一种用大孔吸附树脂分离纯化延龄草甾体皂苷的工艺的制作方法

本发明属于中药延龄草中甾体皂苷的分离纯化技术领域，尤其涉及一种用大孔吸附树脂分离纯化延龄草甾体皂苷的工艺。

背景技术：

百合科延龄草属植物延龄草(Trillium tschonoskii Maxim)，是著名的陕西七药之一。延龄草中主要含有甾体皂苷类成分，研究表明甾体皂苷具有抗炎、抗肿瘤、抗衰老、免疫调节和提高学习记忆能力的活性。

目前延龄草中甾体皂苷的提取分离方法有液液萃取法、硅胶柱色谱法、凝胶柱色谱法和大孔吸附树脂法等，然而液液萃取法得到的甾体皂苷量少，不利于工业化大量制备，硅胶柱色谱法、凝胶柱色谱法具有成本高、操作费时的缺点，大孔吸附树脂法具有选择性好、吸附量大、解吸容易和再生简便的优点，然而已有的分离纯化延龄草甾体皂苷的大孔吸附树脂法缺乏系统研究，工艺条件和参数不确切，因此有必要研究大孔吸附树脂分离纯化延龄草甾体皂苷的工艺条件和参数，为延龄草甾体皂苷的分离纯化制定可行的方法。

技术实现要素：

为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种用大孔吸附树脂分离纯化延龄草甾体皂苷的工艺，具有简单方便、分离纯化效果好、吸附树脂再生简便和使用周期长的优点。

为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种用大孔吸附树脂分离纯化延龄草甾体皂苷的工艺，包括以下步骤：

1)利用乙醇加热回流法对延龄草药材进行甾体皂苷提取，先获得粗提液，将粗提液减压蒸干，得到浸膏备用；

2)将步骤1)获得的浸膏加水溶解，配置成上柱溶液，上柱溶液通过预处理好的大孔吸附树脂柱进行吸附，达到吸附平衡后，用洗脱剂乙醇洗脱大孔吸附树脂柱，然后对洗脱液减压蒸干溶剂得到纯化延龄草甾体皂苷。

所述的步骤1)中获得粗提液的具体步骤为：

1.1)将延龄草药材干燥、粉碎，加入提取溶媒乙醇，提取溶媒乙醇与延龄草药材的体积质量比为2～8mL/g，提取溶媒乙醇的体积浓度为50％～90％，加热回流提取1～4h；

1.2)收集滤液，滤渣再加入提取溶媒乙醇重复提取2～5次，过滤后合并5次滤液得到粗提液。

所述步骤2)中大孔吸附树脂为弱极性、极性和非极性的大孔吸附树脂，弱极性大孔吸附树脂包括AB-8树脂，极性大孔吸附树脂包括HPD-600树脂，非极性大孔吸附树脂包括D-101树脂。

所述步骤2)中上柱溶液的浓度为3.32～16.24mg/mL，上样量为10～110mL，上样流速为1～4BV/h，达到平衡吸附后，用10％～90％的洗脱剂乙醇洗脱，洗脱剂乙醇的体积为10～110mL，洗脱流速为1～4BV/h，洗脱液减压蒸干，既得纯化延龄草甾体皂苷。

所述的步骤2)中大孔吸附树脂的预处理包括以下步骤：取大孔吸附树脂用无水乙醇加热回流处理6h后装柱，用无水乙醇冲洗大孔吸附树脂柱，收集洗脱液，洗脱液加其3倍体积超纯水无白色浑浊即停止收集洗脱液，然后用超纯水洗脱至无醇味即可。

用除杂剂乙醇冲洗步骤2)洗脱后的大孔吸附树脂柱，然后分别用盐酸溶液和氢氧化钠溶液再生大孔吸附树脂柱，重复上样5次。

所述的大孔吸附树脂柱的再生包括以下步骤：先用4BV无水乙醇冲洗大孔吸附树脂柱除去吸附在其上的杂质，然后用3BV的4％的盐酸溶液冲洗，去离子水冲洗至中性；最后用3BV的4％氢氧化钠溶液冲洗，去离子水冲洗至中性。

