本发明涉及生物组织工程支架技术领域，具体地，涉及一种药物/因子控释薄膜支架及其制备方法。
背景技术：
慢性牙周炎会导致牙龈炎症、牙周组织破坏、牙槽骨丢失，甚至牙齿的脱落，是造成健康人失牙的最主要因素之一。2005年全国第三次口腔流行病学调查公布的数字显示，35～44岁牙龈牙周疾病的总患病率为97.2％，而67～74岁牙龈牙周疾病总患病率高达99.4％。
牙周疾病不仅是引起成年人牙齿脱落的首要原因，更是影响心脏、肺、肾等重要脏器功能的重要因素。据国外研究报道，牙周炎患者发生冠心病和中风的几率分别为牙周正常者的1.4倍和2.1倍。牙周炎患者发生慢性肺部感染及肺功能降低的几率是健康人的2倍。
目前,我国已逐渐步入老龄化社会，牙周疾病成为严重危害人民口腔健康和生命质量的致病因素；因牙周组织缺损造成的牙齿缺失是危害人民健康的普遍问题，严重影响人们的饮食、发音、美观和身心健康。
临床上获得牙周组织再生的研究重点是支架材料的使用，这种支架材料的作用是组织种子细胞在牙根表面定植，并且给牙周组织的再生留有一定的空间。牙周组织再生过程中，种子细胞成骨分化分为三个阶段，细胞增殖、胞外基质分泌和胞外基质矿化。现有引导牙周组织再生的支架材料，有些通过缓释细胞因子促进成骨，但是并不能引导种子细胞的增殖。
骨髓基质干细胞和牙周膜干细胞是能促进牙周组织再生的种子细胞。研究表明，血小板衍生因子能够促进其细胞增殖和组织血管化，辛伐他汀能够促进其成骨分化，降低炎症因子产生，有利于牙周组织再生。
想获得理想的牙周组织再生必须把这些关键因素联合起来。我们设计因子表层/药物芯层的膜状仿生支架材料，表层因子早期控释促进细胞增殖和组织血管化，芯层药物随支架降解缓释促进抗炎和成骨分化，从而分期控释，促进牙周组织再生。
技术实现要素：
本发明旨在提供一种新型的可用于临床牙周治疗的支架材料，即、因子表层/药物芯层的膜状支架材料，以期实现活性因子和药物的控释，促进种子细胞的增殖和成骨分化，从而将组织再生研究中种子细胞、支架材料和调节因子三要素有机结合，促进牙周修复，对于牙周组织工程研究有促进作用。
本发明提供的一种药物/因子控释薄膜支架，其特征在于：包括膜状仿生支架、血小板衍生因子涂层和缓释层；
血小板衍生因子涂层设置于膜状仿生支架的外侧；
缓释层设置于血小板衍生因子涂层的外侧；
其中，膜状仿生支架由对细胞成骨分化具有促进作用的药剂、牙骨质和牙周膜内含有的I型胶原(Col-I)、生物可降解聚合物或高分子材料的混合物，通过静电纺丝技术获得。
进一步地，本发明涉及的一种药物/因子控释薄膜支架料，还具有这样的特点：即、血小板衍生因子涂层和缓释层为多层结构。
进一步地，本发明涉及的一种药物/因子控释薄膜支架料，还具有这样的特点：即、该生物可降解高分子材料选自可降解人工合成聚酯类聚合物或天然生物可降解高分子材料中的一种或多种的混合物。
进一步地，本发明涉及的一种药物/因子控释薄膜支架料，还具有这样的特点：即、生物可降解聚合物或高分子材料选自聚己内酯、聚乳酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、改良壳聚糖中的一种或多种的混合物。
进一步地，本发明涉及的一种药物/因子控释薄膜支架料，还具有这样的特点：即、膜状仿生支架由辛伐他汀、Col-I、聚己内酯的混合物，通过静电纺丝技术获得。
