一种响应面法优化提取卡西卡甫枣总黄酮的方法与流程

本发明涉及一种响应面法优化提取卡西卡甫枣总黄酮的方法。

背景技术：

卡西卡甫枣又名酸枣、小红枣，为鼠李科植物酸枣Ziziphus jujuba Mill. var.spinosa (Bunge)Hu ex.H.F.Chow的干燥成熟果实。具有清血排毒，清热消炎，止咳化痰，补身安神，除疹止痒等功效。用于热性或血液质性或胆液质性各种病证，如血热腐败、浓液成块，发热发烧、肺炎、胸膜炎，乃孜来性感冒、咳嗽顽痰，体虚失眠，皮疹瘙痒等。

黄酮的功效是多方面的，它是一种很强的抗氧剂，可有效清除体内的氧自由基，如花青素、花色素可以抑制油脂性过氧化物的全阶段溢出，这种阻止氧化的能力是维生素E的十倍以上，这种抗氧化作用可以阻止细胞的退化、衰老，也可阻止癌症的发生。药理研究表明，枣类黄酮具有明显的止咳、祛痰、行血、止血、通经活络之功效，同时具有明显的抗补体活性和促进淋巴细胞增殖的作用，它能有效增强机体免疫力。枣肉黄酮能增强小鼠体液免疫和细胞免疫功能，并对放射性损伤有一定的保护作用，是免疫增强剂。研究证实，卡西卡甫枣的黄酮类成分具有抗癌的生理活性，其药用价值备受关注。但是目前的提取方法得到的卡西卡甫枣总黄酮的纯度普遍偏低，一直制约着卡西卡甫枣总黄酮药理和质量控制的研究。因此如何从卡西卡甫枣内提取获得纯度含量高的卡西卡甫枣总黄酮变得尤为重要。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种响应面法优化提取卡西卡甫枣总黄酮的方法。

为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：

一种响应面法优化提取卡西卡甫枣总黄酮的方法，包括如下步骤：

（1）卡西卡甫枣去核、干燥、粉碎，得到卡西卡甫枣粉末；

（2）卡西卡甫枣粉末用乙醇提取，提取液浓缩干燥，测定干浸膏的总黄酮含量；

（3）选择提取时间、提取温度和液料比三个因素对步骤（2）进行单因素实验，确定提取时间、提取温度和液料比的最优水平，在最优水平两侧对称选2个水平，根据Box-Benhnken设计原则进行三因素三水平实验设计，以提取时间、提取温度和液料比为自变量，以总黄酮含量为响应值，建立总黄酮含量的多元二次方程；

（4）对步骤（3）建立的多元二次方程进行响应面分析，取总黄酮含量为最大值，得出最优的提取条件。

进一步，在步骤（3）中，

以提取时间A、提取温度B、液料比C为自变量，以总黄酮含量Y为响应值，建立的多元二次方程为：

Y=1.37+0.074A+0.090B+0.035C+8.486E-003AB-0.027AC-2.546E-003BC-0.11A²-0.14B²-0.048C²；

一种提取卡西卡甫枣总黄酮的方法，包括如下步骤：

（1）卡西卡甫枣去核、干燥、粉碎，得到卡西卡甫枣粉末；

（2）卡西卡甫枣粉末用乙醇提取，提取液浓缩干燥，得到卡西卡甫枣总黄酮。

进一步，步骤（2）提取时，料液比为1:10～30，时间为0.5～2.5h，温度为40～80℃。

进一步，步骤（3）提取时，料液比为1:26，时间为1.7h，温度为74℃。

本发明针对卡西卡甫枣本身，采用响应面法优化提取工艺，能够更为有效提取出卡西卡甫枣总黄酮，减少其他非黄酮成分的提取。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1为提取时间对总黄酮含量的影响曲线；

图2为提取温度对总黄酮含量的影响曲线；

图3为料液比对总黄酮含量的影响曲线；

图4为提取时间、提取温度、液料比对总黄酮含量的响应面三维图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

