咪唑菌酮在制备防治BmNPV感染家蚕细胞药物中的应用的制作方法

本发明属于分子生物学与病毒学领域，涉及咪唑菌酮在制备防治BmNPV感染家蚕细胞药物中的应用。

背景技术：

家蚕血液型脓病是养蚕业三大病毒病中危害最为严重的一种病害，其传染性极强，近年来养蚕生产中较为普遍发生，并不时发生部分农户或一定养蚕区域内绝产的情况。家蚕血液型脓病的病原是家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus，BmNPV)，该病毒属杆状病毒科、核型多角体病毒属，是一种具有囊膜、双链DNA病毒，它在病毒复制过程中会形成两种病毒粒子，即包涵体来源病毒粒子与芽生病毒粒子，前者随着食物进入家蚕中肠感染部分中肠细胞，被感染中肠细胞会产生大量芽生病毒粒子，新生的芽生病毒粒子进而感染其它组织导致细胞裂解，虫体最终死亡。病蚕、蛹、蛾的尸体、脓汁及被之污染的蚕粪、蚕具、蚕茧，带有大量的病毒，具有强烈的传染性，是血液型脓病的主要的传染源。

目前对于家蚕血液型脓病的治疗尚无特效药物，生产上主要是通过加强养蚕期严格的消毒来杜绝BmNPV的感染，消毒剂主要成分有氯制剂和甲醛试剂等。但是家蚕血液型脓病的潜伏期短，发病快，感染时肉眼难以察觉，当肉眼发现时，则常处于发病晚期或是暴发期，一旦病毒感染了蚕体，发生疾病，则很难进行有效治疗进而挽回损失，开发治疗家蚕血液型脓病的药物是蚕农或部分技术人员非常迫切的期望。

已有试验研究证明B-丙内酯、，萘啶酮酸等化学物品对家蚕BmNPV感染后的发病具有一定的抑制效果，但其作用还是主要体现在预防而不是治疗。咪唑菌酮是咪唑啉酮类杀菌剂，属于线粒体呼吸抑制剂，对卵菌纲真菌引起的霜霉病有良好的保护和治疗活性。发明人在筛选家蚕血液型脓病治疗化合物的过程中发现咪唑菌酮对BmNPV有明显的抑制效果，目前咪唑菌酮应用于病毒及BmNPV防治方面尚无专利和文献报道。

技术实现要素：

解决的技术问题：本发明提供一种咪唑菌酮在制备防治BmNPV感染家蚕细胞药物中的应用，另一目的是提供使用咪唑菌酮用于防治BmNPV感染家蚕细胞的合适浓度。

技术方案：咪唑菌酮在制备防治BmNPV感染家蚕细胞药物中的应用。

咪唑菌酮的有效浓度为1μg/mL。

防治BmNPV感染家蚕细胞药物，有效成分为溶解于DMSO中的咪唑菌酮，浓度为1μg/mL。

具体防治方法为：

1.咪唑菌酮对携带eGFP报告基因的BmNPV感染的防治

(1)用DMSO溶解咪唑菌酮，配制浓度为10mg/mL的储存液。

(2)分别在35mm细胞培养皿中接种约10⁵个/皿的家蚕细胞，细胞贴壁后，用配制好的咪唑菌酮储存液加入细胞中，使终浓度分别为0.01-1μg/mL，孵育10-120min，孵育细胞温度为20-29℃，以等体积DMSO孵育液作为对照。孵育后，用MOI＝10携带绿色荧光蛋白基因的BmNPV病毒感染细胞，27℃培养72小时后在荧光显微镜下观察细胞，并对病毒滴度进行测定。

(3)分别在35mm细胞培养皿中接种约10⁵个/皿的家蚕细胞，细胞贴壁后，用MOI＝10携带绿色荧光蛋白基因的BmNPV病毒感染细胞，在感染后的6、12、24小时后加入1μg/mL咪唑菌酮，72小时后在荧光显微镜下观察细胞，并对病毒滴度进行测定。

