干扰素调节因子6（IRF6）及其抑制剂在治疗心肌肥厚中的应用的制作方法

本发明属于基因的功能与应用领域，涉及干扰素调节因子6(Interferon Regulatory Factor-6，IRF6)作为药物靶标在筛选治疗心肌肥厚的药物中的应用，以及IRF6的抑制剂在制备治疗心肌肥厚的药物中的应用。

背景技术：

心肌肥厚是指在生物学牵张负荷或神经内分泌因素刺激诱导下，正常心脏心肌结构和功能的不断调整，主要表现为心室空间构象和生物学效应的改变，如局部或大部分甚至整个心室壁或/和心房壁增厚、心脏质量增加并伴随心脏射血功能改变和心室壁张力变化。病理性心肌肥厚是心脏重塑发生发展的重要环节，最初，代偿性的肥厚能使心脏应对各种病理性的刺激，但持续的病理性刺激最终将导致心脏失代偿性肥厚，收缩功能受损和典型的心脏重塑[1，2]。在细胞水平，心肌细胞肥大、排列紊乱，间质成分如成纤维细胞增殖，胶原合成和分泌增加，并伴随心肌细胞凋亡。分子水平上表现为神经内分泌因子激活，胚胎基因再表达和兴奋收缩耦联相关蛋白、促纤维化相关基因的表达水平变化[3]。国内外学者对心肌肥厚的发病基础和临床防治进行了大量的研究，发现多种细胞外配体和细胞膜受体以及细胞内信号转导通路和核内转录因子参与了这一系列改变，包括丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)、钙调神经磷酸酶(Calcineurin/NFAT、Janus激酶/信号转导与转录激活子(JAK/STAT)、蛋白激酶C(PKC)、磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)、Wnt/β-连环蛋白(β-catenin)和转化生长因子β(TGFβ)[4]。目前针对心肌肥厚的主流治疗策略是通过干预心肌重构相关的分子靶点，改善心功能，预防和逆转心脏重构。临床上，血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)、血管紧张素Ⅱ受体Ⅰ阻断剂(ARBs)、钙拮抗剂(CAs)被作为主要的抗心肌肥厚药物[5]。

IRF家族是一大类对IFN起调控作用的转录因子。IRF家族包含10个成员，其中，IRF1-9普遍表达于哺乳动物中，IRF10则特异性地在鸟类和鱼类中表达。在结构上，IRF家族成员的N末端含有相对保守的DNA结合结构域(DNA binding domain，DBD)，C末端包含有IRF相关结构域(IRF associated domain，IAD)、自我抑制结构域、磷酸化位点等[6]。IRF6定位于1q32，IRF6虽然在结构上与IRF家族其他成员类似，但我们对其在天然免疫上的功能知之甚少，甚至有大量研究认为IRF6与天然免疫没有关系[7]。目前关于IRF6的研究主要集中在调控上皮细胞的成熟分化方面。IRF6在皮肤角质细胞中高表达，并且在角质细胞分化成熟的过程中起着关键的作用。研究发现IRF6能够与p63家族成员DeltaNp63形成一个调控环路来抑制角质细胞的增殖。Wnt信号通路则作为p63/IRF6上游参与这个过程，Wnt减少能阻断p63/IRF6信号通路，导致细胞增殖增多，凋亡减少[8]。此外，在角质细胞中，IRF6作为Notch的主要靶分子参与Notch信号通路调节角质细胞的分化和肿瘤抑制功能[9]。TGF-β/Smad4信号通路能够激活IRF6，并调节下游p21的表达参与颅面愈合[10]。IRF6的突变与以唇腭裂为特征的人类先天性综合征—范德伍综合征(Vander Woude syndrome)和腘翼状胬肉综合征(popliteal pterygium syndrome)的发生直接相关。定点敲入人类综合征中常见的突变位点R84C的小鼠和IRF6基因完全敲除小鼠均出现角质细胞分化和增殖异常，并且能够重现范德伍综合征的表型[11，12]。综上所述，IRF6执行其生物学功能均为通过非免疫依赖的方式实现的。

参考文献：

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技术实现要素：

为改进临床防治心肌肥厚疾病现有技术的缺陷和不足，本发明的目的在于确定IRF6基因的表达与心肌肥厚疾病间的相互关系，提供IRF6作为药物靶标在筛选、防治心肌肥厚疾病药物中的应用，进而提供IRF6的抑制剂在制备防治心肌肥厚疾病的药物中的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

1、IRF6基因敲除显著抑制了心肌肥厚、纤维化，改善心功能

本发明选用心脏特异性α-MHC-MCM小鼠、IRF6心脏特异性基因敲除小鼠(IRF6-CKO)、用于构建IRF6-CKO的条件性敲除小鼠(IRF5-flox，IRF6正常表达)进行试验，并将每种小鼠分成假手术组和手术组，每组10只小鼠。手术组给予主动脉弓缩窄手术，假手术组不予主动脉弓缩窄，然后通过对假手术组和手术组的各组小鼠进行心脏心肌肥厚、纤维化及心功能的测定，研究IRF6基因敲除对主动脉弓缩窄诱导的心肌肥厚的影响。结果表明敲除基因所致的IRF6缺陷显著地抑制心肌肥厚、纤维化及改善心功能。

