本发明涉及半边莲生物碱在制备抗血管生成类疾病药物中的应用，属于医药
技术领域：
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背景技术：
：动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)斑块破裂所引发的冠心病和卒中已超过癌症，成为中国死亡率最高的疾病。研究发现AS斑块中血管生成是决定斑块生长、易损、破裂的重要因素。发生了粥样斑块的血管内膜变厚、距离增加，导致局部缺血、缺氧。斑块内血管生成刺激炎性细胞的渗出和粘附分子的表达，并且易于破裂出血，使斑块不稳定性增加。“血管生成”是在原有血管结构基础上产生新血管的过程，即血管内皮细胞增殖、迁移，进而形成新的血管腔。在胚胎发育、伤口愈合和月经周期中发挥重要作用。异常的血管生成与动脉粥样硬化、糖尿病、肿瘤、类风湿关节炎等密切相关。抗血管生成治疗虽已投入临床应用，但在AS方面进展甚小，因此发展选择性高、耐受性好、副作用少的血管生成抑制剂成为防治AS斑块破裂的趋势。半边莲又名急解索、蛇舌草，为桔梗科植物半边莲LobeliachinensisLour.的带根全草。始载于《滇南本草》，后李时珍在《本草纲目》中亦有记载。主产于安徽、江苏、四川、浙江等地，性味辛平，有清热解毒、活血祛疲、利尿消肿、抗炎抗肿瘤的功效，临床上用于治疗水肿、痈肿疔拖、蛇虫咬伤、晚期血吸虫病腹水、跌打损伤和癌症等。该属植物中主要含有生物碱类、多炔类、黄酮苷类、氨基酸类等成分，其中生物碱类成分为特征成分，多具有中枢兴奋、呼吸兴奋等药理作用。半边莲全草含生物碱、黄酮甙、皂甙、氨基酸。生物碱中主要为山梗菜碱(Lobeline)、山梗菜酮碱(Lobelanine)、山梗菜醇碱(Lobelanidine)、异山梗菜酮碱(Isolobela-nine即去甲山梗菜酮碱)等。目前报道的半边莲生物碱的提取是法主要有醇提法、复合酶超声波法、索氏提取法，CN104758356A中提供了一种半边莲生物碱的醇提法，半边莲生物碱的复合酶超声波提取法参见黄秀香，复合酶超声波法提取半边莲生物碱的工艺研究，《安徽农业科学》2012年第24期。索氏提取器回流提取法参见粟君等，半边莲生物碱的提取及其对胃癌细胞的抑制作用，西华师范大学学报(自然科学版)，2007年04期。日本学者发现多炔类成分对肿瘤细胞具有显著的细胞毒性，但迄今为止尚未有关于半边莲生物碱可以抑制血管生成的报道，或者通过抑制血管生成而发挥稳定AS斑块作用的研究。技术实现要素：本发明针对现有技术的不足，提供一种半边莲生物碱的新用途，即半边莲生物碱在制备抗血管生成类疾病药物中的应用。本发明技术方案如下：半边莲生物碱在制备抗血管生成类疾病药物中的应用。所述半边莲生物碱是由半边莲带根全草提取分离得到的提取物。根据本发明优选的，所述半边莲生物碱的纯度不低于30％。根据本发明优选的，所述的应用中的血管生成类疾病为肿瘤、动脉粥样硬化、关节炎、皮肤及眼科疾病、血管性痴呆或子宫内膜异位症。根据本发明优选的，所述的应用中的血管生成是动脉粥样硬化斑块内的血管生成。根据本发明半边莲生物碱在制备抗血管生成类疾病药物中的应用，其中，所述药物的剂型为临床上或药学上可接受的任一剂型。优选的，所述药物的剂型为粉剂、注射液、胶囊、口服液。本发明所述的半边莲生物碱的提取方法可按现有技术中任一种方法从半边莲带根全草中提取、分离或/和必要的纯化。