（1）卡西卡甫枣去核、干燥、粉碎，得到卡西卡甫枣粉末；

（2）卡西卡甫枣粉末用乙醇提取，提取液浓缩干燥，测定干浸膏的总黄酮含量；

（3）选择提取时间、提取温度和液料比三个因素对步骤（2）进行单因素实验，确定提取时间、提取温度和液料比的最优水平，在最优水平两侧对称选2个水平，根据Box-Benhnken设计原则进行三因素三水平实验设计，以提取时间、提取温度和液料比为自变量，以总黄酮含量为响应值，建立总黄酮含量的多元二次方程；

（4）对步骤（3）建立的多元二次方程进行响应面分析，取总黄酮含量为最大值，得出最优的提取条件。

总黄酮含量的测定方法：紫外分光光度法，将干浸膏使用无水甲醇溶解，并定容到50ml容量瓶中，吸取提取液1ml，加适量蒸馏水，加入浓度为 5%NaNO₂ 0.5mL，摇匀置6min; 再加入浓度为10%A1(NO₃)₃ 0.5mL，摇匀置 6min；加浓度为 4% NaOH 4mL，用蒸馏水定容至10mL，摇匀15min后测定吸光度，以芦丁为标准品，根据吸光度（Y）和浓度（X）的回归方程：y=14.737x-0.0248，R=0.9994计算浓度。总黄酮含量=总黄酮的质量/卡西卡甫枣粉末的质量。

单因素实验结果

1.1提取时间对总黄酮含量的影响

以提取温度60℃，液料比1:25(g/ml)，提取时间0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h进行回流提取，考察提取时间对黄酮含量的影响，结果见图1。

从图1可以看出，在提取温度、料液比相同的条件下，随着提取时间的增加，提取所得卡西卡甫枣总黄酮含量先增加，之后开始逐渐减少至趋于平稳，这是因为提取时间可影响提取溶剂与细胞内的活性物质接触，提取时间越长，溶剂越能够充分渗透到细胞内与活性物质接触溶解，从而提高提取的黄酮含量;而提取时间过长时则会导致细胞内的温度过高，造成提取物的氧化，另外还有其他物质的更多溶出，从而降低总黄酮的量，故从黄酮含量的角度来看，提取时间选择1.5h为宜。

1.2提取温度对总黄酮含量的影响

以提取时间1.5h，液料比1:25(g/ml)，提取温度40℃、50℃、60℃、70℃、80℃进行回流提取，考察提取温度对总黄酮含量的影响，结果见图2。

从图2可知，在提取时间、料液比相同的条件下，卡西卡甫枣总黄酮的含量随着温度的上升而增加，这可能是因为温度的升高会加快分子的运动，同时温度升高也能软化和破坏细胞壁组织从而有利于细胞内的黄酮类化合物的流出，而当温度超过70℃时，黄酮类化合物的含量下降，这可能是因为温度过高，造成提取物的氧化分解，另外还有其他物质的更多溶出，从而降低总黄酮的量，因此从黄酮含量的角度来说，考虑选择提取温度在70℃较好。

1.3液料比对总黄酮含量的影响

以提取时间1.5h，提取温度60℃，液料比1:10(g/ml)、1:15(g/ml)、1:20(g/ml)、1:25(g/ml)、1:30(g/ml)进行回流提取，考察料液比对总黄酮含量的影响，结果见图3。

从图3可以看出，在提取时间、提取温度相同的条件下，当料液比为1:25 (g/mL)时，黄酮类化合物的含量最高，当料液比大于1:25(g/mL)时，总黄酮含量反而降低。这可能是因为溶剂量过多时，一些其他类物质也被提取出来，而有效成分的总量变化不大，相比较而言总黄酮含量呈下降趋势。就黄酮含量的角度而言，选择料液比为1:25 (g/mL)左右为宜。

