ISG15和其作为佐剂的用途的制作方法
本发明涉及包含抗原和isg15的疫苗以及施用所述疫苗的方法。
背景技术：
疫苗用于刺激个体的免疫应答，以提供针对特定疾病的保护和/或对特定疾病的治疗。一些疫苗包含诱导免疫应答的抗原。一些抗原引起强免疫应答，而其他抗原引起弱免疫应答。通过在疫苗中包含佐剂可以加强对抗原的弱免疫应答。佐剂以很多不同形式出现，例如铝盐、油乳剂、细菌或其他病原体的无菌成分、细胞因子等。
干扰素刺激基因15(isg15)是由i型干扰素刺激诱导的首要且最丰富的蛋白质之一。isg15是遍在蛋白样蛋白质，其在抗病毒防御方面起主要作用。isg15的遍在蛋白样c末端(lrlrgg)基序是为isg15在称为isg化的过程(产生“缀合的”isg15)中缀合至多种细胞内蛋白质所需的。当未呈这种缀合形式时，游离或“未缀合”的isg15可存在于细胞内或细胞外。几十年来，游离isg15涉及到ifnγ的产生。最近，新研究通过证实isg15缺陷与ifnγ的丧失相关联确认了isg15的这种细胞因子样作用，进而在小鼠和人中均导致对分枝杆菌疾病的易受性增加。虽然这些研究建立了isg15作为免疫调节分子起作用的能力，但是其影响cd8t细胞免疫应答并且充当疫苗佐剂的能力仍是未知的。
还以许多不同方式(例如，注射、口服等)将疫苗施用到许多不同的组织(例如，肌内、鼻内等)中。然而，并非所有的递送方法都是等效的。一些递送方法允许在个体群体内的更大顺从性，而其他递送方法可影响疫苗的免疫原性和/或安全性。因此，在本领域中仍需要开发安全且更有效的增加对抗原的免疫应答的佐剂。
技术实现要素：
发明概述
本发明涉及一种包含抗原和isg15的疫苗。isg15可以由选自由以下各项组成的组的核苷酸序列编码：与如在seqidno:1中列出的核苷酸序列具有至少约95％同一性的核苷酸序列、如在seqidno:1中列出的核苷酸序列、与如在seqidno:3中列出的核苷酸序列具有至少约95％同一性的核苷酸序列、如在seqidno:3中列出的核苷酸序列、与如在seqidno:5中列出的核苷酸序列具有至少约95％同一性的核苷酸序列、如在seqidno:5中列出的核苷酸序列、与如在seqidno:7中列出的核苷酸序列具有至少约95％同一性的核苷酸序列、如在seqidno:7中列出的核苷酸序列、与如在seqidno:9中列出的核苷酸序列具有至少约95％同一性的核苷酸序列，以及如在seqidno:9中列出的核苷酸序列。isg15可由如在seqidno:1中列出的核苷酸序列编码。isg15可由如在seqidno:3中列出的核苷酸序列编码。isg15可由如在seqidno:5中列出的核苷酸序列编码。isg15可由如在seqidno:7中列出的核苷酸序列编码。isg15可由如在seqidno:9中列出的核苷酸序列编码。
所述抗原可由第一核酸编码，并且isg15可由第二核酸编码。所述第二核酸还可包含表达载体。所述第一核酸还可包含表达载体。所述疫苗还可包含由以下各项中的一种编码的抗原肽：seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5、seqidno:7或seqidno:9。所述疫苗还可包含由以下各项中的一种编码的isg15肽：seqidno:2、seqidno:4、seqidno:6、seqidno:8或seqidno:10。所述疫苗还可包含由以下各项中的一种编码的抗原肽：seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5、seqidno:7或seqidno:9；和由以下各项中的一种编码的isg15肽：seqidno:2、seqidno:4、seqidno:6、seqidno:8或seqidno:10。
所述抗原可选自由以下各项组成的组：人乳头瘤病毒(hpv)抗原、人免疫缺陷病毒(hiv)抗原、流感抗原、恶性疟原虫(plasmodiumfalciparum)抗原、结核分枝杆菌(mycobacteriumtuberculosis)抗原、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎(lcmv)抗原，以及其片段。所述hpv抗原可选自由以下各项组成的组：hpv16e6抗原、hpv16e7抗原，以及其组合。所述hiv抗原可选自由以下各项组成的组：enva、envb、envc、envd、bnef-rev、gag，以及其任何组合。所述流感抗原可选自由以下各项组成的组：h1ha、h2ha、h3ha、h5ha、bha抗原，以及其任何组合。所述恶性疟原虫抗原可包括环子孢子(cs)抗原。所述结核分枝杆菌抗原可选自由以下各项组成的组：ag85a、ag85b、esxa、esxb、esxc、esxd、esxe、esxf、esxh、esxo、esxq、esxr、esxs、esxt、esxu、esxv、esxw，以及其任何组合。所述lcmv抗原可选自由以下各项组成的组：核蛋白(np)、糖蛋白(gp)，以及其组合。
所述疫苗还可包含药学上可接受的赋形剂。
本发明还涉及一种用于在有需要的受试者中增加或诱导免疫应答的方法。所述方法可包括向所述受试者施用包含抗原和isg15的疫苗。isg15可以由以下核苷酸序列编码：与如在seqidno:1中列出的核苷酸序列具有至少约95％同一性的核苷酸序列、如在seqidno:1中列出的核苷酸序列、与如在seqidno:3中列出的核苷酸序列具有至少约95％同一性的核苷酸序列、如在seqidno:3中列出的核苷酸序列、与如在seqidno:5中列出的核苷酸序列具有至少约95％同一性的核苷酸序列、如在seqidno:5中列出的核苷酸序列、与如在seqidno:7中列出的核苷酸序列具有至少约95％同一性的核苷酸序列、如在seqidno:7中列出的核苷酸序列、与如在seqidno:9中列出的核苷酸序列具有至少约95％同一性的核苷酸序列，以及如在seqidno:9中列出的核苷酸序列。isg15可由如在seqidno:1中列出的核苷酸序列编码。isg15可由如在seqidno:3中列出的核苷酸序列编码。isg15可由如在seqidno:5中列出的核苷酸序列编码。isg15可由如在seqidno:7中列出的核苷酸序列编码。isg15可由如在seqidno:9中列出的核苷酸序列编码。