根据本发明优选的，所述的半边莲生物碱的提取方法，包括步骤如下：将盛有3kg半边莲(带根全草)的纱布袋放入提取器中，加入质量浓度90-95％的乙醇，使其没过纱布袋3-5cm；置于密闭提取器中加热2-3h使药物成分进入乙醇成为药物醇提液；在真空浓缩机组中加热药物醇提液2-3h，使乙醇蒸发、药液浓缩得半边莲提取液，气态的乙醇经低温管道变为液态回收再用，重复提取3-4次；将半边莲提取液分次置于旋转蒸发器中加热20-30min，使其浓缩成膏；加入质量浓度3％HCl酸化溶解至pH值为3-4后，放入分液漏斗加乙醚萃取，上层经蒸馏回收乙醚后分离出有机酸；下层加入氨水或碳酸钠碱化至pH值为10-11；用氯仿萃取，蒸馏回收氯仿后得到半边莲生物碱。以上所得半边莲生物碱继续进行层析柱提纯，可得纯度大于50％的半边莲生物碱。有益效果本发明为半边莲生物碱提供了新的药用价值，本发明经过体内外实验结果显示，半边莲生物碱可抑制动脉粥样硬化斑块内血管生成从而稳定斑块，能够显著抑制斑马鱼的血管生成，可抑制血管内皮细胞的增殖、迁移及体外成环，其机制可能和p38MAPK蛋白有关。实验结果说明半边莲生物碱具有抗血管生成活性，可作为血管生成抑制剂使用，为临床上防治动脉粥样硬化斑块破裂等相关疾病提供了新的治疗手段，也可应用于制备治疗肿瘤、关节炎、皮肤及眼科疾病、血管性痴呆、子宫内膜异位症等血管生成依赖性和血管生成相关性疾病的药物。附图说明图1是药物干预12w后各组小鼠血脂变化图；纵坐标为各组小鼠的血脂含量(单位：mmol/L)。图2是干预12w后各组主动脉根部HE染色图。图3是12w后主动脉根部巨噬细胞、天狼猩红、actin和油红O染色图。图4是药物干预12w后主动脉根部斑块易损指数图；纵坐标为各组小鼠主动脉根部斑块的易损指数(单位：％)。图5是药物干预12w后对动脉粥样硬化斑块内新生血管形成的影响图。图6是药物干预12w后对动脉粥样硬化斑块内P38,Phospho-p38和CD34蛋白表达的影响图。图7是各药物组对斑马鱼躯干部位节间血管生成的影响图。图8是各药物组对HUVEC增殖的影响图；纵坐标为各组细胞的存活率(单位：％)。图9是各药物组对HUVEC迁移的影响图。图10是各药物组对HUVEC管腔形成的影响图。图11是各药物组对p38和Phospho-p38蛋白表达的影响图。具体实施方式下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。实施例1：半边莲生物碱的制备半边莲中药(带根全草)产自广东省，购于济南建联药材公司。本实施例提取半边莲生物碱，供实验研究。将盛有半边莲3kg的纱布袋放入提取器中，加入95％乙醇，使其没过纱布袋3cm。置于密闭提取器加热2h使药物成分进入乙醇成为药物醇提液。在真空浓缩机组中加热药物醇提液2h，使乙醇蒸发、药液浓缩，气态的乙醇经低温管道变为液态回收再用，重复提取3次。半边莲提取液分次置于旋转蒸发器中加热20min，使其浓缩成膏。加入3％HCl酸化溶解至pH值为3-4后，放入分液漏斗加乙醚萃取，上层经蒸馏回收乙醚后分离出有机酸；下层加入氨水或碳酸钠碱化至pH值为10-11；用氯仿萃取，蒸馏回收氯仿后得到半边莲生物碱(LobeliaChinensisLourAlkaloids,LCLA)。将半边莲生物碱加热蒸发至无流动液体，加入硅胶搅拌均匀，并放入烘干箱内低温干燥成粉状。层析柱内先加入氯仿，再置入溶于氯仿的硅胶形成硅胶柱，待硅胶柱沉降后加上样品，并再次用硅胶覆盖。先以纯氯仿对硅胶柱进行洗脱，然后在氯仿中逐渐增加甲醇比例，形成极性从小到大的洗脱顺序。将洗脱液300mL一份蒸馏回收溶剂，所得生物碱及时转移且分为多个部分，薄层层析、用碘化铋钾显色，将显示橙红色色谱的生物碱组分合并，即得到较纯的半边莲生物碱。半边莲生物碱的纯度约为50％。实施例2：半边莲生物碱对高脂饲养的apoE-/-小鼠血脂和体重的影响1.实验动物：高脂饲养的apoE-/-小鼠2.