本发明涉及疫苗，其用于减少猪中与胞内劳森氏菌(lawsoniaintracellularis)的亚临床感染有关的胞内劳森氏菌细菌脱落的方法中。
背景技术：
：增殖性肠病变(也被称作回肠炎)是全世界断奶后猪的一种常见肠病，其由专性细胞内细菌胞内劳森氏菌造成。特征性病变是回肠肠隐窝中的未成熟肠细胞的增殖；这些细胞经常在它们的顶细胞质内含有致病细菌。在尸体剖检时，通过1.5-2.5µm长的弧菌状细菌的可视化(特别是在肠细胞中，但是也经常在位于隐窝之间的固有层中的巨噬细胞内，和在肠系膜淋巴结中)，可以证实组织学病变为劳森氏菌阳性的。所述细菌从肠细胞的清除导致有关的增殖性病变的消退，从而指示所述细菌对隐窝的直接局部作用(mcorist等人,developedandresolvinglesionsinporcineproliferativeenteropathy:possiblepathogeneticmechanisms,journalofcomparativepathology,115,1996,第35-45页)。在显现疾病(即表现出腹泻或异常的红黑色焦油状粪便，可能导致死亡)的动物中和在仅显现亚临床感染(没有表现出腹泻或异常粪便)的动物中，已经使用pcr证实了胞内劳森氏菌在这些病变中的存在。临床病例经常存在于生长-育成(grower-finisher)阶段；在某些较老的育成猪中，已经记录了急性出血形式。以前已经研究了胞内劳森氏菌血清阳性猪与呈现临床或亚临床感染的猪的比例之间的关联(vanderheijden,prevalenceofexposureandinfectionoflawsoniaintracellularisamongslaughter-agepigs.,resvetsci,2004年12月,77(3),第197-202页)。看起来，有些猪可以是携带者，即被感染但没有呈现回肠炎的临床征象。特别是在欧洲，被认为没有患病的动物似乎具有亚临床感染，如通过在屠宰时细菌在肠中的残留所证实的。关于胞内劳森氏菌细菌在无临床疾病畜群中的存在的阳性结果的一种解释是，那些畜群具有在它们的育成组中移动的胞内劳森氏菌。仅仅在某些情形中，劳森氏菌感染导致临床问题，包括急性出血肠病变病例。在无临床疾病畜群中，针对劳森氏菌感染的疫苗接种是罕见的。但是，由于已知亚临床感染可能导致对猪的平均每日重量增加(adwg)的负面影响，所以一些生长-育成农场使用市场上的唯一商用的回肠炎疫苗，即enterisol®ileitis(可得自boehringeringelheim)，以抵抗肠中的局部感染。该疫苗含有活减毒的胞内劳森氏菌细菌并且口服地施用。实际上，目前据信，肠的局部感染仅可以通过诱导局部免疫来抵抗。这对于呈现临床疾病的动物是不同的。已经证实(wo2009/144088，转让给intervetinternationalbv)，通过全身接种非活疫苗可以成功地保护那些动物。不受限于理论，据信其原因是，那些动物具有将感染暴露于系统的严重胃肠病变，这可以解释为什么全身性免疫应答会帮助抵抗感染。但是，当仅存在亚临床感染(对应于肠的微小局部感染)时，认为需要局部免疫应答(包括iga和细胞免疫)来抵抗感染。因此，需要局部地施用的包含活细菌的疫苗。这在mikeroof的论文中得到证实，所述论文称作theresearchanddevelopmentofenterisol®ileitis，在europeanenterisol®ileitissymposium提出，2005年10月13-15日，西班牙巴塞罗那。其在第2页，表1.1中指出，尽管全身性地施用的灭活疫苗可能诱导“体液/全身免疫”，但是它不能诱导“粘膜免疫”和“细胞介导的免疫”。