施用所述疫苗可包括电穿孔。所述受试者中的免疫应答可增加至少约2倍。所述受试者中的所述免疫应答可以增加至少约4倍。增加所述受试者中的所述免疫应答可包括增加所述受试者中的细胞免疫应答。
本发明还涉及一种用于在有需要的受试者中治疗癌症的方法。所述方法可包括向所述受试者施用包含抗原和isg15的疫苗。isg15可以由以下核苷酸序列编码：与如在seqidno:1中列出的核苷酸序列具有至少约95％同一性的核苷酸序列、如在seqidno:1中列出的核苷酸序列、与如在seqidno:3中列出的核苷酸序列具有至少约95％同一性的核苷酸序列、如在seqidno:3中列出的核苷酸序列、与如在seqidno:5中列出的核苷酸序列具有至少约95％同一性的核苷酸序列、如在seqidno:5中列出的核苷酸序列、与如在seqidno:7中列出的核苷酸序列具有至少约95％同一性的核苷酸序列、如在seqidno:7中列出的核苷酸序列、与如在seqidno:9中列出的核苷酸序列具有至少约95％同一性的核苷酸序列，以及如在seqidno:9中列出的核苷酸序列。isg15可由如在seqidno:1中列出的核苷酸序列编码。isg15可由如在seqidno:3中列出的核苷酸序列编码。isg15可由如在seqidno:5中列出的核苷酸序列编码。isg15可由如在seqidno:7中列出的核苷酸序列编码。isg15可由如在seqidno:9中列出的核苷酸序列编码。
用于治疗癌症的所述方法还可包括减小所述受试者中的肿瘤大小。与施用不含isg15的疫苗相比，所述受试者中的所述肿瘤大小可减小至少10％。用于治疗癌症的所述方法还可包括增加所述受试者中的肿瘤消退。与施用不含isg15的疫苗相比，所述受试者中的所述肿瘤消退可增加至少10％。所述癌症可选自由以下各项组成的组：hpv相关癌症、hbv相关癌症、卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、脑癌、头颈癌、喉癌、肺癌、肝癌(livercancer)、胰腺癌、肾癌、骨癌、黑素瘤、转移性癌症、htert相关癌症、fap抗原相关癌症、非小细胞肺癌、血癌、食管鳞状细胞癌、子宫颈癌、膀胱癌、结直肠癌、胃癌(gastriccancer)、肛门癌、滑膜肉瘤(synovialcarcinoma)、睪丸癌、复发性呼吸道乳头状瘤病、皮肤癌、成胶质细胞瘤、肝肿瘤(hepatocarcinoma)、胃癌(stomachcancer)、急性髓性白血病、三阴性乳腺癌，以及原发性皮肤t细胞淋巴瘤。所述癌症可以是hpv相关癌症。
本发明还涉及一种包含选自由以下各项组成的组的一种或多种核苷酸序列的核酸分子：seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5、seqidno:7、seqidno:9、与seqidno:195％或更大相同的核苷酸序列、与seqidno:395％或更大相同的核苷酸序列、与seqidno:595％或更大相同的核苷酸序列、与seqidno:795％或更大相同的核苷酸序列、与seqidno:995％或更大相同的核苷酸序列，以及其任何组合。所述核酸分子可以是质粒。所述核酸分子可以是一个或多个质粒。
附图说明
图1.isg15编码dna疫苗质粒的生成和表达。(a)isg15蛋白以及野生型isg15(wtisg15)和突变型isg15(mutisg15)的氨基酸序列的示意图。加下划线的是ige前导序列。粗体且加下划线的是c末端遍在蛋白样缀合位点。红色的是引入到mutisg15(未缀合形式)的缀合基序中的突变位点。(b)isg15构建体的图谱。(c)通过蛋白质印迹分析检查isg15构建体的表达。最低谱带表示游离isg15。(d)对由转染的rd细胞分泌的wtisg15和mutisg15的检测通过elisa确认。数据表示两个重复测定的平均值和sem。
图2.分泌ifnγ产生的isg15dna疫苗接种促进的e7特异性cd8t细胞免疫应答的共递送。(a)dna疫苗佐剂研究的免疫计划表。通过im/ep递送在伴有或不伴有wtisg15或mutisg15佐剂构建体下用hpv16构建体以两周为间隔对c57bl/6只小鼠(n＝4-5/组)小鼠免疫两次。最后一次疫苗接种后一周，收获脾以分析ag特异性cd8t细胞应答。(b)每次疫苗接种后诱导的e7特异性ifnγ(斑点形成细胞/106个脾细胞)应答的频率通过响应于含有特异性cd8hpv16e7表位(rahynivtf(seqidno:11))的e7汇集肽的ifnγelispot测定来测定。数据表示2个独立的实验，每组具有4-5只小鼠。*,p<0.05；**,p<0.01。误差线指示sem。
图3.isg15诱导多功能性hpv16e7特异性cd8t细胞。(a)用于鉴定ag特异性cd8t细胞群体的门控策略的示意图。(b-d).柱图示出在用dbe749-57特异性肽刺激之后释放总细胞因子ifnγ(b)、tnfα(c)和il-2(d)的hpv16e7特异性cd8t细胞的百分比。(e)柱图表示出针对e749-57特异性刺激释放以下效应细胞因子的单阳性、双阳性或三阳性cd8t细胞的多功能性亚群：ifnγ、tnfα和il-2。饼形图表示每种细胞因子群体的比例。实验进行至少两次，具有类似结果，每组具有4-5只小鼠。*,p<0.05，与hpv16组相比。误差线指示sem。