本发明的优点在于：

本发明利用大孔吸附树脂柱在上样浓度为3.32～16.24mg/mL、上样量为10～110mL、上样流速为1～4BV/h、洗脱剂为10％～90％的乙醇、洗脱剂体积为10～110mL、洗脱流速为1～4BV/h的条件下，分离纯化的得到的甾体皂苷含量从粗提液中的5.2％增加到52％，通过大孔吸附树脂柱分离纯化得到的产物中甾体皂苷的含量显著增大。同时大孔吸附树脂柱还具有再生简便、使用周期长(可重复使用5次)等优点可以作为大批量工业化制备甾体皂苷的理想材料。

附图说明：

图1为实施例1上样浓度对AB-8树脂柱吸附量的影响示意图。

图2为实施例2上样体积对AB-8树脂柱泄漏率的影响示意图。

图3为实施例3上样流速对AB-8树脂柱吸附率的影响示意图。

图4为实施例4洗脱剂乙醇的浓度对AB-8树脂柱解吸量的影响示意图。

图5为实施例5洗脱剂乙醇的用量对AB-8树脂柱解能力的影响示意图。

图6为实施例6洗脱剂乙醇的流速对AB-8树脂柱解析率的影响示意图。

具体实施方式

下面通过附图和实施例对本发明做进一步说明。

实施例1

一种用大孔吸附树脂分离纯化延龄草甾体皂苷的工艺，包括以下步骤：

1)利用乙醇加热回流法对延龄草药材进行甾体皂苷的提取，先获得粗提液，将粗提液减压蒸干，得到浸膏备用，获得粗提液的具体步骤为：

1.1)将延龄草药材干燥、粉碎至60目，加入提取溶媒乙醇，提取溶媒乙醇与延龄草药材的体积质量比为6mL/g，提取溶媒乙醇的体积浓度为75％，加热回流提取2h；

1.2)收集滤液，滤渣再加入75％提取溶媒乙醇重复提取4次，过滤合并5次滤液得到粗提液；

2)将步骤1)获得的浸膏加水溶解，配置成上柱溶液，上柱溶液通过预处理好的大孔吸附树脂柱进行吸附，达到吸附平衡后，用洗脱剂乙醇洗脱大孔吸附树脂柱，然后对洗脱液减压蒸干溶剂得到纯化延龄草甾体皂苷；

大孔吸附树脂为弱极性的AB-8树脂，上样浓度分别为3.32mg/mL、5.17mg/mL、7.01mg/mL、8.86mg/mL、16.24mg/mL，上样量为100mL，以1BV/h的流速通过装有5gAB-8树脂的层析柱(2×30cm，树脂柱高15cm)，达到平衡吸附后，90％乙醇作为洗脱剂进行洗脱，洗脱剂乙醇的体积为100mL，洗脱流速为2BV/h，洗脱液减压蒸干，既得纯化延龄草甾体皂苷，所有实验平行操作三次，计算相对标准偏差。

本实施例的有益效果为：

参照图1，上样浓度为3.32mg/mL、5.17mg/mL、7.01mg/mL、8.86mg/mL、16.24mg/mL时AB-8大孔吸附树脂柱对延龄草甾体皂苷的吸附量分别为86.1mg/g、94.1mg/g、92.5mg/g、89.9mg/g、79.5mg/g，当上样浓度为5.17mg/mL时，AB-8树脂柱对甾体皂苷的吸附量(94.1mg/g)最大。

实施例2

一种用大孔吸附树脂分离纯化延龄草甾体皂苷的工艺，包括以下步骤：

1)利用乙醇加热回流法对延龄草药材进行甾体皂苷提取，先获得粗提液，将粗提液减压蒸干，得到浸膏备用，获得粗提液的具体步骤为：

1.1)将延龄草药材干燥、粉碎至60目，加入提取溶媒乙醇，提取溶媒乙醇与延龄草药材的体积质量比为6mL/g，提取溶媒乙醇的体积浓度为75％，加热回流提取2h；

1.2)收集滤液，滤渣再加入75％提取溶媒乙醇重复提取4次，过滤合并5次滤液得到粗提液；

2)将步骤1)获得的浸膏加水溶解，配置成上柱溶液，上柱溶液通过预处理好的大孔吸附树脂柱进行吸附，达到吸附平衡后，用洗脱剂乙醇洗脱大孔吸附树脂柱，然后对洗脱液减压蒸干溶剂得到纯化延龄草甾体皂苷；