材料与样品：实施例1所提取的LCLA先用DMSO溶解，再用PBS溶解配成相应浓度低、中、高剂量组，现配现用。3.实验方法：(1)实验分组：ApoE-/-小鼠给予高脂饮食，并随机分为以下几组：①PBS组：每天插胃管灌服PBS0.5mL；②半边莲生物碱高剂量组：每天插胃管灌服LCLA40mg/kg；③半边莲生物碱中剂量组：每天插胃管灌服LCLA20mg/kg；④半边莲生物碱低剂量组：每天插胃管灌服LCLA10mg/kg；⑤辛伐他汀组：每天插胃管灌服Simvastatin50mg/kg；给药12周后小鼠称重、处死，检测各组小鼠体重、血脂成分含量(TC、TG、HDL-C、LDL-C)；4.实验结果：(1)如表1所示，高脂饲养12周后，LCLA各浓度组与PBS对照组小鼠体重无显著统计学差异，而辛伐他汀组体重略高于PBS对照组，具统计学差异。(p＜0.05vs.PBS)表1.药物干预12w后各组小鼠体重变化组别第12周(g)PBS组27.03±3.28LCLA10mg/kg/d28.07±4.41LCLA20mg/kg/d27.70±4.33LCLA40mg/kg/d27.11±5.26Sim50mg/kg/d29.9±7.35*(2)如图1所示，高脂饲养12周后，LCLA各浓度组与PBS对照组小鼠血清TC,TG,HDL-C,LDL-C无显著性差异，Sim组小鼠血清TC,HDL-C水平显著增高(p＜0.05vs.PBS)，血清TG，LDL-C与PBS对照组相比无显著统计学差异。此结果表明，LCLA并不降低高脂饲养的apoE-/-小鼠的体重和高脂水平。实施例3：半边莲生物碱对高脂饲养的apoE-/-小鼠主动脉根部斑块稳定性的影响1.实验动物及实验分组同实施例2。2.实验方法：给药12周后小鼠处死，迅速打开胸腔，左心室逆行灌注液体至主动脉，钝性分离主动脉，主动脉根部置于多聚甲醛浸泡溶液中固定，备做病理标本，其余主动脉部分-80°保存，待做分子生物学检测。(1)HE染色：主动脉根部固定后，流水冲洗去多聚甲醛并用OCT包埋、切片，进行HE染色观察斑块形态与大小、纤维帽的完整性和基底膜弹力纤维断裂等情况。(2)其他特殊染色：挑选斑块负荷最大处邻近切片进行油红O染色(观察斑块内脂质含量)，苦味酸-天狼猩红染色和Masson染色(观察斑块内胶原纤维含量和类型)，免疫组化染色(观察斑块中平滑肌细胞和巨噬细胞的含量)。计算上述各斑块易损指数：(巨噬细胞含量+脂质含量)/(胶原含量+平滑肌细胞含量)，评价各干预组小鼠颈动脉斑块易损性特征。3.实验结果：(1)HE染色：各组小鼠主动脉壁均有明显斑块形成，与对照组相比，LCLA和Sim干预组斑块表面相对光滑，内皮细胞连续。见图2.(2)其他特殊染色：PBS组小鼠斑块内见大量红染的脂质沉积、巨噬细胞表达增强，各药物治疗组斑块内脂质含量低于模型组，黄色或红色的胶原增多，平滑肌细胞染色增强。分别计算各组的易损指数发现：LCLA和sim均可以稳定AS斑块(p＜0.01vs.PBS)，随LCLA浓度的增加，AS斑块越趋于稳定。实验结果见图3，图4。此结果表明，LCLA和辛伐他汀均具有稳定高脂饲养的apoE-/-小鼠斑块的作用，此作用随着LCLA浓度的增加而增强。实施例4：半边莲生物碱对动脉粥样硬化斑块内新生血管形成的影响1.实验动物及实验分组同实施例2。2.术语解释：Phospho-p38：磷酸化P38蛋白。3.实验方法：(1)主动脉根部免疫组化染色：CD34是一种特异性白细胞分化抗原，特异性表达于血管内皮细胞，应用抗体进行免疫组化染色，观察各实验组主动脉根部血管新生的程度。