图4.在免疫之后，isg15诱导经受细胞毒性脱粒的hpv16e7特异性cd8t细胞。在最终免疫后1周在所有组的动物中检查用dbe749-57限制性(cd8)肽刺激脾细胞之后通过细胞内细胞因子和cd107a染色测量的e7特异性cd8t细胞应答。(a)通过针对脱粒标记物表达cd107a的染色测量的cd8t细胞的ag特异性溶细胞性脱粒。(b和c)柱图示出同时仅表达ifnγ的溶细胞性cd8t细胞的频率(b)或产生多功能性细胞因子和/或表达cd107a表达cd8t细胞的频率(c)。实验进行至少两次，具有类似结果，每组具有4-5只小鼠。*,p<0.05；**,p<0.01与hpv16组相比。误差线指示sem。
图5.isg15扩增效应记忆e7特异性cd8t细胞群体的形成。用hpv16、hpv16/wtisg15或hpv16/mutisg15以两周为间隔对b6组小鼠(n＝4-5)免疫两次。最后一次免疫后一周，针对cd8、dbe749-57四聚体和效应记忆klrg1标记物对脾细胞和外周血单核细胞染色。(a)示出最终免疫后一周脾中的h2-db-rahynivtf-限制性hpv16e7特异性cd8t细胞的代表性流式图，或(b)表示为散点图的数据。(c-d)脾中e7四聚体特异性记忆表型群体的百分比的代表性点图(c)或汇编的数据(d)。(e-f)来自外周血(e)和四聚体特异性效应记忆cd8t细胞(f)的总dbe749-57四聚体结合cd8t细胞的百分比。数据代表至少2个实验。*,p<0.05；**,p<0.01。误差线指示sem。
图6.在具有肿瘤的小鼠中通过isg15诱导的治疗效果。(a)治疗性研究的示意性表示。(b)在治疗性dna/ep疫苗接种之后的肿瘤生长测量(n＝10)。(c)在治疗性疫苗接种的情况下cd8t细胞消耗的示意性表示。(d)在不存在cd8t细胞下疫苗接种组(n＝5)的肿瘤生长曲线。(e和f)t细胞过继性转移研究的示意性表示(e)。从疫苗接种小鼠自脾细胞纯化大约4x106个cd8t细胞并且将其过继性转移到具有肿瘤的t细胞免疫缺陷b6rag1ko小鼠(n＝5)中，并且对其评估肿瘤生长(f)。对所有具有肿瘤的小鼠皮下注射5x104个tc-1细胞。.*,p<0.05；**,p<0.01；***,p<0.001。误差线指示sem。
图7.isg15对nk或cd4t细胞没有深刻影响。(a)点图示出用hpv16、hpv16/wtisg15或hpv16/mutisg15组最终免疫后1周的脾中的nk细胞的百分比。(b)点图示出响应于脾中的离体e7汇集肽释放ifnγ的hpve7特异性cd4t细胞。数据不是显著性的。实验进行至少两次(n＝4-5只小鼠/组)。*,p<0.05；**,p<0.01。误差线指示sem。
图8.包含isg15作为疫苗佐剂改善具有肿瘤的小鼠中的肿瘤控制和消退。对c57bl/6只小鼠组(n＝10/组)皮下注射5x104个tc-1细胞。在肿瘤移植后的第4天开始，对所有组的小鼠进行免疫，随后以一周为间隔进行三次加强。用isg15构建体的免疫在具有肿瘤的小鼠中延迟了肿瘤生长或产生肿瘤消退。仅示出存活小鼠的每个时间点的肿瘤测量(每只个别小鼠的平均值)。当肿瘤直径达到大约18-20mm时，将小鼠处死。图像是在肿瘤植入后第42天时肿瘤大小的代表性实例。
具体实施方式
本发明涉及一种可以通过使用isg15作为佐剂用于增加对抗原的免疫应答的疫苗。当用作佐剂时，isg15可增加抗病毒细胞因子干扰素-γ(ifn-γ)和肿瘤坏死因子α(tnf-α)以及白介素-2(il-2)的水平。因此，isg15可增加多功能性cd8+t细胞的亚群以促进细胞免疫应答。
isg15可增强对抗原的细胞免疫应答，所述抗原诸如病毒和细菌抗原，例如人乳头瘤病毒(hpv)抗原和淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(lcmv)抗原。因而，isg15可促进针对所述病原体的显著保护。
此外，本发明的疫苗可预防癌症或肿瘤形成。疫苗可导致已形成癌症或肿瘤的消退。例如，消退可以是90％或更大，如通过肿瘤大小的减小证明的。在一些情况下，癌症的消退可以是完全的。疫苗还可预防病毒相关癌症(例如，hpv相关癌症)并导致其消退。因此，本文还提供一种用于通过向有需要的受试者施用疫苗来治疗癌症的方法。
疫苗包含抗原和isg15。isg15可由选自由以下各项组成的组的核苷酸序列编码：具有以下同一性的编码蛋白质序列的核苷酸序列：与如在seqidno:1中列出的核苷酸序列具有至少约95％同一性、与如在seqidno:1中列出的核苷酸序列具有至少约96％同一性、与如在seqidno:1中列出的核苷酸序列具有至少约97％同一性、与如在seqidno:1中列出的核苷酸序列具有至少约98％同一性、与如在seqidno:1中列出的核苷酸序列具有至少约99％同一性，以及如在seqidno:1中列出的核苷酸序列。
isg15可由选自由以下各项组成的组的核苷酸序列编码：具有以下同一性的编码蛋白质序列的核苷酸序列：与如在seqidno:3中列出的核苷酸序列具有至少约95％同一性、与如在seqidno:3中列出的核苷酸序列具有至少约96％同一性、与如在seqidno:3中列出的核苷酸序列具有至少约97％同一性、与如在seqidno:3中列出的核苷酸序列具有至少约98％同一性、与如在seqidno:3中列出的核苷酸序列具有至少约99％同一性，以及如在seqidno:3中列出的核苷酸序列。
isg15可由选自由以下各项组成的组的核苷酸序列编码：具有以下同一性的编码蛋白质序列的核苷酸序列：与如在seqidno:5中列出的核苷酸序列具有至少约95％同一性、与如在seqidno:5中列出的核苷酸序列具有至少约96％同一性、与如在seqidno:5中列出的核苷酸序列具有至少约97％同一性、与如在seqidno:5中列出的核苷酸序列具有至少约98％同一性、与如在seqidno:5中列出的核苷酸序列具有至少约99％同一性以及如在seqidno:5中列出的核苷酸序列。
