一种同时抗猪流感以及蓝耳病的中药复方及提取方法与流程

本发明属于兽用中药领域，涉及一种同时抗猪流感以及蓝耳病的中药复方及提取方法。

背景技术：

猪流感(swine influenza，SI)又称猪流行性感冒，是由正黏病毒科A型流感病毒属的猪流感病毒(swine influenza virus，SIV)引起的一种急性、热性、高度接触性呼吸道传染病，临床以突发、高热、咳嗽、呼吸困难、反复发作、发病率高、死亡率低为特征。此病在世界各地都有发生,危害严重,经济损失巨大,并对人类的健康构成威胁。其突出的流行特点是常以亚临床形式存在并常引起其他呼吸道细菌和病毒的继发或混合感染，如猪繁殖与呼吸综合症、猪圆环病毒病和猪传染性胸膜肺炎等，使疫情变得复杂，死亡率增高。

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine Reproductive and Respiration Syndrome Virus，PRRS)又称“蓝耳病”，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的猪以繁殖障碍和呼吸道症状为主要特征的一种高度传染性疾病。该病能多途径传播，不仅能引起妊娠母猪发热、流产、产木乃伊胎和弱仔，也能诱发仔猪和育成猪的呼吸系统疾病。PRRSV可导致病猪食欲不振、体重下降、呼吸系统疾病并产生间质性肺炎。给全国养猪业造成了严重威胁及巨大经济损失。

在临床实践猪流感的防治上，由于抗生素具有控制并发症的特点而被广泛使用，同时配合大量的解热镇痛、糖皮质激素类等药物。这些处理方式在抑制机体炎症反应的同时也加重了免疫抑制，导致病情更加的恶化。而猪繁殖与呼吸综合征主要依赖疫苗进行防治，但是灭活疫苗需要大量、多次免疫，产生免疫时间长，弱毒疫苗又存在毒力返强的危险。中草药作为天然产物，具有药源丰富，残毒较低或无残毒，副作用小，不易产生耐药性等优点；同时能调节机体免疫功能，抑制病毒复制，改善临床症状，在治疗病毒感染性疾病上应用广泛。因此，应用中草药防治猪流感和猪繁殖与呼吸综合征，前景极为广阔。

纵观现在中药复方抗病毒的实验研究，对分别抗猪流感病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的单方研究较多，目前并没有研究出一个复方可以同时抗猪流感病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒。并且大多分别采用体内试验或体外试验的方法独立研究，不能全面评价中药复方抗猪流感病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的效果。

为解决上述问题，迫切需要筛选出能同时有效防治猪流感和猪繁殖与呼吸综合征的中药复方。并且同时采用体外试验和体内试验，从作用机理和临床实际上综合研究中药复方抗H1N1和H3N2亚型猪流感病毒以及蓝耳病病毒的效果，为临床防治提供理论和实际依据。

技术实现要素：

本发明克服了现有技术中的缺点，提供了一种同时抗猪流感以及蓝耳病的中药复方及提取方法，可以同时防治猪流感病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒，其具有残毒较低或无残毒，副作用小，不易产生耐药性等优点，同时能调节机体免疫功能，抑制病毒复制，改善临床症状。

为了解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案实现的：

一种同时抗猪流感以及蓝耳病的中药复方，包含如下药物：射干15～25重量份，麻黄15～25重量份，百合10～15重量份，细辛5～15重量份，法半夏5～15重量份，柴胡5～15重量份，黄芩5～15重量份，甘草5～10重量份。

进一步，包含如下药物：射干20重量份，麻黄20重量份，百合15重量份，细辛10重量份，法半夏10重量份，柴胡10重量份，黄芩10重量份，甘草5重量份。

一种同时抗猪流感以及蓝耳病的中药复方的提取方法，包括以下步骤：

(1)按上述配比称量各药物；

(2)将称量后的药复方粉碎到20目，加入两倍量的水，浸泡1h，水煎2次，

每次煮沸30min，合并2次煎液；

(3)将煎液在常压真空抽滤及浓缩，定容至100mL水煎液，每毫升相当于

1g生药；

(4)将水煎液进行高压灭菌，在4℃冰箱内保存备用

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明所述一种同时抗猪流感以及蓝耳病的中药复方及提取方法，包含如下药物：射干15～25重量份，麻黄15～25重量份，百合10～15重量份，细辛5～15重量份，法半夏5～15重量份，柴胡5～15重量份，黄芩5～15重量份，甘草5～10重量份，可同时抗猪流感病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒，尤其是H1N1和H3N2亚型猪流感病毒，而且具有残毒较低或无残毒，副作用小，不易产生耐药性等优点，同时能调节机体免疫功能，抑制病毒复制，改善临床症状。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制，在附图中：