(2)主动脉组织westernblot检测：新生血管形成是一个动态的、多步骤的过程，其中P38MAPK的磷酸化与内皮细胞迁移密切相关，在血管新生过程中发挥重要作用。去除根部以外主动脉的其他部分采用westernblot方法检测P38MAPK信号通路总P38，Phospho-p38和CD34蛋白的表达情况，分析实验组对斑块内新生血管的影响。4.实验结果：图5免疫组化结果显示：CD34阳性表达为胞浆内的棕黄色颗粒，与PBS组相比，LCLA各剂量组和辛伐他汀组阳性表达率不同程度减少，说明药物处理组斑块内新生血管减少。图6Westernblot结果显示：与PBS组相比，LCLA各剂量组和辛伐他汀组总P38的蛋白表达量不变但磷酸化的P38和CD34蛋白表达降低，差异具有统计学意义(P<0.05，P<0.01vs.PBS)，且LCLA的效果呈剂量依赖性。此结果表明，LCLA和辛伐他汀均可抑制AS斑块内P38的磷酸化，减少斑块内微血管数量，此作用随着LCLA浓度的增加而增强。实施例5：半边莲生物碱抑制斑马鱼躯干部位节间血管生成1.实验动物：血管特异性表达绿色荧光蛋白(VEGFR2:GFP)的转基因斑马鱼。显微镜下挑选正常发育18hpf的斑马鱼胚胎，浸入1mg/mL胰蛋白酶脱模，剔除受损胚胎，培养于96孔板，每孔5条。2.材料与样品：实施例1所提取的半边莲生物碱，先用DMSO溶解，再用PBS溶解配成相应浓度低、中、高剂量组，现配现用。3.实验方法：实验以抗血管生成药物SU5416作为阳性对照。SU5416是一种小分子药物，可以直接通过渗透到达斑马鱼胚胎内。(1)实验分组：A.对照组：B.DMSO组：含0.1％DMSO的培养液；C.LCLA高剂量组：含6％LCLA的培养液；D.LCLA中剂量组：含3％LCLA的培养液；E.LCLA低剂量组：含1.5％LCLA的培养液；F.阳性对照药SU5416组：含10μM的SU5416；(2)观察斑马鱼血管生成情况：施药后48h，在倒置显微镜下观察，对斑马鱼体节血管进行计数。4.实验结果：如图7所示：正常对照组和DMSO组的斑马鱼节间血管生成良好，无缺失，无断裂，荧光强。各浓度组LCLA和阳性对照药SU5416组均出现节间血管数目减少，血管出现明显缺失、断裂现象。此结果表明，LCLA和SU5416均具有抑制斑马鱼血管生成的作用，LCLA抑制血管生成的作用具有剂量依赖性。实施例6：半边莲生物碱体外抗细胞增殖作用的研究实验1.实验细胞：人脐静脉内皮细胞株(HUVEC)2.材料与样品：实施例1所提取的半边莲生物碱，先用DMSO溶解，再用PBS溶解配成相应浓度低、中、高剂量组，现配现用。3.实验方法：(1)实验分组：于对数生长期的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)接种于96孔板中，接种密度约为每孔5000个细胞。接种24h后，血清饥饿12h使细胞同步化与G0/G1期。分为：①对照组；②LCLA高剂量(50μg/mL)组；③LCLA中剂量(25μg/mL)组；④LCLA低剂量(10μg/mL)组；⑤辛伐他汀组(Sim)：10μmol/L；(2)细胞存活率计算：继续培养48h后，每孔加入CCK-8溶液10ul，酶标仪450nm波长处读取OD值并记录结果，计算细胞存活率。细胞存活率＝(实验组细胞OD值-空白组细胞OD值)/(对照组细胞OD值-空白组细胞OD值)×100％。4.实验结果：如图8所示，LCLA和辛伐他汀均能显著抑制HUVEC的细胞数目，随着药物浓度的增高，细胞数目逐渐减少(p＜0.05，p＜0.01vs.PBS)。说明LCLA具有抑制HUVEC增殖的作用，且此抑制作用呈剂量依赖性。实施例7：半边莲生物碱抑制人脐静脉内皮细胞迁移实验1.实验细胞，材料和样品：同实施例6。