有益效果：本发明提供一种以咪唑菌酮为主要有效成分，制备防治家蚕血液型脓病的药物。当咪唑菌酮使用终浓度在1μg/mL以上时能够完全抑制BmNPV的复制，并且在BmNPV完成对细胞的侵染后能够继续抑制BmNPV的复制，具有治疗效果。本发明可用于防治家蚕血液型脓病的药物研发及生产，具有应用推广价值。

附图说明

图1、携带绿色荧光蛋白基因的BmNPV重组病毒BmBac-egfp示意图。

图2、利用不同浓度咪唑菌酮处理细胞后病毒感染细胞荧光图。

图3、利用不同浓度咪唑菌酮处理细胞后病毒滴度。

图4、感染后不同时间点加入咪唑菌酮处理细胞荧光图。

具体实施方式

实施例1

1.携带egfp报告基因的BmNPV的构建

将egfp片段克隆至pFastBac1(Invitrogen)的BamHI(Takara)和XhoI(Takara)位点，构建供体质粒pFastBac-egfp，通过转座获得BmBac-egfp(图1)，将BmBac-egfp DNA转染BmN(家蚕卵巢细胞)细胞后，在荧光显微镜下可观察到绿色荧光表达。将其细胞上清用于感染BmN细胞，感染72小时后收获病毒，用终点稀释法测定病毒滴度，病毒4℃冰箱避光保存。

2.细胞的接种及咪唑菌酮的储存液配制

(1)分别在35mm的细胞培养皿(Corning)中各接种约10⁵BmN细胞每个细胞皿中合2mL的10％FBS的TC100昆虫细胞培养基。

(2)27℃培养约12h-24h，待细胞贴壁后，用于以下实验。

(3)咪唑菌酮的储存液配制

用DMSO配制浓度为10mg/mL的咪唑菌酮储存液。

3.当咪唑菌酮的终浓度为0μg/mL，即对照组细胞，携带egfp报告基因的BmNPV对细胞感染效率

(1)取各接种好10⁵细胞的3个培养皿，每个细胞皿中合2mL的10％FBS的TC100昆虫细胞培养基。移去旧的培养基，分别加入2μL DMSO与2mL 10％FBS的TC100培养基，27℃培养30min，加入MOI＝10的BmBac-egfp病毒。

(2)72h后，将3个皿放置于荧光倒置显微镜，观察绿色荧光蛋白表达情况见图2(DMSO)。

(3)取10μL细胞培养液，用终点稀释法测定病毒滴度。

结果显示0μg/mL咪唑菌酮处理细胞时，BmNPV感染的细胞产生大量荧光，病毒滴度Log₁₀(TCID50)为9.87(见图3(DMSO))。

实施例2

咪唑菌酮的终浓度为1μg/mL时，对携带egfp报告基因的BmNPV感染的防治：

(1)取各接种好10⁵细胞的3个培养皿，每个细胞皿中合2mL的10％FBS的TC100昆虫细胞培养基。移去旧的培养基，分别加入2μL 10mg/mL的咪唑菌酮储存液与2mL 10％FBS的TC100培养基，27℃培养30min，随后加入MOI＝10的BmBac-egfp病毒。

(2)72h后，将3个皿放置于荧光倒置显微镜，观察绿色荧光蛋白表达情况见图2(T1)。

(3)取10μL细胞培养液，用终点稀释法测定病毒滴度。

结果显示1μg/mL咪唑菌酮处理细胞时，BmNPV感染的细胞没有荧光产生，达到了完 全抑制，病毒滴度为0(图3 T1)。

实施例3

咪唑菌酮的终浓度为0.25μg/mL时，对携带egfp报告基因的BmNPV感染的防治：

(1)取各接种好10⁵细胞的3个培养皿，每个细胞皿中合2mL的10％FBS的TC100昆虫细胞培养基。移去旧的培养基，分别加入0.5μL 10mg/mL的咪唑菌酮储存液与2mL 10％FBS的TC100培养基，27℃培养30min，随后加入MOI＝10的BmBac-egfp病毒。