图1是不同处理对H1N1亚型猪流感病毒感染小鼠体重变化的影响；

图2是不同处理对H3N2亚型猪流感病毒感染小鼠体重变化的影响；

图3A表示中药复方组的H1N1亚型猪流感病毒感染小鼠的肺部病理组织学观察；

图3B表示麻杏石甘散复方组的H1N1亚型猪流感病毒感染小鼠的肺部病理组织学观察；

图3C表示利巴韦林组的H1N1亚型猪流感病毒感染小鼠的肺部病理组织学观察；

图3D表示模型对照组的H1N1亚型猪流感病毒感染小鼠的肺部病理组织学观察；

图3E正常对照组的H1N1亚型猪流感病毒感染小鼠的肺部病理组织学观察；

图4A表示中药复方组的H3N2亚型猪流感病毒感染小鼠的肺部病理组织学观察；

图4B表示麻杏石甘散组的H3N2亚型猪流感病毒感染小鼠的肺部病理组织学观察；

图4C表示利巴韦林组的H3N2亚型猪流感病毒感染小鼠的肺部病理组织学观察；

图4D表示模型对照组的H3N2亚型猪流感病毒感染小鼠的肺部病理组织学观察；

图4E表示正常对照组的H3N2亚型猪流感病毒感染小鼠的肺部病理组织学观察。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

一种同时抗猪流感以及蓝耳病的中药复方，包含如下药物：射干20重量份，麻黄20重量份，百合15重量份，细辛10重量份，法半夏10重量份，柴胡10重量份，黄芩10重量份，甘草5重量份，重量份是指复方中各种药物占整个复方的重量比例。

射干：味苦、性寒、微毒，能清热解毒、散结消炎、消肿止痛、止咳化痰，在复方中为君药。麻黄：性温，味辛、微苦，有发汗散寒、宣肺平喘、利水消肿的功效，可治疗风寒感冒、胸闷喘咳风水浮肿、支气管哮喘，在复方中为臣药。百合性甘、微苦、微寒，能养阴润肺；清心安神；细辛可解表散寒，祛风止痛，通窍，温肺化饮；法半夏主治燥湿化痰；柴胡性味苦、微寒，归肝、胆经。有和解表里，疏肝升阳之功效；黄芩味苦、性寒，有清热燥湿、泻火解毒、止血等功效，四者在复方中同为佐药。甘草：气微，味甜而特殊，主要功效为补脾益气，清热解毒，祛痰止咳，缓急止痛，在复方中为使药。

下述实施例中所用实验材料如下：

(一)试验动物

9-11日龄SPF鸡胚购自广东大华农禽蛋有限公司；SPF级15g±2g BALB/c小鼠购自广东省医学实验动物中心。

(二)溶液或试剂配制

1.PBS的配制：称取NaCl 8.0g、Na₂HPO₄ 3.63g、KCl 0.2g KH₂PO₄0.24g溶于适量超纯水，调pH值至7.4，定容至1000mL；100ml/瓶分装，15磅高压灭菌30min，4℃保存备用。

2.1％鸡红细胞悬液的配制：先用灭菌注射器吸取3.8％枸橼酸钠溶液(其用量为所需血量的1/5)，从鸡翅静脉抽血至所需要血量，置灭菌离心管内，加灭菌PBS为抗凝血的2倍，以2000r/min离心10min，弃上清液，再加生理盐水悬浮血球，同上法离心沉淀，如此将红细胞洗涤三次，最后根据所需用量，用灭菌PBS配成1％悬液，现配现用。

3.中药的提取：采用水煎煮方法进行粗提，具体步骤是：

(1)按射干20重量份，麻黄20重量份，百合15重量份，细辛10重量份，法半夏10重量份，柴胡10重量份，黄芩10重量份，甘草5重量份比例，称取各中药，组成100g中药复方；