后两者通常已知是抵抗细胞内病原体对肠的局部感染所必需的(ivanroitt,essentialimmunology,第七版,1991年,第206页“thesecretoryimmunesystemprotectstheexternalmucosalsurfaces”,209“defenceisbycell-mediatedimmunity”和210“activatedmacrophageskillintracellularparasites”)。在mikeroof的2005年的论文中阐明，“寻找灭活的菌苗原型的早期研究证实…灭活的疫苗没有提供针对…肠的定殖的保护性应答”(第2页,左列，第二个完整段落)。活疫苗enterisol®ileitis实际上与减少与感染有关的重量增加损失的声明一起得到许可，并且被用于该目的。该疫苗的缺点是，它需要口服施用，这不是给猪接种疫苗的常规方式，并且人们必须中断抗微生物剂在动物中的应用6天(因为否则所述疫苗中的细菌可能被杀死)。另一个缺点是，所述疫苗没有被许可用于减少细菌脱落。显然，用于销售核准的数据没有显示细菌脱落的减少。新近的出版物(riber等人.vaccine33,2015,156-162)证实，enterisol®ileitis根本没有提供针对感染后劳森氏菌细菌脱落的保护。这可能指示，动物畜群中的胞内劳森氏菌感染可能保持，尽管所有动物被接种疫苗且重量增加问题和临床表现显著减轻。本发明的目的本发明的一个目的是提供一种改进的疫苗，其可以用于减少亚临床上感染的猪的胞内劳森氏菌细菌脱落。另一个目的是提供一种改进的疫苗，其另外提供降低的与所述亚临床感染有关的对adwg的负面影响。技术实现要素：为了满足本发明的主要目的，已经设计了在上文
技术领域：
部分中描述的药物组合物，其中该组合物包含非活胞内劳森氏菌抗原和药学上可接受的载体，且适合用于全身施用。令人惊奇地，尽管全身性地施用的非活劳森氏菌抗原(诸如在wo2009/144088中描述的不同类型的非活劳森氏菌抗原)通常被理解为不能诱导iga和细胞免疫，更不要提影响肠中的局部免疫应答，但是发现这样的组合物可以减少亚临床上感染的猪中的胞内劳森氏菌脱落，基本上或甚至完全地阻止所述脱落的发生。其原因不明。所述新组合物相对于本领域已知的活疫苗的优点是明显的：所述新组合物可以全身性地(例如肌肉内地或真皮内地)施用，且由于它仅包含非活劳森氏菌抗原，所以不需要中断抗微生物剂应用。定义疫苗是保护免于病原性微生物的疫苗接种后感染的组成物，即，典型地通过例如经由抗体干扰接种疫苗的宿主中的微生物本身，预防或减轻所述微生物的感染或由所述感染引起的病症的组成物。疫苗接种因而预防感染或至少降低感染的水平，和/或预防由该感染引起的病症或至少降低所述病症的水平。野生型细菌的非活抗原是要引起针对它的免疫学应答的除了活细菌本身以外的任意物质或化合物，作为该免疫应答的结果，使得相应的毒性细菌或一种或多种其毒力因子将会被宿主的免疫系统识别，并且至少部分地被中和。野生型细菌的非活抗原的典型例子是杀死的全细胞细菌、细菌的亚单位诸如表面表达的蛋白和毒素。后两者可以是或者不是重组地表达。对于胞内劳森氏菌，几种类型的非活抗原是本领域已知的，且例如从wo2009/144088(杀死的全细胞)、w02005/070958(亚单位)和wo97/20050(杀死的全细胞)已知。药学上可接受的载体是生物相容的介质，即在施用以后不在受试动物中诱导显著不良反应的介质，其能够在疫苗施用以后将抗原呈递给受试动物的免疫系统。这样的载体可以是含有水和/或任意其它生物相容的溶剂的液体，但是还可以是固体诸如通常用于得到冷冻干燥的疫苗(基于糖和/或蛋白)。胞内劳森氏菌的亚临床感染是几乎或完全无症状(没有征象或征状)的感染，尤其是没有表现出腹泻或异常粪便。亚临床上感染的动物因而是肠细菌胞内劳森氏菌的无症状携带者，但是可能与减少的重量增加有关。