大孔吸附树脂为弱极性的AB-8树脂，分别用10mL、20mL、30mL、40mL、50mL、60mL、70mL、80mL、90mL、100mL、110mL的浓度为5.17mg/mL的上柱溶液连续通过装有5gAB-8树脂的层析柱(2×30cm，树脂柱高15cm)，上样流速为1BV/h，达到平衡吸附后，用90％的乙醇洗脱，洗脱剂乙醇的体积为100mL，洗脱流速为2BV/h，洗脱液减压蒸干，既得纯化延龄草甾体皂苷。所有实验平行操作三次，计算相对标准偏差。

本实施例的有益效果为：

参照图2，上样量分别为10mL、20mL、30mL、40mL、50mL、60mL、70mL、80mL、90mL、100mL、110mL时AB-8大孔吸附树脂柱对延龄草甾体皂苷的泄漏率分别为3.6％、5.6％、5.4％、5.2％、5.3％、4.9％、5.1％、7.5％、11.6％、14.6％、13.3％，当上样量为90mL时，AB-8树脂柱对甾体皂苷的泄漏率大于10％，此时AB-8树脂柱已出现明显泄漏。

实施例3

一种用大孔吸附树脂分离纯化延龄草甾体皂苷的工艺，包括以下步骤：

1)利用乙醇加热回流法对延龄草药材进行甾体皂苷提取，先获得粗提液，将粗提液减压蒸干，得到浸膏备用，获得粗提液的具体步骤为：

1.1)将延龄草药材干燥、粉碎至60目，加入提取溶媒乙醇，提取溶媒乙醇与延龄草药材的体积质量比为6mL/g，提取溶媒乙醇的体积浓度为75％，加热回流提取2h；

1.2)收集滤液，滤渣再加入75％提取溶媒乙醇重复提取4次，过滤合并5次滤液得到粗提液；

2)将步骤1)获得的浸膏加水溶解，配置成上柱溶液，上柱溶液通过预处理好的大孔吸附树脂柱进行吸附，达到吸附平衡后，用洗脱剂乙醇洗脱大孔吸附树脂柱，然后对洗脱液减压蒸干溶剂得到纯化延龄草甾体皂苷；

大孔吸附树脂为弱极性的AB-8树脂，浓度为5.17mg/mL、上样量为80mL的上柱溶液分别以1BV/h、2BV/h、3BV/h、4BV/h的流速通过装有5gAB-8树脂的层析柱(2×30cm，树脂柱高15cm)，达到平衡吸附后，用90％的乙醇洗脱，洗脱剂乙醇的体积为100mL，洗脱流速为2BV/h，洗脱液减压蒸干，既得纯化延龄草甾体皂苷。所有实验平行操作三次，计算相对标准偏差。

本实施例的有益效果为：

参照图3，上样流速为1BV/h、2BV/h、3BV/h、4BV/h时AB-8大孔吸附树脂柱对延龄草甾体皂苷的吸附率分别为83.9％、84.9％、81.2％、79.9％，当上样流速为2BV/h时，AB-8树脂柱对甾体皂苷的吸附率最大。

实施例4

一种用大孔吸附树脂分离纯化延龄草甾体皂苷的工艺，包括以下步骤：

1)利用乙醇加热回流法对延龄草药材进行甾体皂苷提取，先获得粗提液，将粗提液减压蒸干，得到浸膏备用，获得粗提液的具体步骤为：

1.1)将延龄草药材干燥、粉碎至60目，加入提取溶媒乙醇，提取溶媒乙醇与延龄草药材的体积质量比为6mL/g，提取溶媒乙醇的体积浓度为75％，加热回流提取2h；

1.2)收集滤液，滤渣再加入75％提取溶媒乙醇重复提取4次，过滤合并5次滤液得到粗提液；

2)将步骤1)获得的浸膏加水溶解，配置成上柱溶液，上柱溶液通过预处理好的大孔吸附树脂柱进行吸附，达到吸附平衡后，用洗脱剂乙醇洗脱大孔吸附树脂柱，然后对洗脱液减压蒸干溶剂得到纯化延龄草甾体皂苷；