2、IRF6基因过表达显著促进了心肌肥厚及其纤维化，恶化心功能

本发明选用心脏特异性IRF6转基因小鼠和非转基因小鼠进行试验，并将每种小鼠分成假手术组和手术组，每组10只小鼠。手术组给予主动脉弓缩窄手术，假手术组不予主动脉弓缩窄，然后通过对假手术组和手术组的各组小鼠进行心脏心肌肥厚、纤维化及心功能的测定，研究IRF6基因过表达对主动脉弓缩窄诱导的心肌肥厚的影响。结果表明过表达IRF6基因显著地促进心肌肥厚、纤维化，并恶化心功能。

3、IRF6干扰(AdshIRF6)及过表达(AdIRF6)腺病毒对经Ang II诱导的心肌细胞肥大模型的影响

本发明通过构建重组腺病毒AdshIRF6及AdIRF6感染SD乳鼠原代心肌细胞，予以Ang II刺激构建心肌细胞肥大模型，对照组则予以PBS，经免疫荧光监测及心肌细胞表面积统计表明，在Ang II刺激下IRF6干扰病毒明显抑制心肌细胞肥大，心肌细胞表面积减小；IRF6过表达病毒显著促进心肌细胞肥大，心肌细胞表面积增大。

由上述结果可知在心肌肥厚的模型中，IRF6的表达与正常组相比显著上调。IRF6基因缺陷抑制了心肌肥厚、纤维化，改善心功能；促进IRF6表达则促进心肌肥厚、纤维化，恶化心功能。本发明的研究证明了：在主动脉缩窄术造成心肌肥厚模型中，IRF6具有促进心肌肥厚及其纤维化，恶化心功能的作用。

因此，针对上述功能，IRF6基因可作为药物靶点，构建IRF6基因过表达的体外细胞模型或动物模型，从而用于筛选预防、缓解和/或治疗心肌肥厚疾病的药物；IRF6基因也可作为基因治疗中的靶基因，在其基础上设计并制备预防、缓解和/或治疗心肌肥厚疾病的药物和/或生物学试剂，通过基因工程技术达到预防、缓解和/或治疗心肌肥厚疾病的目的。例如，以IRF6为靶基因设计干扰IRF6表达的双链siRNA，通过化学方法合成后注射入人体，通过RNA干扰的方法使IRF6基因沉默以治疗心肌肥厚疾病；此外还可以设计并构建IRF6的突变体，注射后进入细胞，竞争IRF6原型的作用底物，从而抑制IRF6的功能，达到治疗目的；另还可以IRF6为靶点设计小分子化合物抑制剂，利用IRF6基因过表达的体外细胞模型或动物模型，通过筛选发现其中能够特异性抑制IRF6的分子，从而为心肌肥厚疾病提供新的治疗性分子。

本发明针对IRF6的上述功能，提供IRF6作为药物靶标，在筛选保护心脏功能、预防、缓解和/或治疗心肌肥厚及抗心肌纤维化的药物中的应用。所述的应用是非诊断和非治疗的目的；所述的筛选是指筛选IRF6的抑制剂。

本发明针对IRF6的上述功能，提供IRF6的抑制剂在制备保护心脏功能和预防、缓解和/或治疗心肌肥厚及抗心肌纤维化的药物中的应用。

一种保护心脏功能的药物，包含IRF6的抑制剂。

一种预防、缓解和/或治疗心肌肥厚的药物，包含IRF6的抑制剂。

一种抗心肌纤维化的药物，包含IRF6的抑制剂。

所述的IRF6的抑制剂具有本领域公知的含义，其可以是能够特异抑制IRF6对靶基因的调控作用的任何物质，可以是在细胞中特异抑制IRF6表达的物质，也可以是与IRF6具有特异性相互作用并能减弱IRF6作用的物质。优选为IRF6基因的siRNA、IRF6基因的RNA干扰载体，IRF6的抗体及其他能够抑制IRF6表达的抑制剂中的一种。

一种筛选用于保护心脏功能和预防、缓解和/或治疗心肌肥厚疾病的药物的方法，为筛选IRF6的抑制剂的方法，包括根据IRF6的序列设计其反义RNA，或者将IRF6与候选物质接触，检测IRF6的表达或作用，并选择特异抑制IRF6表达或减弱IRF6作用的候选物质。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明发现IRF6的新功能，即IRF6具有促进心肌肥厚及其纤维化，恶化心功能的作用。

(2)基于IRF6的功能，其为研制保护心脏功能、预防、缓解和/或治疗心肌肥厚疾病的药物提供靶标。

(3)IRF6的抑制剂可用于制备保护心脏功能、预防、缓解和/或治疗心肌肥厚疾病的药物。

附图说明

图1是心脏特异性敲除IRF6小鼠的打靶策略及IRF6蛋白表达量统计图。其中，A为心脏特异性敲除IRF6小鼠的打靶策略图；B心肌细胞特异性IRF6基因敲除小鼠(IRF6-CKO)心脏组织中的IRF6蛋白表达水平Western Blot检测结果，与野生型小鼠相比，心肌细胞特异性IRF6基因敲除小鼠(IRF6-CKO)心脏组织中的IRF6蛋白表达水平显著降低。