通过粪便或肠(后者是在屠宰以后)的微生物培养、或dna技术诸如其聚合酶链式反应，鉴别亚临床感染的存在。抗原的全身施用是指，施用所述抗原，使得它到达身体的循环系统(该系统包含心血管和淋巴系统)，从而影响身体整体，而不是特定部位诸如胃肠道。全身施用可以如下进行：例如将抗原施用进肌肉组织中(肌肉内)、真皮中(真皮内)、皮肤下面(皮下)、粘膜层下面(粘膜下)和静脉中(静脉内)。猪的育成阶段是其中猪是在约10周龄(具有大约25-30kg的重量)至约28周龄(具有约110-130kg的重量)之间的阶段。育成阶段是总生长期(即断奶(大约3周龄)至28周龄(即大多数猪被屠宰时的年龄)之间的阶段)的一部分。包含杀死的全细胞细菌作为抗原的组合物包含从杀死的活全细胞细菌的衍生出的抗原。这并不排除：细菌细胞在杀死过程中至少部分地破裂，或杀死的全细胞的提取物或匀浆物实际上作为抗原提供在本发明意义上的“包含杀死的全细胞细菌的疫苗”中。杀死的全细胞胞内劳森氏菌细菌例如从wo2009/144088和wo97/20050已知。实施方案在第一个实施方案中，所述方法用于预防细菌脱落。尽管全身施用，显示本疫苗甚至能够在超过90%、甚至高达99%的动物中预防感染。鉴于以下事实，这是非常惊人的：活疫苗enterisol®ileitis(其可以在肠中诱导局部免疫应答，且因而，应当经调整用于抵抗肠中的亚临床感染)甚至都不能仅仅减少劳森氏菌细菌的脱落。在下一个实施方案中，所述方法另外用于减少与胞内劳森氏菌的亚临床感染有关的对所述猪的平均每日重量增加(adwg)的负面影响。显示本疫苗能够积极地影响亚临床上受影响的猪的adwg。对于任何猪饲养者而言，这是一个非常重要的参数，即使是只有重量增加的小的正差异。在另一个实施方案中，所述疫苗仅施用一次。已经显示所述疫苗的单次施用是有效的。第二剂疫苗(通常在第一剂以后2-4周施用)可能改善免疫应答的水平。在另一个实施方案中，当所述猪是3-10日龄时，施用所述疫苗。通过在该幼龄给猪接种疫苗，可以提供早期保护，即在断奶后立即保护。在仍另一个实施方案中，所述非活胞内劳森氏菌抗原包含碳水化合物，其在活胞内劳森氏菌细菌中与这些细菌的外细胞膜结合。已经显示这些碳水化合物能够和升高特异性的抗-胞内劳森氏菌免疫应答(参见wo2009/144088)。在又另一个实施方案中，所述非活胞内劳森氏菌抗原是从包含杀死的胞内劳森氏菌细菌的组合物纯化出的抗原。通过纯化，可以从实际抗原除去非特异性的细菌物质，例如以便减少任何位点反应(如果存在的话)。在一个实际实施方案中，所述非活胞内劳森氏菌抗原是杀死的全细胞胞内劳森氏菌。实施例研究1研究1的设计所述研究在具有胞内劳森氏菌(li)感染的荷兰畜群中，在较老龄的育成猪和繁殖小母猪中进行。所述研究遵循随机化的、对照的和盲法的设计。将158只3-10日龄的小猪(它们中的大多数是3-5日龄)在窝内随机分配至试验或对照组。在接收时给试验组中的小猪接种在水包油乳剂中的灭活的劳森氏菌菌苗疫苗(参见wo2009/144088，实施例3)，并在三周后再次接种。对照组中的小猪在同日接受安慰剂注射(没有抗原的乳剂)。在研究动物中不允许对li有效的抗生素组药物治疗(例如泰乐菌素、林可霉素、硫姆林、四环素)。断奶以后，即在幼仔和育成阶段中，将试验和对照组的小猪保持在一起。此外，在幼仔和育肥阶段中，将非实验猪圈养在相同房间中，但是在与实验动物不同的围栏中。在每次疫苗接种以后4小时、1天、3天、1周和2周，针对局部和全身反应常规地检查小猪。在预期暴露于场地感染(filedinfection)的阶段中，以1周或2周间隔从所有猪采集粪便样品。每个治疗组，将10只动物的粪便样品合并和针对li细菌的存在通过qpcr(此后也称为“pcr”)进行分析。如果合并的粪便样品指示细菌的存在，那么单个地分析来自该集合的原始样品。