、食欲不振、发热以及严重的脏器功能受损等，最终造成患者死亡。由于人口老龄化等原因，当前我国癌症发病率、死亡率呈持续增长趋势。世界癌症报告估计，2012年中国癌症发病人数为306.5万，约占全球发病人数的五分之一；癌症死亡人数为220.5万，约占全球癌症死亡人数的四分之一。今后20年，我国癌症的发病数和死亡数还将持续上升：根据国际癌症研究署预测，如不采取有效措施，我国癌症发病数和死亡数到2020年将上升至400万人和300万人；2030年将上升至500万人和350万人。

由于恶性肿瘤生长迅速，肿瘤细胞凋亡的速度明显低于其所对应的正常组织，故导致肿瘤对氧及其他能量物质如葡萄糖等的需求增加，而肿瘤组织内的血液供应则相对不足。而且肿瘤体积的高速膨胀，在肿瘤中的一部分肿瘤组织由于离最近的血管的距离越来越远故导致了肿瘤血液供应的不足，最终导致了这一部分肿瘤组织的缺氧。因此在临床上大部分恶性肿瘤在它的生长、发展过程中都有内部的缺氧区域存在，并且这些缺氧区域最终常常出现坏死，这些原因将进一步导致临床上治疗肿瘤的方法如放射治疗，光动力治疗等治疗疗效受到一定的限制。因此，增强肿瘤含氧量，改善肿瘤的乏氧状况将是提高肿瘤治疗效果需要攻克的难关。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于针对现有技术的缺陷提供一种全氟碳乳液及其制备方法与应用。本发明所述全氟碳乳液有较高的携氧能力，在超声作用下可以快速释放氧气，提高肿瘤含氧量，有效的改善肿瘤部位的乏氧状况。肿瘤乏氧状况的改善可以进一步提高光动力治疗以及放射治疗的治疗效果。

为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案。

一种全氟碳乳液，由全氟碳和蛋白组成。

全氟碳是氟原子取代碳氢化合物中的氢原子而得到的一种化合物。全氟碳化合物是一类相对稳定的物质，具有很强的惰性，它不溶于水，密度大约为水的2倍。另外一方面，全氟碳具有较大的氧气溶解度，因此全氟碳具有较好的携氧能力。水输氧气的能力为2.5％，血红素的输氧能力为20％，而全氟碳的输氧能力可以达到40％。并且全氟碳输氧是直接扩散不需要像血红素一样跨膜，因此其输氧能力较血红素会更加高效。

本发明所述全氟碳乳液中蛋白作为稳定剂与全氟碳形成乳液。全氟碳乳液的颗粒较小可以到达血红素到不了的地方。而且全氟碳乳液具有较好的稳定性，较长的衰减周期，更适宜长期保存并使用。

按照本发明，所述的全氟碳乳液中，所述蛋白优选为牛血清白蛋白或人血清白蛋白。

进一步的，所述全氟碳乳液的粒径为180～200nm。

在一些实施例中，所述全氟碳乳液的粒径为200nm。

本发明还提供了所述的全氟碳乳液的制备方法，取蛋白溶于磷酸盐缓冲液中，加入全氟碳液体后，用细胞破碎仪超声后，离心取下层物质，溶于磷酸盐缓冲液。

优选的，按mg/μL计，所述蛋白与所述全氟碳液体的比例为1:5。

按照本发明，所述的全氟碳乳液的制备方法中所述磷酸盐缓冲液的浓度为10mmol。

本发明还提供了所述的全氟碳乳液在提高肿瘤含氧量中的应用。

本发明还提供了一种提高肿瘤含氧量的方法，静脉给予所述全氟碳乳液，吸氧的同时在肿瘤部位进行超声处理。

超声是临床上广泛应用的一种技术手段，在产生超声波的同时会产生一定的机械作用力、热效应以及一定的化学效应。本发明所述提高肿瘤含氧量的方法利用所述全氟碳乳液高效的携氧能力，通过在肿瘤部位加入超声作用，可以达到氧气在肿瘤部位的响应性释放从而提高肿瘤部位的含氧量。