图2是心脏特异性IRF6转基因小鼠的构建策略及IRF6蛋白表达量统计图。其中，A为心脏特异性IRF6转基因小鼠的构建策略图；B为心脏组织总蛋白中NTG与TG小鼠IRF6蛋白的表达量Western Blot检测结果，图中TG2-TG6是构建的不同个体的IRF6-TG小鼠。

图3是正常人和扩张性心肌病患者心脏中IRF6蛋白的表达图，GAPDH作为内参，结果显示扩张性心肌病患者心脏中IRF6的表达上调(*：p＜0.05vs正常人组)。

图4是α-MHC-MCM、IRF6-flox和IRF6-CKO小鼠AB术4周后HW/BW、LW/BW及HW/TL的统计柱状图，结果显示IRF6敲除降低HW/BW、LW/BW及HW/TL(*：p＜0.05vsα-MHC-MCM Sham组，§：p＜0.05vs IRF6-flox sham，#：p＜0.05vsα-MHC-MCM AB组)。

图5是α-MHC-MCM、IRF6-flox和IRF6-CKO小鼠AB术4周后心脏组织HE、WGA染色及心肌细胞横截面积统计柱状图，结果显示IRF6敲除减轻心肌细胞肥大(*：p＜0.05vsα-MHC-MCM Sham组，§：p＜0.05vs IRF6-flox sham，#：p＜0.05vsα-MHC-MCM AB组)。

图6是α-MHC-MCM、IRF6-flox和IRF6-CKO小鼠AB术4周后心脏组织天狼星红染色图，结果显示IRF6敲除减轻心脏的纤维化(*：p＜0.05vsα-MHC-MCM Sham组，§：p＜0.05vs IRF6-flox sham，#：p＜0.05vsα-MHC-MCM AB组)。

图7是NTG和IRF6-TG小鼠AB术4周后HW/BW、LW/BW及HW/TL的统计柱状图，结果显示IRF6过表达组HW/BW、LW/BW及HW/TL升高(*：p＜0.05vs NTG Sham组，#：p＜0.05vs NTG AB组)。

图8是NTG和IRF6-TG小鼠AB术4周后心脏组织HE、WGA染色及心肌细胞横截面积统计柱状图，结果显示IRF6过表达会促进心肌细胞肥大(*：p＜0.05vs NTG Sham组，#：p＜0.05vs NTG AB组)。

图9是NTG和IRF6-TG小鼠AB术4周后心脏组织天狼星红染色图，结果显示IRF6过表达会加重心脏的纤维化(*：p＜0.05vs NTG Sham组，#：p＜0.05vs NTG AB组)。

图10是α-MHC-MCM、IRF6-flox和IRF6-CKO小鼠AB术4周后超声检测心功能结果统计柱状图，结果显示敲除IRF6改善心功能；其中，LVEDD为左室舒张末期内径、LVESD为左室收缩末期内径、FS为短轴缩短率(*：p＜0.05vsα-MHC-MCM Sham组，§：p＜0.05vs IRF6-flox sham，#：p＜0.05vsα-MHC-MCM AB组)。

图11是NTG和IRF6-TG小鼠AB术4周后超声检测心功能结果统计柱状图，结果显示过表达IRF6心功能恶化；其中，LVEDD为左室舒张末期内径、LVESD为左室收缩末期内径、FS为短轴缩短率(*：p＜0.05vs NTG Sham组，#：p＜0.05vs NTG AB组)。

图12是SD乳鼠原代心肌细胞用腺病毒AdshRNA、AdshIRF6、AdGFP、AdIRF6感染，经Ang II刺激后的免疫荧光及细胞表面积统计柱状图，IRF6的过表达病毒促进心肌细胞肥大，IRF6的干扰病毒抑制心肌细胞肥大。(*：p＜0.05vs AdshRNA/AdGFP PBS组，#：p＜0.05vs AdshRNA/AdGFP Ang II组)。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进行一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实验用动物及饲养

实验动物：选用8-10周龄、体重23.5-27.5g、雄性的心脏特异性Cre小鼠(α-MHC-Cre(α-MHC-MCM)，背景为C57BL/6，购自Jackson Laboratory，货号005650)、IRF6-flox条件性敲除小鼠(IRF6-flox)、心脏特异性IRF6基因敲除小鼠(IRF6-CKO)、心脏特异性IRF6转基因小鼠(IRF6-TG)及非转基因小鼠(NTG，同龄同窝对照非转基因小鼠)为实验对象。

饲养环境：所有实验小鼠均饲养在武汉大学SPF级实验动物中心。SRF级小鼠饲料购自北京华阜康生物科技股份有限公司。饲养条件：室温在22-24℃之间，湿度在40-70％之间，明暗交替照明时间为12h，自由饮水摄食。

实施例1心脏特异性IRF6基因敲除小鼠以及IRF6转基因小鼠的构建

1.心脏特异性IRF6基因敲除小鼠的构建(构建策略见图1A)

利用CRISPR-Cas9技术构建心脏特异性IRF6基因敲除小鼠。首先，通过在线CRISPR设计工具(http://crispr.mit.edu)分别在小鼠IRF6基因内含子2和3中各设计一个CRISPR的打靶位点，靶序列分别为：