一旦第一个样品变成阳性，就试验各个粪便样品。在第一次疫苗接种时，第一次疫苗接种以后10、16和21-23周，将所有动物称重。研究1的结果在研究过程中，如在粪便上的pcr数据证实的，劳森氏菌感染在畜群中传播(参见下文)。由于除了对照组中的一只动物以外，所有动物都不具有任何临床征状，该组受向(野生型)细菌的场地暴露引起的亚临床感染影响。粪便中的细菌负载在表1中给出了平均pcr-结果，在表2中给出了阳性动物的数目和li-dna的平均浓度。从第13周开始，在许多对照动物中，发现了来自li的dna。具有阳性粪便样品的对照动物的百分比从第一次疫苗接种以后12周时的0经由在第13-15周时的2-8%逐渐增加至在第16-18周时的约18%，此后它在第20周以后下降至0%。表1：粪便中li的脱落(qpcr)在试验(疫苗)组中，仅在一个收集日，在单只动物中发现了单个pcr阳性粪便样品(72只猪中的1只是阳性的，即1.4%)。在对照组中，75只动物中的31只具有至少一个pcr阳性粪便样品(41.3%)。所述组之间的差异是统计上显著的(fisher氏精确检验:p-值<0.001)。表2：具有li阳性样品的动物的数目(和百分比)和阳性粪便样品中li的平均浓度，按疫苗接种组和第一次疫苗接种以后的周数。体重增加体重和平均每日重量增加总结在下面表3和4中。认为adwg是一个有关的参数，其经常用于测量劳森氏菌疫苗的效力。但是，该参数是非特异性的，因为它受几种不同条件(继发感染、气候、饲养等)影响。在25克/天的adwg差异得到统计显著(p<0.05)值的初步计算样品大小需要是每组约300只动物。由于效率原因，使实际上使用的组要小得多。在该初步研究中，组大小仅为78和80只动物。所以即使adwg的差异是约25克/天，估计得到的p值在任何情况下都大于0.05。表3：平均体重(kg,±sd)，按疫苗接种组和阶段对照疫苗接收(3-10天)1.4±0.3(n=76)1.5±0.3(n=80)在转至育成时(10周)27.7±4.8(n=74)28.5±4.1(n=73)第三次称重(±16周龄)64.0±9.2(n=73)65.6±9.1(n=71)最后一次称重(18-24周龄)89.4±16.8(n=72)92.3±17.0(n=71)如预期的，在育成阶段中平均每日重量增加的治疗组对比(参见下文)没有导致统计上显著的差异(p-值0.2042)。如果针对基线值校正，接种疫苗的组显示在育成阶段中比对照组高出平均21.4克/天的每日重量增加，其中90%置信区间在低6.4克/天到高49.2克/天的范围内。21.4克/天的平均差异本身是adwg的实质差异。两个组的平均每日重量增加的最小二乘法平均值(lsm)是881克/天(对于接种疫苗的组)和860克/天(对于对照组)。这些lsm确实符合通过ancova进行的组对比，但是稍微不同于来自表3的普通平均值，因为它们针对组之间的协变量‘在疫苗接种时的重量’的小差异进行了校正。表4：按克计的平均每日重量增加平均值*,按疫苗接种组和阶段*:针对在接收时的窝、批和重量调整过的平均adwg±平均值的标准误差(sem)和90%置信区间。对总平均每日重量增加的治疗效应的p-值是0.2804。如果针对基线值校正，接种疫苗的组表现出比对照组高12.5g/天的平均每日重量增加。该估计的90%置信区间范围为从在接种疫苗的组中比在对照组中低6.6g/天的生长到在接种疫苗的组中比在对照组中高31.5g/天的生长。研究2研究2的设计该研究的目的是评估在场地条件下，在育成猪中，与在第一研究中使用的相同疫苗，但是作为一次注射疫苗(oneshotvaccine)的效力。所述研究作为随机化的、盲法的、盐水对照的临床效力试验进行。将约750只3-4-周龄小猪在窝内随机地分配至试验组或对照组。给试验组中的小猪在肌肉内接种2ml疫苗一次，并且给对照组的小猪注射2ml盐水。