(2)将100g中药复方粉碎到20目，加入2倍水，浸泡1h，水煎2次，每次煮沸30min，合并2次煎液；

(3)将煎液在常压真空抽滤及浓缩，定容至100mL水煎液,每毫升相当于0.51g生药(即1000mg/mL)；

(4)将水煎液进行高压灭菌，保存至温度为4℃冰箱内备用。

实施例1中药复方制剂的体外抗猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)效果

1.PRRSV对MARC‐145细胞的半数致死量(TCID50)测定

将待测病毒按10倍比系列稀释10个浓度梯度，在长满Marc-145细胞的96孔板，按100μl/孔的剂量加入病毒液，每个梯度做8个重复，最后2列为细胞对照组，37℃吸附1.5h后弃去病毒液，并加入维持液100μl，放置CO2细胞培养箱培养。

每天观察细胞病变情况，在病变达到75％以后用MTT法测定各孔OD值。病毒对细胞的生长抑制率＝(细胞对照组OD值﹣病毒对照组OD值)/细胞对照组OD值。病毒的半数毒性浓度(TCID50)运用Reed-Muench两氏法进行计算。

2.中药复方制剂对MARC-145细胞的最大安全浓度的测定

在96孔培养板上培养单层Marc-145细胞，弃去原液，利用PBS洗涤1次。第1到第12孔分别加入100μl DMEM维持液，然后取100μl中药成分的原液从第1孔到第10孔依次进行2倍倍比稀释，第10孔弃去100μl，第11、12孔为细胞对照，各稀释度重复4孔。置于37℃、二氧化碳培养箱中培养72h，每天观察细胞生长情况以及形态变化。72h后弃去培养液，用MTT法在490nm波长下测定OD值。根据下述公式计算中药成分对Marc-145细胞的安全浓度：

不同浓度中药成分对细胞的生长抑制率＝(细胞对照组OD值﹣药物组OD值)/细胞对照组OD值，以对细胞的生长抑制率为0来确定中药成分的安全浓度。

3.中药复方制剂体外抗PRRSV效果的测定

将细胞传到96孔培养板，采用三种加药方式：

方式一、先加中药再加病毒(中药对PRRSV的阻断作用)：在96孔培养板上培养生长至单层的Marc-145细胞后，加入以安全浓度为始的中药提取物，每孔100μL，37℃、二氧化碳培养箱培养4h后弃去药液，每孔加入100μl的100TCID50PRRSV液，37℃、二氧化碳培养箱培养2h后弃去病毒液，最后每孔加入100μl的DMEM培养液。

方式二、先加病毒再加中药(中药对PRRSV的抑制作用)：

在96孔培养板上培养生长至单层的Marc-145细胞后，每孔加入100μl的100TCID50PRRSV液，37℃、二氧化碳培养箱培养2h后弃去病毒液，再加入以安全浓度起始的中药提取物，每孔100μl，37℃、二氧化碳培养箱中培养4h后弃去药液，最后每孔加入100μl的DMEM培养液。

方式三、中药病毒混合后一起加(中药对PRRSV的直接杀灭作用)：

在96孔培养板上培养生长至单层的Marc-145细胞，配制以板蓝根多糖安全浓度起始，倍比稀释且含100TCID50病毒液的不同浓度中药提取物的培养液，依次加入96孔培养板中，每孔100μl，37℃、二氧化碳培养箱中培养4h后弃药液，最后每孔加入DMEM培养100μl。

同时设立病毒对照和阴性对照。

用SPSS19.0软件进行统计分析，先计算各组490nm的平均OD值，再根据公式计算对细胞的保护率，计算公式为：中药对感染病毒的Marc-145细胞的保护率＝(药物组OD值-病毒对照组OD值)/(细胞对照组OD值-病毒对照组OD值)。最后根据细胞保护率来评价各中药提取物的抗病毒效果，细胞保护率越大则表明药物抗PRRSV作用越强。

4.数据处理

数据以表示，用SPSS19.0软件统计分析。

表1：中药复方对PRRSV的阻断作用

注：A表示与病毒对照相比P﹤0.01，差异极显著，a表示P﹤0.05，差异显著；B表示与空白对照相比P﹤0.01，差异极显著，b表示P﹤0.01，差异显著。

表1显示中药复方在MARC-145细胞上对PRRSV的阻断作用与经典复方麻杏石甘散药效相同，但是稳定性比麻杏石甘散好，随浓度下降药效降低得较慢。而表3则显示中药复方对PRRSV的直接杀灭作用远远强于利巴韦林与麻杏石甘散，这说明中药复方在体外有明显的抗PRRSV的效果。