isg15可由选自由以下各项组成的组的核苷酸序列编码：具有以下同一性的编码蛋白质序列的核苷酸序列：与如在seqidno:7中列出的核苷酸序列具有至少约95％同一性、与如在seqidno:7中列出的核苷酸序列具有至少约96％同一性、与如在seqidno:7中列出的核苷酸序列具有至少约97％同一性、与如在seqidno:7中列出的核苷酸序列具有至少约98％同一性、与如在seqidno:1中列出的核苷酸序列具有至少约99％同一性，以及如在seqidno:7中列出的核苷酸序列。
isg15可由选自由以下各项组成的组的核苷酸序列编码：具有以下同一性的编码蛋白质序列的核苷酸序列：与如在seqidno:9中列出的核苷酸序列具有至少约95％同一性、与如在seqidno:9中列出的核苷酸序列具有至少约96％同一性、与如在seqidno:9中列出的核苷酸序列具有至少约97％同一性、与如在seqidno:9中列出的核苷酸序列具有至少约98％同一性、与如在seqidno:9中列出的核苷酸序列具有至少约99％同一性，以及如在seqidno:9中列出的核苷酸序列。
isg15可增强对抗原的细胞免疫应答，所述抗原诸如病毒和细菌抗原，例如人乳头瘤病毒(hpv)抗原、人免疫缺陷病毒(hiv)抗原、结核分枝杆菌抗原以及淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(lcmv)抗原。因而，isg15可促进针对所述病原体的显著保护。
本发明的疫苗可预防癌症或肿瘤形成。疫苗还可导致已形成癌症或肿瘤的消退。消退可以是90％或更大的消退。癌症的消退可以是完全的。疫苗还可预防病毒相关癌症(例如，hpv相关癌症)并导致其消退。因此，本文还提供一种用于通过向有需要的受试者施用疫苗来治疗癌症的方法。
1.定义
除非另外定义，否则本文所用的全部技术和科学术语都具有本领域的普通技术人员通常理解的相同含义。当发生冲突时，以本文件(包括定义)为准。虽然在本发明的实践或测试中可以使用与本文所描述的那些方法和材料类似或等效的方法和材料，但以下描述了优选的方法和材料。本文提及的所有公布、专利申请、专利以及其他参考文献以其全文以引用的方式并入本文。本文公开的材料、方法和实施例仅是示例性的，并不意图为限制性的。
如本文所用，术语“包含(comprise)”、“包括(include)”、“具有(having)”、“具有(has)”、“可以(can)”、“含有(contain)”以及其变化形式意图是不排除另外行为或结构的可能性的开放式连接词、术语或词语。除非上下文另外清楚地说明，否则单数形式“一个/种(a)”、“一个/种(an)”以及“所述(the)”包括复数引用。本公开还涵盖“包括本文所呈现的实施方案或要素”、“由本文所呈现的实施方案或要素组成”以及“主要由本文所呈现的实施方案或要素组成”的其他实施方案，无论是否明确地提出。
如本文所用的“佐剂”意指添加至本文所描述的疫苗中以增强抗原的免疫原性的任何分子。
如本文所用的“片段”意指编码能够在哺乳动物中引起免疫应答的多肽的核酸序列或其部分。所述片段可以是选自编码下文所述的蛋白质片段的各种核苷酸序列的至少一种的dna片段。
如本文所用的“免疫应答”意指响应于抗原的引入而产生的宿主的免疫系统(例如，哺乳动物的免疫系统)的活化。所述免疫反应可以是细胞反应或体液反应或两者的形式。
如本文所用的“核酸”可以是单链的或者双链的或可以含有双链和单链序列两者的部分。所述核酸可以是dna、基因组和cdna两者、rna或杂合体，其中所述核酸可以含有脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的组合，以及包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌啉、肌苷、黄嘌呤次黄嘌呤、异胞嘧啶以及异鸟嘌呤的碱基的组合。核酸可以通过化学合成方法或者通过重组方法来获得。
如本文所用的“可操作地连接”意指基因的表达是在空间上与之连接的启动子的控制下进行的。在其控制下，启动子可以被定位在基因的5'(上游)或者3'(下游)。所述启动子和基因之间的距离可以大约与所述启动子和其在启动子从中衍化的基因中所控制的基因之间的距离相同。如本领域所已知，这个距离的变化可以在没有丧失启动子功能的情况下进行调整。
如本文所用的“肽”、“蛋白质”或“多肽”可以意指氨基酸的连接序列，并且可以是天然的、合成的或天然与合成的修饰或组合。
如本文所用的“启动子”意指合成的或自然来源的分子，所述分子能够赋予、活化或增强细胞中的核酸的表达。启动子可包含一个或多个特定的转录调控序列以便进一步增强表达和/或改变其空间的表达和/或时间的表达。启动子还可以包含远端增强子或阻遏元件，它们可以位于从转录的起始点开始的差不多几千对碱基对处。启动子可以从包括病毒、细菌、真菌、植物、昆虫以及动物的来源中获得。启动子可以调控基因组分相对于其中发生表达的细胞、组织或器官或相对于发生表达所处的发育阶段或响应于外部刺激(如生理应激、病原体、金属离子或诱导剂)而组成型地或差异性地表达。启动子的代表性实例包括噬菌体t7启动子、噬菌体t3启动子、sp6启动子、乳糖操纵子-启动子、tac启动子、sv40后期启动子、sv40早期启动子、rsv-ltr启动子、cmvie启动子、sv40早期启动子或者sv40后期启动子以及cmvie启动子。
如本文所用的“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”可以意指通过预防、遏制、阻遏的手段保护动物免于疾病或完全消除疾病。预防疾病涉及在疾病发作之前向动物施用本发明的疫苗。遏制疾病涉及在疾病诱发之后但在其临床出现之前向动物施用本发明的疫苗。阻遏疾病涉及在疾病的临床出现之后向动物施用本发明的疫苗。