IRF6-sgRNA 1：GGTCTGGGGCGACATTGTACAGC AGG，

IRF6-sgRNA 2：GGCGTGTTAGTAAGCCGAAGTCAC AGG。

此外还设计了一个用于同源修复的供体载体(Donor Vector)，它包括两侧同源臂、中间的外显子3以及两个同向的loxp序列。

(1)打靶载体的构建：分别将sgRNA1和sgRNA2对应的两条引物融合成双链DNA，然后用T4DNA连接酶连入经过限制性内切酶BsaI处理过的pUC57-sgRNA载体中。该载体上游有一个T7启动子，可以用于后续的体外转录实验。

(2)条件性敲除骨架载体pBluescript SK(+)-2loxp的构建：

分别合成4条寡聚单链核苷酸序列：

loxp1-F：AGCTTGACGTCATAACTTCGTATAGCATACATTATAGCAATTTATACCGGTGAT，

loxp1-R：ATCACCGGTATAAATTGCTATAATGTATGCTATACGAAGTTATGACGTCA；

loxp2-F：GATCCCTTAAGATAACTTCGTATAGCATACATTATAGCAATTTATACGCGTA，

loxp2-R：CTAGTACGCGTATAAATTGCTATAATGTATGCTATACGAAGTTATCTTAAGG；

上述寡核苷酸序列退火后形成loxp1和loxp2两条双链。将pBluescript II SK(+)载体用HindIII(NEB，R0104L)和EcoRV(NEB，R0195L)双酶切后连接入loxp1退火双链，再将测序正确的载体用BamHI(NEB，R0136L)和SpeI(NEB，R0133L)双酶切，连接入loxp2退火双链，得到条件性敲除骨架载体，命名为pBluescript SK(+)-2loxp。

(3)供体载体的构建：根据引物设计原则，设计如下引物(表1)用于扩增供体载体的左右同源臂(LA和RA)以及中间的外显子部分(M)。扩增得到的产物经表1中所示限制性内切酶酶切后得到3个片段，将其分别连入条件性敲除骨架载体pBluescript SK(+)-2loxp中，得到供体载体。

表1构建供体载体所需引物序列及对应酶切位点

(4)打靶载体的转录：对CRIPR/Cas9系统包含的两个部分(负责切割作用的Cas9蛋白和引导Cas9蛋白定位到靶位点的gRNA)分别进行转录。对于Cas9蛋白，将其表达载体pST1374-Cas9(Addgene 44758)用PmeI进行酶切，以纯化后回收线性化质粒为转录模板，用T7mMESSAGE mMACHINE试剂盒(AM1345，Ambion)进行体外转录，获得加帽的mRNA产物。并用Poly(A)Tailing试剂盒(Ambion)对上述产物加尾，获得成熟的mRNA产物；对于sgRNA，使用MEGAshortscript^TM Kit(AM1354，Ambion公司)进行体外转录。将转录得到的Cas9和sgRNA的mRNA使用miRNeasy Micro Kit(Qiagen，217084)进行纯化。

(5)IRF6-flox条件性敲除小鼠的制作

将上述成熟的mRNA产物与供体质粒一同注入小鼠受精卵中，移植到代孕母鼠体内进行培育。得到的小鼠进行鉴定。取出生一周后的小鼠脚趾或尾部组织，提取基因组，并通过PCR方法筛选阳性首建鼠。从确定发生同源重组的小鼠中随机挑选一只作为F0代进行后续的繁殖，最终获得IRF6-flox纯合小鼠。

(6)心脏特异性IRF6基因敲除小鼠的制作

将上述IRF6-floxed小鼠与心脏特异性α-MHC-Cre(购自Jackson Laboratory，货号005650)转基因小鼠交配，筛选得到IRF6^flox/flox/α-MHC-Cre小鼠，待该小鼠长至6周龄左右后，腹腔注射Tamoxifen(他莫昔芬)，诱导Cre酶的表达，Cre酶特异性的识别两个同向的loxp，并切除两者之间的序列及其中的一个loxp，最后得到心脏细胞特异性IRF6基因敲除小鼠。取出生一周后的小鼠脚趾或尾部组织，提取对应组织总蛋白，使用Western Blot方法检测IRF6敲除小鼠与WT小鼠心脏组织中IRF6蛋白表达量(图1B)，可见IRF6-CKO小鼠体内，IRF6蛋白表达含量显著降低。

(2)心脏特异性IRF6转基因小鼠的构建(构建策略见图2A)

以C57BL/6小鼠IRF6基因的cDNA为模板，用如下引物PCR扩增IRF6基因(NCBI，Gene ID：54139，NM_006147.3)：

上游引物：5’-GCTCTAGAGCCACCATGGCCCTCCACCCCC-3’，

下游引物：5’-GCTCTAGATTACTGGGGAGGCAGGGC-3’。

把扩增得到的产物和pCAG-CAT-LacZ载体(北京协和医学院基础学院杨青林老师实验室提供，制备过程参见参考文献：Kim T,Zhelyabovska O,Liu J,et al.Generation of an Inducible,Cardiomyocyte-Specific Transgenic Mouse Model with PPAR b/d Overexpression[J].Peroxisome Proliferator-Activated Receptors(PPARs),57.)用限制性内切酶XbaI(NEB，#R0145L)酶切后连接，得到转基因载体pCAG-CAT-IRF6-polyA，IRF6的表达由CAG启动子驱动得到。