按照本发明，所述高肿瘤含氧量的方法中所述超声的工作频率为1.00M(Hz)～1.10M(Hz)。

优选的，所述高肿瘤含氧量的方法中所述超声的时间为30分钟以上。

由上述技术方案可知，本发明提供了一种全氟碳乳液由全氟碳和蛋白组成。本发明所述全氟碳乳液有较高的携氧能力，并且在超声作用下可以快速释放氧气。实验表明，通过尾静脉注射全氟碳乳液，让小鼠处于吸氧状态下，在小鼠肿瘤部位加入超声作用，全氟碳乳液携带的氧气在超声的机械作用下会迅速释放，肿瘤部位的氧气含量不断增加。利用这一方法可以有效的改善肿瘤部位的乏氧状况，从而提高光动力治疗以及放射治疗的治疗效果。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示实施例1所述全氟碳乳液在磷酸盐缓冲液中的粒径分布图；

图2示实施例2全氟碳乳液充入氧气后加超声以及不加超声的情况下氧气量的变化曲线；其中，表示去离子水中氧气含量的变化曲线，表示去离子水在超声作用下氧气含量的变化曲线，表示全氟碳乳液充氧气后氧气含量的变化曲线，表示充氧气之后的全氟碳乳液在超声作用下氧气含量的变化曲线；

图3示实施例3超声作用下全氟碳乳液在动物水平中其对乏氧肿瘤的乏氧状况改善的免疫荧光染色图；

图4示实施例4超声作用下全氟碳乳液在动物水平中利用光声成像检测其血氧饱和度结果图；其中，图a示肿瘤经过不同方法处理后其血氧饱和度的变化，图b示图a中的血氧饱和度的定量分析，为处理前，为处理后；

图5示实施例5超声作用下全氟碳乳液对肿瘤光动力治疗效果的影响图，其中，图a示小鼠肿瘤经过不同处理方式后肿瘤的生长曲线，图b示治疗14天后小鼠肿瘤的质量平均值；

图6示实施例6超声作用下全氟碳乳液对肿瘤放射治疗效果的影响图，其中，图a示小鼠肿瘤经过不同处理方式后肿瘤的生长曲线，图b示治疗14天后小鼠肿瘤的质量平均值。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

为了进一步理解本发明，下面结合具体实施例对本发明进行详细阐述。

实施例1:全氟碳乳液的制备

称取蛋白40mg，溶于4mL磷酸盐缓冲液中，加入200μL全氟碳液体后，用细胞破碎仪超声5分钟后，离心后取下层物质，再溶于磷酸盐缓冲液中备用。用动态光散射仪器测定全氟碳颗粒粒径，结果见图1。

图1结果显示合成的全氟碳颗粒粒径在200nm左右。

实施例2：氧气含量变化的测定

实施例1中的全氟碳乳液中充入氧气后，加入去离子水中，其氧气含量由氧电极测定。待氧气含量稳定后，在圆底烧瓶底部涂上耦合剂后加入超声探头，在超声作用下检测其氧气含量的变化值，结果见图2。

图2结果显示充入氧气后，全氟碳乳液的携氧能力明显高于水溶液。在超声的作用下，氧气会有一个快速释放的过程。

实施例3：超声作用下利用免疫荧光探针检测小鼠肿瘤内氧气含量的变化

将小鼠分为5组，每组3只。

小鼠分别接受以下处理：

(1)对照组：不做处理；

(2)小鼠只吸氧组；

(3)小鼠在吸氧的同时在肿瘤部位加入超声组；

(4)小鼠注射全氟碳乳液同时吸氧组；

(5)小鼠注射全氟碳乳液，吸氧并且同时在肿瘤部位加入超声组；

超声加入时间为30分钟。每组小鼠处理结束后腹腔注射0.8mg/只乏氧荧光探针，90分钟后将小鼠肿瘤切下后冷冻切片染色，肿瘤切下后用冰冻切片包埋剂包埋后采用冷冻切片机切成4微米厚度的肿瘤切片。采用标准的Hypoxyprobe^TM(pimonidazole hydrochloride)染色步骤染色后，用共聚焦显微镜观测结果。结果见图3。