进一步地，本发明还提供了上述药物/因子控释薄膜支架料的制备方法，其特征在于：通过静电纺丝技术制备膜状仿生支架材料后，通过层层自组装技术在膜状仿生支架材料表面负载血小板衍生因子涂层和缓释层(即、通过阻隔的方式起到缓释的效果)。
进一步地，本发明还提供了上述药物/因子控释薄膜支架料的制备方法，还具有这样的特点：即、具体工艺步骤如下所示：
步骤一、将对细胞成骨分化具有促进作用的药剂、牙骨质和牙周膜内含有的I型胶原、生物可降解聚合物或高分子材料混合搅拌至均匀的静电纺丝溶液；
步骤二、将静电纺丝溶液注入静电纺丝设备中，通过控制静电纺丝流量注射泵的流速在0.01-5ml/min，静电纺丝高压发生仪的电压在5-70KV范围内调节，控制空间温度10-85℃、湿度在20％以下，收集距离为5-55cm的载体上的膜状支架材料；
步骤三、将上述制备好的膜状支架材料浸入交联用溶液中，交联0.5-3小时，用醇和去离子水洗涤多次后，于惰性气体环境下干燥待用；
步骤四、配置各种包含有涂层和缓释层材料的溶液；
步骤五、按需，将膜状支架材料在各种溶液中分别浸涂5-30分钟，每次浸涂后用去离子水洗涤至少一次。
进一步地，本发明还提供了上述药物/因子控释薄膜支架料的制备方法，还具有这样的特点：即、上述牙骨质和牙周膜内含有的I型胶原的用量参照正常人牙周膜中所含该物质的比例；
该I型胶原的用量占支架材料的质量百分比含量为10-60％，优选为40-50％；
上述对细胞成骨分化具有促进作用的药剂的添加量为所述牙骨质和牙周膜内含有的I型胶原的添加量的1-10％；即、该药剂的添加量为支架材料总质量的0.001-0.6％，优选为0.04-0.5％；
余量为生物可降解聚合物或高分子材料。
进一步地，本发明还提供了上述药物/因子控释薄膜支架材料的制备方法，还具有这样的特点：即、上述牙骨质和牙周膜内含有的I型胶原、生物可降解聚合物或高分子材料的质量比为3-1:10-0.5；优选地，该比例为3:7-1:1。
上述对细胞成骨分化具有促进作用的药剂的添加量为牙骨质和牙周膜内含有的I型胶原及生物可降解聚合物或高分子材料的质量总和的0.1-5％，优选为0.1-1％。
进一步地，本发明还提供了上述药物/因子控释薄膜支架料的制备方法，还具有这样的特点：即、在步骤一中，将对细胞成骨分化具有促进作用的药剂、牙骨质和牙周膜内含有的I型胶原、生物可降解聚合物或高分子材料溶解于有机溶剂后形成静电纺丝溶液；
其中，上述有机溶剂选自N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、四氢呋喃、乙醇、甲醇、丙酮、二氯甲烷、氯仿、丙酮、二乙醇二甲醚、乙酸乙酯、乙酸甲酯、二甲基亚砜等等溶剂、六氟异丙醇等常规可用于静电纺丝技术的有机溶剂；
上述静电纺丝溶液中各溶质总和的质量浓度为5-15％。
进一步地，本发明还提供了上述药物/因子控释薄膜支架料的制备方法，还具有这样的特点：即、上述静电纺丝流量注射泵的流速优选为0.1-1ml/min；
上述静电纺丝高压发生仪的电压优选为5-35KV；
上述空间温度优选为25-35℃；
上述载体优选为方形铝箔；
上述收集距离优选为10-35cm；
上述交联用溶液优选为1-10％的EDC水溶液；
上述包含有涂层材料的溶液选自浓度为1-5mg/ml聚苯乙烯磺酸(PSS)溶液、浓度为1-5mg/ml聚烯丙基胺盐酸盐(PAH)溶液、浓度为0.1-1mg/ml海藻酸钠(ALG)溶液、浓度为0.1-1mg/ml胶原(COL)溶液，浓度为0.01-10ug/ml的涂层因子溶液(如：血小板生长因子等)；