响应面法优化设计

根据单因素试验结果确定的提取时间、提取温度、液料比最优水平，并在最优水平两侧对称选2个水平，具体因素水平设置见表1。

表1 因素水平设置表

利用Design-Expert软件根据Box-Benhnken设计原则进行三因素三水平实验设计，实验方案设计与响应值结果见表2。回归方程方差分析见表3。

表2 响应曲面设计方案以及响应值

以提取时间A、提取温度B、液料比C为自变量，以总黄酮含量为响应值Y，建立多元二次方程：

Y=1.37+0.074A+0.090B+0.035C+8.486E-003AB-0.027AC-2.546E-003BC-0.11A²-0.14B²-0.048C²。

表3 黄酮含量回归方程的方差分析

利用 Design-Expert 软件对多元二次回归方程进行响应面分析，得到回归方程的响应面及其等高线图，见图4。

总黄酮含量：由表3分析可知，（P<0.0001<P=0.05）二次回归方程模型显著，失拟项显著（P=0.1220>P=0.05）。表明该方程对实验拟合情况好，可以用该模型代替真实实验点对不同反应条件下卡西卡甫枣总黄酮含量的实验进行结果预测和分析。回归模型方程各项的方差分析结果还表明，方程一次项中A、B、C影响是极显著的，二次项的影响也都是显著的，方程的拟合是较充分的，但交互项AB、AC、BC的P值均>0.05，表明提取时间、提取温度、液料比这三个因素的两两交互作用不显著。通过该模型的方差分析可知：提取温度（B）对黄酮含量影响差异显著（P<0.0001），而提取时间（A）、液料比（C）两个因素对黄酮含量影响差异不显著。即：提取时间的改变将会显著影响黄酮含量。三因素对黄酮含量影响效应的大小依次 提取温度（B）>提取时间（A）>液料比（C）。

最优条件验证实验

从响应面实验分析结果可以看出，回流提取的提取时间和提取温度是影响卡西卡甫枣总黄酮含量的主要因素，利用 Design-Expert（8.0.6版本）软件分析，在软件中选择总黄酮含量为最大值，由软件直接分析得出卡西卡甫枣中总黄酮回流提取的最佳工艺条件为：提取时间1.65h，提取温度73.4℃，液料比1:26.35时，预测总黄酮含量最优值为1.4052mg/g。在上述优化条件下，考虑实际操作的局限性，将工艺参数修正为提取时间1.7h、提取温度74℃、液料比1:27。在此修正条件下进行了3次平行验证实验，卡西卡甫枣总黄酮含量的平均值为1.4030mg/g，相比误差0.31% ，与理论预测值较接近，结果较理想。

实例1

卡西卡甫枣总黄酮的提取方法，步骤如下：

对卡西卡甫枣进行挑选、清洗、切片、去核、烘干，将烘干后的卡西卡甫枣进行粗粉碎成100目的颗粒，称取卡西卡甫枣粉末9.9322g，按 1:25(g/mL)料液比加入无水乙醇，置于70℃恒温水浴锅中浸提1.5h，离心，取上清液，得到粗提液；使用旋转蒸发仪将提取液浓缩，并使用真空干燥箱烘干，烘干时间为24h。将干浸膏使用无水甲醇溶解，并定容到50ml容量瓶中，使用NaNO₂-Al(NO₃)₃显色紫外分光光度法测得卡西卡甫枣总黄酮含量为1.3748mg/g。

实例2

卡西卡甫枣总黄酮的提取方法，步骤如下：

对卡西卡甫枣进行挑选、清洗、切片、去核、烘干，将烘干后的卡西卡甫枣进行粗粉碎成100目的颗粒，称取卡西卡甫枣粉末10.8135g，按 1:30(g/mL)料液比，加入无水乙醇，置于80℃恒温水浴锅中浸提1.5h，离心，取上清液，得到粗提液；使用旋转蒸发仪将提取液浓缩，并使用真空干燥箱烘干，烘干时间为24h。将干浸膏使用无水甲醇溶解，并定容到50ml容量瓶中，使用NaNO₂-Al(NO₃)₃显色紫外分光光度法测得卡西卡甫枣总黄酮含量为1.3272mg/g。

实例3

卡西卡甫枣总黄酮的提取方法，步骤如下：

对卡西卡甫枣进行挑选、清洗、切片、去核、烘干，将烘干后的卡西卡甫枣进行粗粉碎成100目的颗粒，称取卡西卡甫枣粉末10.0696g，按 1:25( g/mL)料液比，加入无水乙醇，置于80℃恒温水浴锅中浸提2.0h，离心，取上清液，得到粗提液；使用旋转蒸发仪将提取液浓缩，并使用真空干燥箱烘干，烘干时间为24h。将干浸膏使用无水甲醇溶解，并定容到50ml容量瓶中，使用NaNO₂-Al(NO₃)₃显色紫外分光光度法测得卡西卡甫枣总黄酮含量为1.2865mg/g。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。