实施例2中药复方对小鼠感染H1N1和H3N2亚型猪流感病毒的防治效果

1.H1N1和H3N2亚型猪流感病毒对鸡胚半数感染量(EID₅₀)的测定

将病毒液依次作10倍倍比稀释，接种于10日龄鸡胚尿囊腔内，每个稀释度接种0.2ml/枚，作4个重复，同时设正常鸡胚对照。置37℃恒温箱内孵化72h，弃去24h内死亡胚，收获24h后死亡胚及72h活胚的尿囊液，进行HA效价的测定。按Reed-Muench两氏法计算EID₅₀。

2.中药复方对H1N1和H3N2亚型猪流感病毒感染小鼠肺炎的影响

(1)实验动物分组

将BALB/c小鼠随机分为中药复方组、利巴韦林组、麻杏石甘散组、模型对照组和正常对照组，共5组，每组10只，并进行标记。

(2)实验动物给药

各组小鼠均以灌胃给药，2次/d，0.2ml/次。中药各组于感染前1d开始给药，连续7d。同时，正常对照组、模型对照组给予等量蒸馏水。

(3)实验动物攻毒

将小鼠用乙醚麻醉后，除正常对照组外，各组滴鼻接种10⁶EID50流感病毒50μl，正常对照组接种50μl灭菌PBS。

(4)第8天(禁食8h以上)称重，摘眼球放血处死小鼠，无菌摘取肺脏，用PBS冲洗并用无菌滤纸吸去表面多余液体后分别称量肺重。

肺指数与肺指数抑制百分率计算公式如下：

肺指数＝肺脏重量(g)/小鼠重量(g)×100

肺指数抑制百分率＝(模型对照组肺指数均数-实验组肺指数均数)/模型对照组数×100％

(5)统计分析：用SPSS17.0软件统计分析，详见表4：

表4中药复方制剂对H1N1亚型猪流感病毒感染小鼠肺炎的影响

表5中药复方制剂对H3N2亚型猪流感病毒感染小鼠肺炎的影响

注：以上数据与模型对照组相比，A表示P﹤0.01，差异极显著，a表示P﹤0.05，差异显著。

从表4可以看出，中药复方组的不仅肺指数抑制百分率有8.99％，而且肺指数还低于麻杏石甘散经典复方组，说明其对于经H1N1亚型猪流感病毒感染的小鼠的肺保护作用要强于经典复方组。

3.中药复方对猪流感病毒感染小鼠体重的影响

(1)实验动物分组、给药、造模同2(1)(2)(3)

(2)体重的测定

从给药第1天开始，每天早上给药前称取每一只小鼠体重，共七天，对每一组小鼠的体重变化进行分析。

(3)统计分析：小鼠体重变化如图1和2所示，图中的柱状从左至右分别代表实验的第1至第7天。

从图1可以看出，中药复方组对H1N1亚型猪流感病毒的抵抗力较强，只在第5天的时候体重出现减轻，体重下降幅度小而且恢复快，增长幅度大，到第7天平均体重与正常对照组接近。而麻杏石甘散组和利巴韦林组明显受H1N1亚型猪流感病毒的影响很大，体重下降幅度大，而且时间长，恢复慢，麻杏石甘散组直至第7天才出现体重回升。从图2可知，H3N2亚型猪流感病毒的毒力较H1N1亚型猪流感病毒强，所有组别的小鼠体重均出现明显的变化，但是从图中可以看出，中药复方组在四个感染组中仍然抵抗力较强恢复较快，虽然到第6天体重才出现上升，但是仍远强于麻杏石甘散组。因此，综合两种病毒感染的实验结果可知，中药复方组具有明显的抗猪流感效果。

4.中药复方对小鼠感染猪流感病毒后的肺部病理组织学观察

(1)实验动物分组、给药、造模同1(1)(2)(3)

(2)第8天(禁食8h以上)称重，摘眼球放血处死小鼠，无菌摘取肺脏，并制成石蜡切片。

(3)切片结果分析：

猪流感感染后的小鼠的主要产生间质性肺炎并有充血、水肿等病理变化。从图3A、3B、3C、3D、3E至4A、4B、4C、4D、4E可以看出，与正常对照组相比较，模型对照组肺泡间隔增宽，肺泡壁不完整，并伴有出血现象。中药复方组虽然也出现了出血，但是明显症状较麻杏石甘散组和利巴韦林组弱，而且肺泡壁完整。因此可知，中药复方组对H1N1和H3N2两种亚型的猪流感有防治效果，并且强于麻杏石甘散组和利巴韦林组。

最后应说明的是：以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换，但是凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。