其中，上述涂层因子溶液为生长因子分散在含有0.1-0.5％人血清白蛋白、浓度为1-4mM的盐酸溶液中；
上述聚苯乙烯磺酸(PSS)、聚烯丙基胺盐酸盐(PAH)、海藻酸钠(ALG)溶液、胶原(COL)溶液中氯化钠的含量为0.1-0.5M，并调整pH值至6.5。
本发明的作用和效果：
本发明通过静电纺丝技术制备含有药物的膜状支架材料，将静电纺丝作为一种良好缓释药物的载体；通过层层自组装技术，在支架材料表面修饰因子纳米涂层和缓释层实现因子的缓释，以期通过因子表层-药物芯层的膜状支架材料的结构，实现因子和药物的序贯缓释。
具体地，在本发明的研究中，通过对新型的膜状支架材料的构建，旨在促进牙周膜干细胞成骨分化。一般来说，间充质干细胞成骨分化分为三个阶段，细胞增殖、胞外基质分泌和胞外基质矿化。因子能够促进间充质干细胞的增殖和迁移，在成骨分化的早期阶段，这有利于促进种子细胞的有丝分裂、增殖和迁移。药物能够上调牙周膜干细胞碱性磷酸酶表达，在成骨分化后期，促进胞外基质矿化。本发明通过研究成骨分化的不同阶段的特点，从而采用因子-药物序贯释放的方式来实现促进牙周膜干细胞的增殖和胞外基质矿化，促进成骨分化的效果。
此外，在本发明的研究中发现，如将多种药物/因子加载于整个支架材料的不同部位，能够实现不同活性因子和药物的序贯释放。故而，在本发明中，采用构建因子表层-药物芯层的膜状支架材料，除了材料降解时按照先表层后芯层实现序贯释放，还可以通过分别调整表层和/或芯层选用的各材料之间比例来实现对降解速率的控释，从而使得药物在缓释的过程中，变得更为可控和进行局部调整。
此外，在本发明的优选方案中，通过层层自组装技术构建的[PSS/PAH]/[COL/ALG]n自组装涂层，能够显著改善本发明制造的静电纺丝支架材料的亲水性，促进人牙周膜细胞在支架材料上的黏附、增殖。同时通过对n的层数的调整，来进一步调整其缓释的浓度和速度。
此外，在本发明的优选方案中，还可通过调控材料表面因子负载的层数来进一步实现控释的效果。
此外，在本发明的优选方案中，选用聚已内酯(PCL)作为芯材的材料之一，该材料是一种半结晶性的脂肪族聚酯，在生物体内降解速率较低，能够避免因材料快速降解产生的酸性产物堆积及局部无菌性炎症反应，因此选用该材料进行基础支架的制造。
此外，在本发明的优选方案中，选用了辛伐他汀作为芯材的主材之一，该药物对细胞成骨分化的促进作用的同时还具有改善血管内皮功能、抗炎和抗氧化作用，在本发明的研究中发现，低浓度辛伐他汀即能够上调骨髓间充质干细胞和牙周膜干细胞中骨形成蛋白-2(bone morphogenetic protein,BMP-2)的表达，促进成骨分化。
此外，在本发明的研究中发现含有PCL的静电纺丝支架，其亲水性欠佳，将会影响牙周膜干细胞的黏附效率，故而，在本发明的基础支架中，还加入了I型胶原，用于改进材料的机械性能，并有利于间充质干细胞的黏附和增殖。即、改善支架材料的亲水性的同时，进一步调节SMV低浓度缓释效果。
附图说明
图1、控释PDGF/SMV的膜状支架材料的构建示意图。
具体实施方式
如图1所示，为了获得一种PDGF/SMV能实现序贯缓释的支架，具体构建方法如下所示：
实施例一、