2.实验方法：(1)实验分组：于对数生长期的HUVEC接种于96孔板中，接种密度约为每孔5000个细胞。接种24h后，血清饥饿12h使细胞同步化与G0/G1期。分为：①对照组；②LCLA高剂量(50μg/mL)组；③LCLA中剂量(25μg/mL)组；④LCLA低剂量(10μg/mL)组；⑤P38MAPK拮抗剂SB203850(10μM)组；继续培养12h，弃去培养基，PBS洗3次，显微镜下观察实验结果。3.实验结果：如图9所示，LCLA组和SB203850组划痕区域减少，具有显著统计学差异(p＜0.01vs.PBS)。此抑制作用具有剂量依赖性，随着半边莲生物碱浓度的升高，HUVEC的迁移率逐渐降低。此结果表明，LCLA和p38MAPK拮抗剂SB203850具有抑制血管内皮细胞迁移的作用，此作用具有剂量依赖性。实施例8：半边莲生物碱抑制人脐静脉内皮细胞管腔形成实验1.实验细胞：人脐静脉内皮细胞株(HUVEC)2.实验材料与分组同实施例6。3.实验方法：继续培养12h后，消化收集细胞，配置1.5×105/ml细胞悬液，按1.5×104个/孔接种于基质胶包被的96孔板，24h后拍照，通过软件分析小管长度及其分支相对定量比较各组成管能力，每组设置6个复孔，实验重复3次。4.实验结果：如图10所示，对照组中HUVEC在生长、聚集、融汇形成完整的三维管腔结构。与对照组相比，LCLA组和SB203850处理组的HUVEC的成管过程受到影响，形成的管腔结构零散，不完整。此结果说明LCLA和P38MAPK拮抗剂SB203850可以抑制HUVEC形成血管。实施例9：半边莲生物碱抑制血管生成的机制研究实验血管生成是一个多因素、多步骤的复杂过程，受各种信号分子和信号通路的调控，p38MAPK通路是丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activatedproteinkinase,MAPK)重要的亚族，诱导肌动蛋白细胞骨架重排调节细胞迁移，在血管新生发挥重要调节作用。SB203850可竞争结合P38的ATP结合位点，抑制P38MAPK磷酸化，但不降低p38MAPK的表达。1.实验对象、实验材料及实验分组同实施例6。2.实验方法：对照组及药物处理组培养24h后提取蛋白，Westernblot分析P38MAPK信号通路蛋白总P38，磷酸化P38蛋白水平变化。3.实验结果：结果如图11所示，各浓度组LCLA和SB203850均能显著下调HUVECPhospho-P38的表达，其效应具有浓度依赖性。综上，本发明经体内外实验结果显示，半边莲生物碱可抑制血管内皮细胞的迁移，从而抑制斑马鱼和AS斑块内的血管生成，对于稳定AS斑块发挥重要作用，LCLA通过P38MAPK信号通路与斑块内新生血管形成相关性提供了理论基础，也为未来预防和治疗AS血管新生，冠心病及ACS提供了新思路，提供了新的靶点。不仅如此，LCLA通过抑制P38MAPK信号通路可能在其他血管新生相关性疾病如癌症，眼部疾病中起着重要作用，为其治疗提供了理论依据。以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，本发明创造并不限于所述实施例，悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可作出种种的等同的变型或替换，些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。当前第1页1 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