(2)72h后，将3个皿放置于荧光倒置显微镜，观察绿色荧光蛋白表达情况见图2(T0.25)。

(3)取10μL细胞培养液，用终点稀释法测定病毒滴度。

结果显示0.25μg/mL咪唑菌酮处理细胞时，BmNPV感染细胞的荧光与对照相比明显减少，病毒滴度Log₁₀(TCID50)为8(图3T0.25)。

实施例4

咪唑菌酮的终浓度为0.1μg/mL时，对携带egfp报告基因的BmNPV感染的防治：

(1)取各接种好10⁵细胞的3个培养皿，每个细胞皿中合2mL的10％FBS的TC100昆虫细胞培养基。移去旧的培养基，分别加入0.2μL 10mg/mL的咪唑菌酮储存液与2mL 10％FBS的TC100培养基，27℃培养30min，随后加入MOI＝10的BmBac-egfp病毒。

(2)72h后，将3个皿放置于荧光倒置显微镜，观察绿色荧光蛋白表达情况见图2(T0.1)。

(3)取10μL细胞培养液，用终点稀释法测定病毒滴度。

结果显示0.1μg/mL咪唑菌酮处理细胞时，BmNPV感染细胞的荧光与对照相比明显减少，但比0.25μg/mL咪唑菌酮处理的细胞多，病毒滴度Log₁₀(TCID50)为9.13(图3T0.1)。

实施例5

咪唑菌酮的终浓度为0.01μg/mL时，对携带egfp报告基因的BmNPV感染的防治：

(1)取各接种好10⁵细胞的3个培养皿，每个细胞皿中合2mL的10％FBS的TC100昆虫细胞培养基。移去旧的培养基，分别加入0.02μL 10mg/mL的咪唑菌酮储存液与2mL 10％FBS的TC100培养基，27℃培养30min，随后加入MOI＝10的BmBac-egfp病毒。

(2)72h后，将3个皿放置于荧光倒置显微镜，观察绿色荧光蛋白表达情况见图2(T0.01)。

(3)取10μL细胞培养液，用终点稀释法测定病毒滴度。

结果显示0.1μg/mL咪唑菌酮处理细胞时，BmNPV感染细胞的荧光与对照相比差异不明 显，病毒滴度Log₁₀(TCID50)为9.65(图3T0.01)，表明该浓度下咪唑菌酮对BmNPV没有防治效果。

实施例6

咪唑菌酮的终浓度为1μg/mL时，感染后加入咪唑菌酮对携带egfp报告基因的BmNPV感染的防治：

(1)取各接种好10⁵细胞的3个培养皿，每个细胞皿中合2mL的10％FBS的TC100昆虫细胞培养基。移去旧的培养基，随后加入MOI＝10的BmBac-egfp病毒；此时设置时间为感染后0小时，6、12、24小时后加入2μL 10mg/mL的咪唑菌酮储存液，27℃培养。

(2)72小时后，将3个皿放置于荧光倒置显微镜，观察绿色荧光蛋白表达情况见图4。

结果显示BmNPV完成对细胞的感染后加入1μg/mL咪唑菌酮处理细胞，对BmNPV也有完全的抑制效果，表示1μg/mL咪唑菌酮可以对BmNPV感染细胞进行病毒清除和治疗。

最后应当说明的是，以上所述的实施例和实施方式所述的咪唑菌酮浓度和处理时间仅用于说明性目的而非限制，但本领域的普通技术人员应当理解，在细胞状态或者细胞培养基理化性质比如酸碱度等等微小的差异，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围，并被包括在本申请的精神和范围之内。