将构建的pCAG-CAT-IRF6-polyA载体通过显微注射构造成受精胚胎(C57BL/6J背景)，得到IRF6-floxed转基因小鼠。心脏特异性IRF6转基因小鼠由IRF6-floxed转基因小鼠和α-MHC-Cre(购自Jackson Laboratory，货号005650)小鼠杂交繁殖得到，方法同上述基因敲除小鼠的构建。

取出生一周后的小鼠脚趾或尾部组织，提取对应组织总蛋白，使用Western Blot方法筛选IRF6表达量最高的小鼠。将其同窝阳性鼠继续繁殖，从而获得稳定遗传心脏特异性IRF6转基因小鼠品系。为了反映病理生理状态下IRF6的改变，本发明选择了IRF6-TG5小鼠，Western Blot及定量分析显示，其心脏组织中IRF6表达量约为正常组织4.5倍(图2B)。

实施例2IRF6在正常人和心肌病患者心脏中的表达

选用正常人心脏(非心脏原因的死亡捐献的个体)、扩张型心肌病患者心脏移植手术病人置换的受体)，对心脏提取蛋白质进行SDS-PAGE-免疫印迹实验(Western Blot)，结合特异性识别IRF6的抗体进行检测，测定其IRF6的表达，GAPDH作为内参。检测结果如图3所示，扩张型心肌病患者心脏中IRF6的表达明显上调。

实施例3心肌肥厚模型的获得

1.实验动物分组：通过主动脉缩窄(AB)术建立心肌肥厚模型。随机分为10组，分组如下：对照组假手术组(α-MHC-MCM Sham、IRF6-flox Sham)及对照组AB术组(α-MHC-MCM AB、IRF6-flox AB)、IRF6基因敲除小鼠假手术组(IRF6-CKO Sham)及AB术组(IRF6-CKO AB)、非转基因小鼠假手术组(NTG Sham)及AB术组(NTG AB)、心脏特异性IRF6转基因小鼠假手术组(TG Sham)及AB术组(TG AB)。

2.心肌肥厚模型采用主动脉弓缩窄(AB)手术，模型操作流程：

2.1术前准备

(1)麻醉：先给小鼠称重，按照90mg/kg体重计算所需麻药(3％戊巴比妥钠)量，通过腹腔注射，并记录注射时间点。夹尾、夹趾无明显反应且小鼠状态良好为麻醉成功标准(一般注射后约10min无明显反应，以麻醉后约50min小鼠夹趾有反应，麻醉后30min左右为最佳手术时间)。

(2)术区准备：将小鼠左胸部、左侧胸部及左前肢腋下的皮肤去毛。剃毛后用湿纱布擦拭术区去除鼠毛，以不影响手术视野为宜。

(3)气管插管：用橡皮筋将小鼠上门齿固定于V形板斜面上，并迅速将气管插管经声门准确插入气管内，随后右侧卧位置于加热垫上(加热垫需提前预热)，然后将气管插管与呼吸机连接，固定小鼠。若小鼠的胸廓起伏与呼吸机频率一致，说明气管插管成功。

2.2主动脉弓降支结扎术

取右侧卧位，小鼠左前肢置于右前肢上方，并用医用胶带将两前肢固定。右胸部下方垫入棉签，抬高胸廓，依次用碘酒及体积分数为75％的酒精对手术区域皮肤消毒。左手持眼科镊将左胸部皮肤捏起，右手持眼科剪剪开皮肤约1cm，依次分离肌肉及软组织，于第2-3肋水平打开胸腔，用棉签稍拨开左肺，游离主动脉弓降支，将7-0手术缝线穿过血管，并在血管上方平行放置一段26G(25.0-27.5g小鼠)或者27G(23.5-25.0g)注射器针头，将血管及针头一起结扎好，再抽出针头即可达到相应程度的血管缩窄。结扎完毕后依次缝合，关闭胸腔，用注射器从缝口处插入胸腔并抽出1cc气体以恢复胸腔内负压，拔出注射器后迅速缝合皮肤切口。假手术组(Sham)在游离出主动脉降支后只穿线不结扎，其余步骤同心肌肥厚模型组。

2.3术后护理

主动脉弓降支结扎术后，待小鼠出现自主呼吸、夹趾出现强烈反应，拔出气管插管，并将小鼠放入装有高压灭菌过的垫料、饲料和饮用水的饲养笼内，于饲养室继续饲养观察。IRF6基因敲除小鼠及对照组小鼠术后4周、非转基因小鼠及心脏特异性IRF6转基因小鼠术后4周分别进行各项指标的检测。

实施例4心肌肥厚模型小鼠病理学检测

1.取材

(1)前期工作：预先准备装有20mL的体积分数10％甲醛的尿杯，并贴好标签(小鼠编号、组别、手术类型及取材日期)。将倒满质量分数10％KCl溶液的培养皿置于取材处。打开分析天平，调零备用。再称重处死小鼠。