在10(±1)周龄时，将648只研究小猪(来自每个处理组324只)运输至育成农场。此后，将对照猪圈养在相同单元中与接种疫苗的猪分开的围栏中(8个围栏的8-11只动物/处理组/单元)直到屠宰(在25周龄时)。评估的第一个参数是在不同称重之间的猪的平均每日重量增加(adwg)：在接收时，转移至育成农场以后和即将屠宰之前。评估的第二个参数是劳森氏菌脱落：转移至育成农场以后，在15和20周龄和即将屠宰之前。研究2的结果在该第二个研究中，如在粪便上的pcr数据证实的，劳森氏菌感染在畜群中传播。只有对照组中的一只动物具有轻微的临床征状(证实了是劳森氏菌感染的结果，如尸检以后确定的)。因而可以证实，该组受向(野生型)细菌的场地暴露引起的亚临床感染影响。在表5中指出了对adwg的影响。可以看出，在幼仔阶段中的平均每日重量增加在试验组中为319克/天，且在对照组中为307克/天。在幼仔阶段中的平均每日重量增加(adwg)的差异在对照和试验组之间是显著不同的(anova:p=0.0203)。在育成阶段中的adwg和总adwg在试验组中也较高。尽管对照和试验组之间7克/天的差异是商业上相关的(导致大约1.4kg的最终重量的差异)，它们不是统计上显著的。表5：平均每日重量增加(g/天)，按疫苗接种组和阶段对照组试验组幼仔307a319b育成764c771d总计633e640fab混合模型ancova,p=0.0203cd混合模型ancova,p=0.6356ef混合模型ancova,p=0.4229。关于劳森氏菌脱落，显示在研究第6周，所有粪便样品都是胞内劳森氏菌阴性的。在第11周，7个来自对照组的样品(19%)是阳性的，且试验组中的样品没有阳性的。在第16周，7个来自对照组的样品(19%)是阳性的，且试验组中的一个样品是阳性的。在第21周，所有动物再次都是阴性的。与对照组相比，试验组在研究过程中具有pcr劳森氏菌阳性粪便样品(对于1或2个连续周)的围栏的数目显著更低(fisher精确检验，p<0.001)。研究3研究3的设计该研究的主要目的是，进一步评估在场地条件下，在以前研究中使用的疫苗在一剂或两剂疫苗接种方案以后对细菌脱落的效力。根据随机化的和盲法的设计，对在它的畜群中具有劳森氏菌感染的个体农场进行所述研究。将健康的3-10日龄哺乳期小猪在窝内随机分配至两个试验组或对照组之一(320只动物/组)。在3-10日龄给一个试验组(2x1ml)中的小猪接种1ml疫苗，并在21天后重复该疫苗接种。在24-31日龄给另一试验组(1x2ml)的小猪接种2ml疫苗。在3-10日龄和21天后给对照组中的小猪注射1ml盐水。在第6、8、10、12周和此后每周取粪便样品用于劳森氏菌pcr，直到所述猪在23周龄时被屠宰。研究3的结果在该第二个研究中，劳森氏菌感染在畜群中传播，如通过粪便的pcr数据所证实的。没有动物具有劳森氏菌感染的临床征状。因而，所述组受向(野生型)细菌的场地暴露引起的亚临床感染影响。关于劳森氏菌脱落，在对照组的小猪批次之间发现了阳性粪便样品出现的大差异：在第一个小猪批次中，在育成阶段晚期(第18和19周)发现了阳性对照样品，在第二个批次中，仅在第21周发现了阳性样品，和在第三个批次中，在第21周发现了一个阳性样品。但是，在第四个批次中，从第17周以后检测到阳性样品，而在第五个批次中，在第14周已发现了阳性样品。总之，从第14周以后50%的对照产生了一个或多个阳性样品，来自2x1ml组的2个(6%)和1x2ml组的4个(12%)是阳性的。与对照组相比，在研究过程中具有pcr劳森氏菌阳性粪便样品(对于1或2个连续周)的动物的数目在1x2ml组(fisher氏精确检验，p<0.0001)和2x1ml组(fisher氏精确检验，p=0.0002)中显著更低。当前第1页12