如本文所用的“受试者”可以意指想要或需要用本文所描述的疫苗进行免疫的哺乳动物。哺乳动物可以是人、黑猩猩、狗、猫、马、牛、小鼠或大鼠。
如关于核酸在本文中使用的“变体”意指(i)参考核苷酸序列的一部分或片段；(ii)参考核苷酸序列或其部分的互补序列；(iii)与参考核酸或其互补序列大致相同的核酸；或(iv)在严格条件下与参考核酸、其互补序列或与其大致相同的序列杂交的核酸。
变体可以进一步定义为通过氨基酸的插入、缺失或保守性取代而在氨基酸序列上有所不同、但保留至少一种生物活性的肽或多肽。“生物活性”的代表性实例包括被特异性抗体结合或促进免疫应答的能力。变体还意指具有与参考蛋白质基本上相同的氨基酸序列的蛋白质，所述参考蛋白质具有保留至少一种生物活性的氨基酸序列。氨基酸的保守性取代，即以相似特性(例如，亲水性、带电区域的程度和分布)的不同氨基酸来替换氨基酸，在本领域中被认为通常涉及微小变化。这些微小变化可部分地通过考虑氨基酸的亲水指数来鉴定，如本领域中所理解的。kyte等,j.mol.biol.157:105-132(1982)。氨基酸的亲疏水性指数是基于其疏水性和电荷的考虑。本领域已知的是相似的亲疏水性指数的氨基酸可以被取代并仍然保留蛋白质功能。在一方面，亲疏水性指数为±2的氨基酸被取代。氨基酸的亲水性还可以被用来揭示会产生保留生物功能的蛋白质的取代。在肽的情形下考虑氨基酸的亲水性允许计算所述肽最大的局部平均亲水性，这是已经被报道来与抗原性和免疫原性良好关联的有用测量。如本领域中所理解，用亲水性值相似的氨基酸进行取代可产生保留生物活性(例如免疫原性)的肽。可用亲水性值处在±2范围内的氨基酸进行取代。氨基酸的亲疏水性指数和亲水性值两者都受所述氨基酸的特定侧链影响。与所述观察一致的是，与生物功能相容的氨基酸取代被理解为取决于这些氨基酸相对的相似性，并且特别是那些氨基酸的侧链，如通过疏水性、亲水性、电荷、大小以及其他特性所揭示的。
变体可以是在全基因序列或其片段的全长上大致相同的核酸序列。核酸序列可在基因序列或其片段的全长上80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。变体可以是在氨基酸序列或其片段的全长上大致相同的氨基酸序列。氨基酸序列可在氨基酸序列或其片段的全长上80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同
如本文所用的“载体”意指含有复制起点的核酸序列。载体可以是病毒载体、噬菌体、细菌人工染色体或酵母人工染色体。载体可以是dna或rna载体。载体可以是自我复制的染色体外载体，并优选地是dna质粒。
对于本文数值范围的叙述来说，明确地涵盖具有相同精确度的介于其间的每个中间数字。例如，对于6-9的范围，除了6和9外还涵盖数字7和8，并且对于6.0-7.0的范围，明确涵盖了数字6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9以及7.0。
2.疫苗
本文提供一种包含抗原和佐剂的疫苗。疫苗可以在受试者中增加抗原呈递和对抗原的总免疫应答。抗原和佐剂的组合比仅包含抗原的疫苗更有效地诱导免疫系统。当施用于不同组织(如肌肉和皮肤)时，疫苗可以进一步诱导免疫应答。这种更有效的免疫应答在任何疾病、病原体或病毒(包括以下更详细地描述的癌症)的治疗和/或预防方面提供增加的功效。
与不包含佐剂的疫苗相比，疫苗可以至少约1.5倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约8倍以及至少约10倍地诱导ifn-γ的产生。
与不包含佐剂的疫苗相比，疫苗可在受试者中增加或加强对抗原的细胞和/或体液免疫应答。与不包含佐剂的疫苗相比，疫苗可使对抗原的细胞免疫应答增加约75％至约200％。另选地，与不包含佐剂的疫苗相比，疫苗可使对抗原的细胞免疫应答增加约90％至约130％。与不包含佐剂的疫苗相比，疫苗可使对抗原的细胞免疫应答增加约50％、约51％、约52％、约53％、约54％、约55％、约56％、约57％、约58％、约59％、约60％、约61％、约62％、约63％、约64％、约65％、约66％、约67％、约68％、约69％、约70％、约71％、约72％、约73％、约74％、约75％、约76％、约77％、约78％、约79％、约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、约100％、约101％、约102％、约103％、约104％、约105％、约106％、约107％、约108％、约109％、约110％、约111％、约112％、约113％、约114％、约115％、约116％、约117％、约118％、约119％、约120％、约121％、约122％、约123％、约124％、约125％、约126％、约127％、约128％、约129％、约130％、约131％、约132％、约133％、约134％、约135％、约136％、约137％、约138％、约139％、约140％、约141％、约142％、约143％、约144％、约145％、约146％、约147％、约148％、约149％、约150％、约151％、约152％、约153％、约154％、约155％、约156％、约157％、约158％、约159％、约160％、约161％、约162％、约163％、约164％、约165％、约166％、约167％、约168％、约169％、约170％、约171％、约172％、约173％、约174％、约175％、约176％、约177％、约178％、约179％、约180％、约181％、约182％、约183％、约184％、约185％、约186％、约187％、约188％、约189％、约190％、约191％、约192％、约193％、约194％、约195％、约196％、约197％、约198％、约199％或约200％。