(2)取材：眼科弯镊夹住心耳下方的血管蒂，剪下心脏，迅速置于质量分数10％KCl溶液中。待心脏停跳在舒张期后，置于灭菌纱布上，轻轻挤压心腔内液体，蘸干表面液体后，称重并记录，将心脏放入相应的尿杯中，固定48h后用于病理学检测。

(3)相关测量及计算：取出小鼠心脏、肺脏，修剪后滤纸吸干，称重并记录。剪开小鼠后肢胫骨处皮肤，测量并记录胫骨长度。计算心重与体重的比值(HW/BW)，肺重与体重的比值(LW/BW)以及心重与胫骨长度的比值(HW/TL)。

2.病理学检测

2.1制备石蜡标本切片

主要操作程序包括修剪心脏→包埋框处理→流水冲洗→脱水→透明→浸蜡→包埋→切片→摊片→晾干或烘烤后备用。

2.2苏木精-伊红(HE)染色

主要步骤为：55℃烘烤30min→二甲苯5min，3次→100％酒精1min→95％酒精1min→70％酒精1min→双蒸水1min→苏木素溶液(珠海贝索，BA-4021)5min→水洗1min→1％盐酸酒精(取3mL浓盐酸与297mL 70％酒精充分混合均匀)1-3s→水洗1min→Scott液(碳酸氢钠0.35g，七水硫酸镁2g，两者溶于100mL蒸馏水)1min→水洗1min→伊红溶液(珠海贝索，BA-4024)3-5min→蒸馏水洗去浮色→70％酒精1s→95％酒精1s→100％酒精30s，3次→二甲苯2min，3次→趁二甲苯未干立即封片→通风橱内吹干，显微镜拍照。

2.3麦胚凝集素染色(WGA染色)

主要步骤为：将石蜡切片置于烘箱烘烤60min→二甲苯脱蜡5min，3次→100％乙醇5min，2次→95％乙醇5min→70％乙醇5min→双蒸水浸洗5min，2次→PBS洗5min，2次→甩尽玻片上水分，用免疫组化笔在组织周围画圈→50μg/ml WGA-FITC，湿盒内孵育30min→PBS洗5min，3次→DAPI复染8min→使用水溶性封片剂封片，置于4℃冰箱内避光保存。

于荧光显微镜400倍下拍照，并使用ImagePro Plus 6.0软件测算圆形或近似圆形的左室单个心肌细胞横截面积。要求统计每组不少于5只小鼠，每只小鼠不少于100个细胞。

2.4天狼星红(PSR)染色

主要步骤为：55℃烘烤30min→二甲苯2min，3次→100％酒精1min→95％酒精1min→70％酒精1min→流水冲洗10min→双蒸水1min→质量分数0.2％磷钼酸2min→0.1％天狼猩红苦味酸溶液滴于组织上，湿盒中染色90min→去除残液→0.01N盐酸4s→70％酒精1次→90％酒精1次→100％酒精30s，3次→二甲苯2min，3次→趁二甲苯未干立即盖玻片封片，显微镜拍照。

心肌组织由心肌细胞和间质组织组成，心脏是一终末分化器官，心肌细胞失去增殖能力，各种生理或病理性刺激引起的心肌细胞反应，只能是单个细胞的体积增大而不能在数量上增殖。因此，在心肌肥厚的病理生理过程中，主要表现为心肌细胞体积增大，肌节数量增多，细胞排列紊乱，心脏间质改变包括心肌成纤维细胞的增殖与转化，胶原纤维密度增加，胶原分泌增加，胶原比例平衡失调等。

α-MHC-MCM、IRF6-flox和IRF6-CKO小鼠AB术后的表型结果见图4、图5、图6。Sham(假手术)组中对照组α-MHC-MCM、IRF6-flox小鼠与IRF6-CKO小鼠的HW/BW、LW/BW及HW/TL之间的差异均无统计学意义；α-MHC-MCM、IRF6-flox小鼠AB术后4周的HW/BW、LW/BW、HW/TL高于其Sham组；AB术后4周，IRF6-CKO小鼠的HW/BW、LW/BW及HW/TL均较α-MHC-MCM、IRF6-flox小鼠降低(图4)。心脏表型，Sham组心脏无明显差异，AB组较Sham组的心脏均增大，IRF6-CKO小鼠的心脏增大程度明显小于对照组小鼠。HE及WGA染色切片可观察到：Sham组心肌肌原纤维细胞排列整齐、致密，形态完整，胞核及核仁结构清晰；AB组肌丝排列紊乱、松散，心肌细胞体积明显增大，形态不规整，胞核深染、增大、畸形，核仁模糊，而IRF6-CKO组较α-MHC-MCM、IRF6-flox组细胞肥大减轻，差异有统计学意义(图5)。PSR染色后，发现AB组心室心肌间质胶原含量较Sham组增加，动脉血管周围胶原增加更为明显，胶原增粗，排列紊乱成网络状；AB术后IRF6-CKO小鼠胶原含量及血管周围胶原含量低于对照组小鼠(图6)。以上结果说明经AB术后，小鼠发生明显的心肌肥厚，而IRF6-CKO小鼠的心肌肥厚程度轻于α-MHC-MCM、IRF6-flox对照组小鼠。