结果显示，注射全氟碳乳液的小鼠在吸氧的同时在小鼠肿瘤部位加入超声后，肿瘤乏氧区明显减少，从而证明超声作用下全氟碳乳液可以有效改善肿瘤的乏氧状况。

实施例4：超声作用下利用光声成像检测小鼠肿瘤内氧气含量的变化

将小鼠分为3组每组3只。

小鼠分别接受以下处理：

(1)只吸氧小鼠组；

(2)注射全氟碳乳液并吸氧组；

(3)注射全氟碳乳液吸氧并在肿瘤部位加入超声组。

小鼠处理前光声进行其血氧浓度的检测，处理后再次进行血氧浓度检测，以检测其乏氧状况的改善情况，结果见图4。

图4结果显示，小鼠注射全氟碳并且吸氧的状况下，其肿瘤的血氧饱和度改善情况并不显著，相反地，注射全氟碳并且吸氧的小鼠肿瘤在超声作用下其血氧饱和度变化明显。进一步证明超声作用下全氟碳乳液可快速有效的改善肿瘤的乏氧状况。

实施例5：利用超声刺激氧气释放提高肿瘤乏氧状况从而提高光动力治疗效果。

将老鼠分为6组，每组5只，对照组只注射磷酸盐缓冲液，其他五组先注射装载光敏分子的脂质体。24小时后，将注射光敏分子的小鼠分为(1)只进行光动力治疗组，(2)在吸氧30分钟后进行光动力治疗组，(3)吸氧30分钟同时在小鼠肿瘤部位加入超声作用后进行光动力治疗组，(4)注射全氟碳乳液并吸氧30分钟后进行光动力治疗组，(5)注射全氟碳乳液并吸氧同时在小鼠肿瘤部位加入超声30分钟后进行光动力治疗组。治疗后每隔一天用游标卡尺测量肿瘤的大小，治疗14天后将肿瘤切下后称重，结果见图5。

图5结果显示，小鼠在吸氧与不吸氧条件下只进行光动力治疗，肿瘤的生长得到部分抑制，但是由于光动力治疗效果有限，肿瘤后期呈现快速增长的趋势。只注射全氟碳乳液并进行光动力治疗时，小鼠的肿瘤体积小逼教育对照组有一定的降低，但是治疗效果依旧有限。相比较于其他治疗组以及对照组，注射全氟碳乳液并吸氧同时在小鼠肿瘤部位加入超声30分钟后进行光动力治疗后，小鼠肿瘤的生长得到有效抑制。从而证明超声作用下全氟碳乳液改善肿瘤乏氧后可以有效的提高光动力治疗效果。

实施例6：利用超声刺激氧气释放提高肿瘤乏氧状况从而提高放射治疗效果

将老鼠分为6组，每组5只，分别为(1)对照组：只注射磷酸盐缓冲液；(2)只照射X-ray组，(3)吸氧30分钟后照射X-ray组，(4)吸氧同时在肿瘤部位加入超声30分钟后照射X-ray组，(5)注射全氟碳乳液并吸氧30分钟后照射X-ray组，(6)注射全氟碳乳液并吸氧同时在小鼠肿瘤部位加入超声30分钟后照射X-ray组。治疗后每隔一天用游标卡尺测量肿瘤的大小，治疗14天后将肿瘤切下后称重，结果见图6。

图6结果显示，小鼠吸氧与不吸氧后进行放射治疗，肿瘤生长会得到部分抑制，但是治疗效果有一定的限制。注射全氟碳乳液并吸氧30分钟后照射X-ray后，对肿瘤的治疗效果与单纯只照射X-ray没有明显区别。相比较于其他治疗组以及对照组，注射全氟碳乳液并吸氧同时在小鼠肿瘤部位加入超声30分钟后照射X-ray后，小鼠肿瘤的生长得到有效抑制，从而证明超声作用下全氟碳乳液改善肿瘤乏氧后可以有效的提高放射治疗效果。