本发明的疫苗可以具有有效疫苗所要求的特征，如为安全的，以使得疫苗本身不会引起疾病或死亡；保护以免受由暴露于活的病原体(如病毒或细菌)引起的疾病；诱导中和抗体来预防细胞的感染；诱导对抗细胞内病原体的保护性t细胞应答；以及提供施用容易性、很少副作用、生物稳定性以及每剂量的低成本。通过如以下所论述组合抗原和佐剂，疫苗可实现这些特征中的一些或全部。
疫苗还可修改抗原内的表位呈递，以诱导比仅包含抗原的疫苗更大的对抗原的免疫应答。当施用至不同组织(如肌肉或皮肤)时，疫苗可以进一步诱导免疫应答。
a.佐剂
疫苗可包含佐剂。佐剂可以是核酸序列、氨基酸序列或其组合。所述核酸序列可以是dna、rna、cdna、其变体、其片段或其组合。核酸序列还可以包含编码通过肽键连接至佐剂的接头序列或标签序列的另外序列。氨基酸序列可以是蛋白质、肽、其变体、其片段或其组合。
(1)isg15
佐剂可以是干扰素刺激基因15(isg15)、其片段、其变体或其组合。isg15可呈缀合的或可缀合的形式。isg15可呈未缀合的或不可缀合的形式。例如，isg15的缀合形式可具有如seqidno:4或seqidno:8中所示的氨基酸序列。isg15的未缀合形式可具有如，例如，seqidno:2、seqidno:6或seqidno:10中所示的氨基酸序列。
isg15是由i型干扰素诱导的遍在蛋白样蛋白质并且与感染性疾病(即，细菌感染和病毒感染)相关联，并且是免疫调节性分子，其中isg15已显示介导针对流感、hiv和辛德毕斯病毒(sindbisvirus)感染等的保护。
isg15表达在细胞应激，特别是由细菌感染和病毒感染诱导的那些之后上调。这些应激活化ifn信号传导中的转录因子(主要是干扰素调节因子3(irf3)和干扰素刺激型基因因子3(isgf3))，进而上调isg15的表达，其中isg15的启动子含有2种ifn-刺激型应答元件(isre)。外部侵害(γ辐射、抗癌药或病毒感染)和内部侵害(疾病和老化)可触发isg15表达。已显示isg15具有细胞因子样作用并且其缺陷已与ifnγ的丧失相关联，进而在小鼠和人中均导致对分枝杆菌疾病的易受性增加。此外，发现重组人isg15当添加到细胞培养基时体外活化白细胞并且诱导促炎细胞因子的产生。
isg15含有2个遍在蛋白样结构域，使得其是遍在蛋白样蛋白质的线性二聚体。在感染期间产生的i型干扰素诱导isg15的表达，从而导致其分泌并且类似于遍在蛋白，通过独特的酶级联反应的作用缀合至细胞内底物。如上文简述的，isg15可具有遍在蛋白样c末端(lrlrgg(seqidno:12))基序，其有利于isg15在称为isg化的过程(产生“缀合的”isg15)中缀合至多种细胞内蛋白质。当未呈这种缀合形式时，游离或“未缀合”的isg15可存在于细胞内或细胞外。
isg15当一起施用时可以增加或加强受试者中的对抗原的免疫应答。在以下对抗原进行更详细地论述。与施用不伴有isg15的抗原相比，isg15可使对抗原的免疫应答增加约75％至约200％。在一些情况下，与施用不伴有isg15的抗原相比，isg15可以使对抗原的免疫应答增加约90％至约150％。在一些情况下，与施用不含isg15的疫苗相比，isg15可以使免疫应答增加约100％至约130％。在仍其他替代性实施方案中，与施用不伴有isg15的抗原相比，isg15可使对抗原的免疫应答增加约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、约100％、约101％、约102％、约103％、约104％、约105％、约106％、约107％、约108％、约109％、约110％、约111％、约112％、约113％、约114％、约115％、约116％、约117％、约118％、约119％、约120％、约121％、约122％、约123％、约124％、约125％、约126％、约127％、约128％、约129％或约130％。
在其他实施方案中，与施用不伴有isg15的抗原相比，isg15可以使对抗原的免疫应答增加或加强至少1.5倍、至少2.0倍、至少2.5倍、至少3.0倍、至少3.5倍、至少4.0倍、至少4.5倍、至少5.0倍、至少5.5倍、至少6.0倍、至少6.5倍、至少7.0倍、至少7.5倍、至少8.0倍、至少8.5倍、至少9.0倍、至少9.5倍或至少10.0倍。
作为佐剂的isg15可增加或加强受试者中的对抗原的th1或细胞免疫应答。th1免疫应答涉及t细胞应答的活化。这些t细胞应答可包括cd4+和cd8+t细胞应答以及干扰素-γ、肿瘤坏死因子α和/或白介素(il-2)的分泌。干扰素-γ和肿瘤坏死因子α具有抗病毒、免疫调节和抗肿瘤特性，并且可以改变多种基因的转录以产生多种生理应答和细胞应答。由干扰素-γ引起的一些作用包括促进自然杀伤细胞(nk细胞)活性、引起正常细胞增加i类mhc分子的表达、增加巨噬细胞中的抗原呈递和溶酶体活性、诱导一氧化氮合酶(inos)以及促进有关细胞毒性cd8+t细胞的细胞免疫中的th1分化，同时遏制体液(抗体)免疫中的th2分化。
细胞毒性cd8+t细胞(细胞毒性t淋巴细胞(ctl))是诱导感染病毒和其他病原体的细胞死亡的t细胞的亚组。在活化后，ctl经历克隆扩增以产生抗原特异性的效应细胞。效应ctl通过指导的胞吐作用(即，脱粒)分子的过程释放，所述分子杀死感染的细胞或靶细胞，例如，穿孔蛋白、粒溶蛋白和颗粒酶。当不再需要时，许多效应ctl死亡，但是一些效应细胞被保留为记忆细胞，以使得当再次遇到抗原时，记忆细胞分化成效应细胞以更快速地发动免疫应答。