步骤一、采用静电纺丝技术，制备SMV/Col-I/PCL膜状仿生支架材料。
参照正常人牙周膜中所含Col-I比例，以Col-I、PCL为主要原料并加入适量SMV，其中，SMV的添加量为Col-I质量的15％(或为1％，5％，10％；25％等不同添加量)，其他为PCL；将上述材料混合后，加入三氯甲烷(或不采用任何有机溶剂)后，置于磁力搅拌器上搅拌至溶液呈无色透明黏稠状的纺丝溶液，溶液的质量浓度为6％(或为15％、20％、35％；45％等不同的浓度)。
控制静电纺丝流量注射泵的流速在(0.01-0.02ml/min)，静电纺丝高压发生仪的电压在(5-15KV)范围内调节，控制空间温度30-35℃、湿度20％以下，将其收集在方形铝箔上，收集距离在10-15cm之间。
步骤二、采用层层自组装技术，在SMV/Col-I/PCL膜状支架材料表面负载PDGF控释纳米涂层。
将上述膜状支架材料浸入5％EDC水溶液中，室温下交联1小时，用乙醇和去离子水洗涤多次后，氮气干燥待用。
配制浓度为1mg/mlPAH和PAA聚电解质溶液，溶液中NaCl含量为0.15M。将PDGF重新分散在含有0.1％人血清白蛋白浓度为4mM的HCl溶液中，浓度为10ug/ml。
静电纺丝薄膜在上述每种溶液中浸涂时间为10分钟，每次浸涂后用去离子水洗涤2-3次。具体涂覆层数和顺序可以根据实验要求进行调节，形成PDGF表层/SMV芯层的膜状支架材料。
实施例二、
步骤一、采用静电纺丝技术，制备SMV/Col-I/PCL膜状仿生支架材料。
以Col-I、PCL为主要原料并加入适量SMV，其中，Col-I、PCL的质量比为1:1(或为1:0.01；1:0.1；1:0.5；1:2；1:5；1:10；1:100等不同比例)，SMV的添加量为Col-I和PCL总质量的25％(或为1％，5％，10％；35％；55％等不同添加量)；混合后，加入丙酮(或不采用任何有机溶剂)置于磁力搅拌器上搅拌至溶液呈无色透明黏稠状的纺丝溶液，该溶液中溶质总和的质量百分比浓度为11％(或为5％、20％、35％；45％等不同的浓度)。
控制静电纺丝流量注射泵的流速在(0.01-0.02ml/min)，静电纺丝高压发生仪的电压在(5-15KV)范围内调节，控制空间温度30-35℃、湿度20％以下，将其收集在方形铝箔上，收集距离在10-15cm之间。
步骤二、采用层层自组装技术，在SMV/Col-Ⅰ/PCL膜状支架材料表面负载PDGF(血小板生长因子)控释纳米涂层。
将上述膜状支架材料浸入8％EDC水溶液中，室温下交联0.5小时，用乙醇和去离子水洗涤多次后，氮气干燥待用。
配制浓度为1mg/mlPAH和PAA聚电解质溶液，溶液中NaCl含量为0.15M。将BMP-2重新分散在含有0.1％人血清白蛋白浓度为4mM的HCl溶液中，浓度为10ug/ml。
静电纺丝薄膜在上述每种溶液中交叠浸涂5次，每次8分钟，每次浸涂后用去离子水洗涤2-3次，形成PDGF表层/SMV芯层的膜状支架材料。
作为上述实施例的变形例：
可将SMV替换为其他对细胞成骨分化具有促进作用的药剂；
可将PCL替换为聚乳酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、改良壳聚糖、或胶原，或为其混合物，如：为PCL与聚乳酸-羟基乙酸共聚物质量比为1:0.1的混合物，或PCL与胶原质量比为1:1的混合物等等。