大孔吸附树脂为弱极性的AB-8树脂，浓度为5.17mg/mL，上样量为80mL的上柱溶液以2BV/h的流速通过装有5gAB-8树脂的层析柱(2×30cm，树脂柱高15cm)，达到平衡吸附后，用10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％的乙醇连续洗脱，洗脱剂的体积分别为100mL，洗脱流速为2BV/h，洗脱液减压蒸干，既得纯化延龄草甾体皂苷。所有实验平行操作三次，计算相对标准偏差。

本实施例的有益效果为：

参照图4，洗脱剂为10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％的乙醇时，AB-8树脂柱对甾体皂苷的解吸量分别为3.5mg/g、4.5mg/g、6.9mg/g、15.3mg/g、30.0mg/g、15.7mg/g、3.0mg/g、1.4mg/g、0.9mg/g，当洗脱剂为70％乙醇时，大部分甾体皂苷被洗脱下来。

实施例5

一种用大孔吸附树脂分离纯化延龄草甾体皂苷的工艺，包括以下步骤：

1)利用乙醇加热回流法对延龄草药材进行甾体皂苷提取，先获得粗提液，将粗提液减压蒸干，得到浸膏备用，获得粗提液的具体步骤为：

1.1)将延龄草药材干燥、粉碎至60目，加入提取溶媒乙醇，提取溶媒乙醇与延龄草药材的体积质量比为6mL/g，提取溶媒乙醇的体积浓度为75％，加热回流提取2h；

1.2)收集滤液，滤渣再加入75％提取溶媒乙醇重复提取4次，过滤合并5次滤液得到粗提液；

2)将步骤1)获得的浸膏加水溶解，配置成上柱溶液，上柱溶液通过预处理好的大孔吸附树脂柱进行吸附，达到吸附平衡后，用洗脱剂乙醇洗脱大孔吸附树脂柱，然后对洗脱液减压蒸干溶剂得到纯化延龄草甾体皂苷；

大孔吸附树脂为弱极性的AB-8树脂，浓度为5.17mg/mL、上样量为80mL的上柱溶液以2BV/h的流速通过装有5gAB-8树脂的层析柱(2×30cm，树脂柱高15cm)，达到平衡吸附后，用70％的乙醇洗脱AB-8大孔吸附树脂柱，洗脱剂的体积分别为10mL、20mL、30mL、40mL、50mL、60mL、70mL、80mL、90mL、100mL、110mL，洗脱流速为2BV/h，洗脱液减压蒸干，既得纯化延龄草甾体皂苷。所有实验平行操作三次，计算相对标准偏差。

本实施例的有益效果为：

参照图5，洗脱剂的体积分别为10mL、20mL、30mL、40mL、50mL、60mL、70mL、80mL、90mL、100mL、110mL时，洗脱液中的甾体皂苷含量分别是0.9mg/mL、7.7mg/mL、3.7mg/mL、2.8mg/mL、1.7mg/mL、1.6mg/mL、1.1mg/mL、0.8mg/mL、0.5mg/mL、0.3mg/mL、0.2mg/mL，当洗脱剂用量为90mL时，大部分甾体皂苷被洗脱下来。

实施例6

一种用大孔吸附树脂分离纯化延龄草甾体皂苷的工艺，包括以下步骤：

1)利用乙醇加热回流法对延龄草药材进行甾体皂苷提取，先获得粗提液，将粗提液减压蒸干，得到浸膏备用，获得粗提液的具体步骤为：

1.1)将延龄草药材干燥、粉碎至60目，加入提取溶媒乙醇，提取溶媒乙醇与延龄草药材的体积质量比为6mL/g，提取溶媒乙醇的体积浓度为75％，加热回流提取2h；

1.2)收集滤液，滤渣再加入75％提取溶媒乙醇重复提取4次，过滤合并5次滤液得到粗提液；

2)将步骤1)获得的浸膏加水溶解，配置成上柱溶液，上柱溶液通过预处理好的大孔吸附树脂柱进行吸附，达到吸附平衡后，用洗脱剂乙醇洗脱大孔吸附树脂柱，然后对洗脱液减压蒸干溶剂得到纯化延龄草甾体皂苷；