当isg15增加或加强th1或细胞免疫应答时，使干扰素-γ(ifn-γ)水平(分泌)增加。在一些情况下，与施用不伴有isg15的抗原相比，isg15可使对抗原的th1或细胞免疫应答增加约1.5倍至约10.0倍、约1.5倍至约8.0倍、约1.5倍至约6.0倍、约1.5倍至约4.0倍、约2.0倍至约10.0倍、约2.0倍至约8.0倍、约2.0倍至约6.0倍、约2.0倍至约4.0倍、约2.5倍至约4.0倍、约4.0倍至约10.0倍、约6.0倍至约10.0倍，或约8.0倍至约10.0倍。与施用不伴有isg15的抗原相比，isg15还可使对抗原的th1或细胞免疫应答增加至少2.5倍、至少2.6倍、至少2.7倍、至少2.8倍、至少2.9倍、至少3.0倍、至少3.1倍、至少3.2倍、至少3.3倍、至少3.4倍、至少3.5倍、至少3.6倍、至少3.7倍、至少3.8倍、至少3.9倍、至少4.0倍、至少4.1倍、至少4.2倍、至少4.3倍、至少4.4倍、至少4.5倍、至少4.6倍、至少4.7倍、至少4.8倍、至少4.9倍、至少5.0倍、至少6.0倍、至少7.0倍、至少8.0倍、至少9.0倍或至少10.0倍。与施用不伴有isg15的抗原相比，isg15还可使th1或细胞免疫应答增加约2.0倍、约2.5倍、约3.0倍、约3.5倍、约4.0倍或约4.5倍。
增加或加强的对抗原的免疫应答还可包括增加的cd8+t细胞应答。增加的cd8+t细胞应答可包括增加受试者中分泌ifn-γ、tnf-α或ifn-γ和tnf-α两者，或ifn-γ、tnf-α和il-2的组合的cd8+t细胞(例如，表达ifn-γ、tnf-α和il-2的三阳性细胞)的群体或频率。因此，增加的cd8+t细胞应答可包括增加多功能性cd8+t细胞的亚群。
增加的cd8+t细胞应答还可包括增加的细胞毒性cd8+t淋巴细胞(ctl)应答。增加的ctl应答可包括增加受试者中经受脱粒的cd8+t细胞的群体或频率。增加的ctl应答还可包括增加受试者中表达cd107a的cd8+t细胞的群体或频率。增加的ctl应答还可包括增加受试者中共表达cd107a和ifn-γ，或cd107a、ifn-γ和tnf-α的cd8+t细胞的群体或频率。
增加或加强的对抗原的免疫应答还可包括受试者中cd8+t细胞的扩增和分化。所述扩增可发生在外周。另外，增加了受试者中的已形成记忆cd8+t细胞的回忆(recall)。因而，isg15可通过扩增对抗原具有特异性的效应和效应记忆cd8+t细胞群来增加细胞免疫应答。扩增的效应和效应记忆cd8+t细胞群可具有增加的表达klrg1的细胞的频率。
增加或加强的对抗原(通过isg15提供)的免疫应答还可包括针对与抗原相关联的疾病的保护。在一些实施方案中，增加或加强的对抗原的免疫应答可包括针对与抗原相关联的疾病的完全保护。在一些情况下，与在isg15不是佐剂时的抗原条件下针对疾病的存活率相比，增加或加强的对抗原的免疫应答可包括针对与抗原相关联的疾病至少约70％至约100％、约75％至约95％存活率或约75％至约85％的存活率。在其他实施方案中，与在isg15不是佐剂时的抗原条件下针对疾病的存活率相比，增加或加强的对抗原的免疫应答可包括针对与抗原相关联的疾病至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少或100％的存活率。
编码isg15的核酸可以来自任何数量的生物体，例如，小鼠(小家鼠(musmusculus))、猕猴(macaque)(猕猴(macacacmulatta))和人(智人(homosapiens))。在优选的实施方案中，编码isg15的核酸为人isg15核酸。例如，人isg15核酸可以是seqidno:5、seqidno:7或seqidno:9。在另一实施方案中，编码isg15的核酸为小鼠isg15核酸。例如，小鼠isg15核酸可以是seqidno:1或seqidno:3。可以关于密码子使用和对应rna转录物对编码isg15的核酸进行优化。可以针对表达对编码isg15的核酸进行密码子和rna优化。在一些实施方案中，编码isg15的核酸可包含kozak序列(例如，gccacc)以提高翻译的效率。编码isg15的核酸可包含多个终止密码子(例如，tgatga)以提高翻译终止的效率。编码isg15的核酸还可包括编码ige前导序列的核苷酸序列。ige前导序列在核酸中可以位于isg15的5’。在一些实施方案中，编码isg15的核酸不含或不含有编码ige前导序列的核苷酸序列。
isg15可以是优化的核酸序列seqidno:1，其编码seqidno:2。在一些实施方案中，isg15可以是在seqidno:1中所列出的核酸序列的全长上具有至少约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％同一性的核酸序列。在其他实施方案中，isg15可以是编码以下氨基酸序列的核酸序列，所述氨基酸序列在seqidno:2中所列出的氨基酸序列的全长上具有至少约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％同一性。isg15可以是在seqidno:2中所列出的氨基酸序列的全长上具有至少约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％同一性的氨基酸序列。
一些实施方案涉及seqidno:1的片段。所述片段可包含至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的seqidno:1。在一些实施方案中，片段可以包括编码前导序列的序列，所述前导序列例如免疫球蛋白前导序列，如ige前导序列。在一些实施方案中，片段不含编码前导序列的编码序列。