图7、图8、图9是NTG和IRF6-TG小鼠AB术后的表型结果。同样NTG小鼠AB术后4周的HW/BW、LW/BW及HW/TL高于其Sham组；AB术后4周TG小鼠的HW/BW、LW/BW及HW/TL增大的程度明显大于NTG小鼠(图7)。心脏表型，AB组较Sham组的心脏均增大，且AB术后TG小鼠心脏增大的程度远大于NTG小鼠。HE及WGA染色切片可观察到：TG小鼠AB术后心肌细胞横截面积大于Sham组，AB组TG小鼠显著大于NTG小鼠(图8)。PSR染色可见：TG小鼠AB术后心肌间质胶原含量及血管周围胶原含量均高于NTG小鼠AB组(图9)。以上结果说明经AB术后，小鼠发生明显的心肌肥厚，IRF6-TG小鼠的心肌肥厚程度较NTG小鼠更重。

实施例5心肌肥厚模型小鼠超声检测心功能

1.前期准备

(1)麻醉机准备：先连接氧气瓶和麻醉机上的进气接口，再拧开麻醉机上加药口密封盖，迅速加入异氟烷至安全刻度后拧紧密封盖。拧开氧气瓶上总阀门，调整流量控制阀的旋钮，出气压力维持在0.2-0.3mPa。

(2)待测小鼠准备：待检测小鼠用异氟烷迅速麻醉后，左胸前区剃毛，将处理好的小鼠头部伸入麻醉剂导管套头内，以1.5-2.0％异氟烷维持小鼠稳定的麻醉状态。

2.心功能检测

小鼠取左侧卧位或仰卧位，并在剃毛区均匀涂抹超声耦合剂(天津成信公司)。采用高频超声诊断仪，频率为15MHz，选取标准左心室乳头肌短轴切面，测量左室舒张末期内径(LVEDD)、左室收缩末期内径(LVESD)及短轴缩短率(FS)。

本实施例运用M型超声心动图检测评价心肌肥厚和心功能。图10是α-MHC-MCM、IRF6-flox和IRF6-CKO小鼠AB术后心功能检测结果。与对照的Sham组相比，AB组术后4周表现出心功能减弱和心肌肥厚，主要表现为心肌肥厚的指标LVEDD、LVESD均不同程度的增加，而反映心功能的指标FS则下降。AB术后4周，IRF6-CKO小鼠心肌肥厚的指标增大的程度及反映心功能的指标下降的程度轻于α-MHC-MCM、IRF6-flox小鼠。这些结果与IRF6-CKO小鼠心肌肥厚减轻的结果一致。

图11是NTG和IRF6-TG小鼠AB术后的超声检测结果。与NTG Sham组相比，NTG小鼠AB术后4周表现出心功能降低及心肌肥厚。主要表现为心肌肥厚的指标LVEDD、LVESD升高，而反映心功能的指标FS则下降。AB术后4周，与NTG小鼠相比，TG小鼠心肌肥厚指标升高的程度及反映心功能的指标下降的程度均明显高于NTG组。这些结果与TG小鼠心肌肥厚显著加重的结果一致。

实施例6IRF6干扰(AdshIRF6)及过表达(AdIRF6)腺病毒对Ang II刺激的原代心肌细胞肥大的影响

1.原代新生SD大鼠心肌细胞培养

(1)新生1天Sprague-Dawley乳鼠8只，颈部以下75％酒精消毒，用眼科剪和显微镊取下心脏，放入盛有10mL DMEM/F12培养基的玻璃平皿中。再取另一只，重复以上过程。

(2)用DMEM/F12培养基清洗心脏，并将心脏剪成1-2mm³的碎片。转入到放有转子的血清瓶中，吸去DMEM/F12，加入胰酶消化液。转速为120r/min，消化15min，静止数秒钟，弃去上清液。

(3)加入胰酶消化液，转速为120r/min，消化15min。静止数秒钟，吸取上清液，用含20％小牛血清的DMEM/F12培养基终止消化，并置于4℃冰箱保存。重复该步骤，循环若干次。取上清时应尽量取尽，当组织块变白并明显变小时，终止消化。

(4)将收集好的心肌细胞悬液以1500rpm转速离心8min，弃去上清液。在离心管中加入适量培养基，轻柔吹打重悬细胞，集中至1个50mL离心管中，细胞悬液用细胞40μm过滤网过滤。

(5)将细胞接种在100mm的培养皿中，差时贴壁90min，吸取未贴壁的细胞悬液过滤。根据细胞悬液的总量加入Brdu(终浓度0.1mM)，混匀之后，加入到用0.1％明胶包被的器皿中。

(6)轻摇分散细胞，勿漩涡摇晃。37℃、5％CO₂孵育48小时用PBS清洗1次，更换培养基。

2.IRF6干扰(AdshIRF6)及过表达(AdIRF6)腺病毒对经Ang II诱导的心肌细胞肥大模型的影响

AdshRNA(含shRNA(沉默RNA)的腺病毒，用作对照)、AdshIRF6(含shRNA-IRF6(沉默RNA-IRF6融合蛋白)的腺病毒，沉默IRF6表达)、AdGFP(含GFP(绿色荧光蛋白)的腺病毒，用作对照)及AdIRF6(含GFP-IRF6(绿色荧光蛋白-IRF6融合蛋白，IRF6过表达)的腺病毒)。