大孔吸附树脂为弱极性的AB-8树脂，浓度为5.17mg/mL、上样量为80mL的上柱溶液以2BV/h的流速通过装有5gAB-8树脂的层析柱(2×30cm，树脂柱高15cm)，达到平衡吸附后，90mL、70％的乙醇分别以1BV/h、2BV/h、3BV/h、4BV/h的流速洗脱AB-8大孔吸附树脂柱，洗脱液减压蒸干，既得纯化延龄草甾体皂苷。所有实验平行操作三次，计算相对标准偏差。

本实施例的有益效果为：

参照图6，洗脱剂的流速为1BV/h、2BV/h、3BV/h、4BV/h时，AB-8树脂柱对甾体皂苷的解析率分别为96.45％、97.12％、87.2％、76.64％，当洗脱流速为2BV/h时解析率最大。

实施例7

一种用大孔吸附树脂分离纯化延龄草甾体皂苷的工艺，包括以下步骤：

1)利用乙醇加热回流法对延龄草药材进行甾体皂苷提取，先获得粗提液，将粗提液减压蒸干，得到浸膏备用，获得粗提液的具体步骤为：

1.1)将延龄草药材干燥、粉碎至60目，加入提取溶媒乙醇，提取溶媒乙醇与延龄草药材的体积质量比为6mL/g，提取溶媒乙醇的体积浓度为75％，加热回流提取2h；

1.2)收集滤液，滤渣再加入75％提取溶媒乙醇重复提取4次，过滤合并5次滤液得到粗提液；

2)将步骤1)获得的浸膏加水溶解，配置成上柱溶液，上柱溶液通过预处理好的大孔吸附树脂柱进行吸附，达到吸附平衡后，洗脱剂乙醇洗脱大孔吸附树脂柱，然后对洗脱液减压蒸干溶剂得到纯化延龄草甾体皂苷；

大孔吸附树脂为弱极性的D-101树脂，浓度为5.17mg/mL、上样量为80mL的上柱溶液以2BV/h的流速通过装有5gAB-8树脂的层析柱(2×30cm，树脂柱高15cm)，达到平衡吸附后，90mL、70％乙醇以2BV/h洗脱AB-8大孔吸附树脂柱，洗脱液减压蒸干，既得纯化延龄草甾体皂苷。

本实施例的有益效果为：

D-101树脂柱对甾体皂苷的吸附量和解析率分别为89.23mg/g、78.54％。实施例8

一种用大孔吸附树脂分离纯化延龄草甾体皂苷的工艺，包括以下步骤：

1)利用乙醇加热回流法对延龄草药材进行甾体皂苷提取，先获得粗提液，将粗提液减压蒸干，得到浸膏备用，获得粗提液的具体步骤为：

1.1)将延龄草药材干燥、粉碎至60目，加入提取溶媒乙醇，提取溶媒乙醇与延龄草药材的体积质量比为6mL/g，提取溶媒乙醇的体积浓度为75％，加热回流提取2h；

1.2)收集滤液，滤渣再加入75％乙醇重复提取4次，过滤合并5次滤液得到粗提液；

2)将步骤1)获得的浸膏加水溶解，配置成上柱溶液，上柱溶液通过预处理好的大孔吸附树脂柱进行吸附，达到吸附平衡后，洗脱剂乙醇洗脱大孔吸附树脂柱，然后对洗脱液减压蒸干溶剂得到纯化延龄草甾体皂苷；

大孔吸附树脂为弱极性的HPD-600树脂，浓度为5.17mg/mL、上样量为80mL的上柱溶液以2BV/h的流速通过装有5gAB-8树脂的层析柱(2×30cm，树脂柱高15cm)，达到平衡吸附后，90mL、70％乙醇以2BV/h洗脱AB-8大孔吸附树脂柱，洗脱液减压蒸干，既得纯化延龄草甾体皂苷。

本实施例的有益效果为：

HPD-600树脂柱对甾体皂苷的吸附量和解析率分别为85.63mg/g、67.44％。