(1)重组腺病毒构建

从美国InvivoGen公司购得IRF6的表达载体，应用腺病毒表达系统AdenoVec构建重组AdGFP、AdIRF6；从美国SuperArray公司购得shRNA、shIRF6载体，然后应用腺病毒表达系统AdenoVec构建重组AdshRNA、AdshIRF6。

(2)重组腺病毒的鉴定

取病毒粗提液加入裂解液，经混匀、离心后取上清液作为模板进行PCR扩增，产物通过凝胶电泳鉴定。

(3)重组腺病毒的扩增

转染前接种HEK293细胞，待细胞达到50-70％汇合时换液，加入含有重组腺病毒载体的新鲜培养液，培养90分钟后再添加新鲜培养液，培养至大约有50％的细胞从培养板上脱落时，收集细胞悬液。反复冻融以制备病毒粗提液，通过CsCl密度梯度超速离心法纯化病毒液。

(4)重组腺病毒滴度测定

在96孔板中接种HEK293细胞，24小时后加入倍比稀释的病毒液，1-10列加入稀释的病毒液，每个浓度8个重复孔，11-12列加入无病毒完全培养液，培养10天后在显微镜下观察细胞病变效应(CPE)，计算每个浓度的阳性率。病毒滴度采用Spearman-Karber Method计算：滴度(pfu/mL)＝10^(x+0.8)，x＝各浓度阳性率总和。前提条件：阴性对照无CPE和生长抑制现象；最小稀释浓度组均有CPE；最大稀释浓度组均无CPE。

(5)重组腺病毒作用的鉴定

用2×10⁸pfu/virus浓度的AdIRF6和AdGFP及AdshIRF6和AdshRNA感染6孔培养板中培养的心肌细胞(约80％汇合度)，24小时后收集细胞，加入蛋白裂解液裂解50分钟后收集上清，取50μg样品经10％SDS-PAGE电泳分离后，用IRF6特异性抗体做Western Blot分析。根据IRF6蛋白的表达，确定腺病毒AdIRF6和AdGFP及AdshIRF6和AdshRNA是否能发挥预期作用。由AdGFP和AdshRNA感染的细胞IRF6蛋白表达含量不变。由AdshIRF6感染的细胞IRF6蛋白表达含量显著减少；相反的，由AdIRF6感染的细胞IRF6蛋白表达含量显著增加。

腺病毒10MOIs分别感染培养3天的原代心肌细胞，12小时后用1μM血管紧张素II(Ang II)(购自Sigma，A9525)或对照PBS刺激48小时，然后进行免疫荧光试验。结果表明，经AdshIRF6腺病毒感染后的心肌细胞表面积较AdshRNA对照组显著减小，而经AdIRF6腺病毒感染的心肌细胞表面积则与对照组相比AdGFP明显增大(图12)。即IRF6的干扰腺病毒抑制心肌细胞肥大，IRF6过表达的腺病毒则促进心肌细胞肥大。

由以上结果可知，在主动脉弓缩窄引起的心肌肥厚疾病模型中，IRF6基因缺陷显著抑制了心肌肥厚、纤维化，改善心功能，IRF6基因过表达显著促进了心肌肥厚、纤维化，恶化心功能。因此IRF6基因具有促进心肌肥厚及纤维化并使心功能恶化的作用，IRF6基因可促进主动脉弓缩窄引起的心肌肥厚相关疾病的发生发展。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 武汉大学

<120> 干扰素调节因子6（IRF6）及其抑制剂在治疗心肌肥厚中的应用

<130> 1

<160> 14

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 26

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 1

ggtctggggc gacattgtac agcagg 26

<210> 2

<211> 27

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 2

ggcgtgttag taagccgaag tcacagg 27

<210> 3

<211> 54

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> loxp1-F

<400> 3

agcttgacgt cataacttcg tatagcatac attatagcaa tttataccgg tgat 54

<210> 4

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<212> DNA

<213> Artificial

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<223> loxp1-R

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<210> 5

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<212> DNA

<213> Artificial

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<223> loxp2-F

<400> 5

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<212> DNA

<213> Artificial

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<223> loxp2-R

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ctagtacgcg tataaattgc tataatgtat gctatacgaa gttatcttaa gg 52

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<212> DNA

<213> Artificial

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<223> IRF6 LA-F

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ccgctcgagc ggtttagtgt gttcttgttt ga 32

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<212> DNA

<213> Artificial

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<223> IRF6 LA-R

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acgcgtcgac gaattccagg tggtggtgag 30

<210> 9

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<212> DNA

<213> Artificial

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<223> IRF6 M-F

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tctaccggtc ccagacttca gcttcagca 29

<210> 10

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<212> DNA

<213> Artificial

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<223> IRF6 M-R

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<212> DNA

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<223> IRF6 RA-F

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ggactagttc aaagcagtag ggtgtgct 28

<210> 12

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<212> DNA

<213> Artificial

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<223> IRF6 RA-R

<400> 12

ataagaatgc ggccgctgtg ggtccaaaga agcagg 36

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<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial

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<223> 上游引物

<400> 13

gctctagagc caccatggcc ctccaccccc 30

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<212> DNA

<213> Artificial

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<223> 下游引物

<400> 14

gctctagatt actggggagg cagggc 26