可提供具有与seqidno:1的片段具有同一性的核苷酸序列的核酸的片段。所述片段可包含至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的与seqidno:1具有95％或更大同一性的核酸。一些实施方案涉及与本文的isg15核酸序列的片段具有96％或更大同一性的片段。一些实施方案涉及与本文的isg15核酸序列的片段具有97％或更大同一性的片段。一些实施方案涉及与本文的isg15核酸序列的片段具有98％或更大同一性的片段。一些实施方案涉及与本文的isg15核酸序列的片段具有99％或更大同一性的片段。在一些实施方案中，片段包括编码前导序列的序列，所述前导序列例如免疫球蛋白前导序列，诸如ige前导序列。在一些实施方案中，片段不含编码前导序列的编码序列。
可提供seqidno:2的片段。所述片段可包含至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的seqidno:2。在一些实施方案中，片段包含前导序列，例如，免疫球蛋白前导序列，诸如ige前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列。
可以提供具有与seqidno:2的片段具有同一性的氨基酸序列的蛋白质的片段。所述片段可包含至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的与seqidno:2具有95％或更大同一性的蛋白质。一些实施方案涉及与本文的isg15蛋白序列的片段具有96％或更大同一性的片段。一些实施方案涉及与本文的isg15蛋白序列的片段具有97％或更大同一性的片段。一些实施方案涉及与本文的isg15蛋白序列的片段具有98％或更大同一性的片段。一些实施方案涉及与本文的isg15蛋白序列的片段具有99％或更大同一性的片段。在一些实施方案中，片段包含前导序列，例如，免疫球蛋白前导序列，诸如ige前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列。
isg15可以是优化的核酸序列seqidno:3，其编码seqidno:4。在一些实施方案中，isg15可以是在seqidno:3中所列出的核酸序列的全长上具有至少约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％同一性的核酸序列。在其他实施方案中，isg15可以是编码以下氨基酸序列的核酸序列，所述氨基酸序列在seqidno:4中所列出的氨基酸序列的全长上具有至少约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％同一性。isg15可以是在seqidno:4中所列出的氨基酸序列的全长上具有至少约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％同一性的氨基酸序列。
一些实施方案涉及seqidno:3的片段。所述片段可包含至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的seqidno:3。在一些实施方案中，片段可以包括编码前导序列的序列，所述前导序列例如免疫球蛋白前导序列，如ige前导序列。在一些实施方案中，片段不含编码前导序列的编码序列。
可提供具有与seqidno:3的片段具有同一性的核苷酸序列的核酸的片段。所述片段可包含至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的与seqidno:3具有95％或更大同一性的核酸。一些实施方案涉及与本文的isg15核酸序列的片段具有96％或更大同一性的片段。一些实施方案涉及与本文的isg15核酸序列的片段具有97％或更大同一性的片段。一些实施方案涉及与本文的isg15核酸序列的片段具有98％或更大同一性的片段。一些实施方案涉及与本文的isg15核酸序列的片段具有99％或更大同一性的片段。在一些实施方案中，片段包括编码前导序列的序列，所述前导序列例如免疫球蛋白前导序列，诸如ige前导序列。在一些实施方案中，片段不含编码前导序列的编码序列。
可提供seqidno:4的片段。所述片段可包含至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的seqidno:4。在一些实施方案中，片段包含前导序列，例如，免疫球蛋白前导序列，诸如ige前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列。
可以提供具有与seqidno:4的片段具有同一性的氨基酸序列的蛋白质的片段。所述片段可包含至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的与seqidno:4具有95％或更大同一性的蛋白质。一些实施方案涉及与本文的isg15蛋白序列的片段具有96％或更大同一性的片段。一些实施方案涉及与本文的isg15蛋白序列的片段具有97％或更大同一性的片段。一些实施方案涉及与本文的isg15蛋白序列的片段具有98％或更大同一性的片段。一些实施方案涉及与本文的isg15蛋白序列的片段具有99％或更大同一性的片段。在一些实施方案中，片段包含前导序列，例如，免疫球蛋白前导序列，诸如ige前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列。
isg15可以是优化的核酸序列seqidno:5，其编码seqidno:6。在一些实施方案中，isg15可以是在seqidno:5中所列出的核酸序列的全长上具有至少约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％同一性的核酸序列。在其他实施方案中，isg15可以是编码以下氨基酸序列的核酸序列，所述氨基酸序列在seqidno:6中所列出的氨基酸序列的全长上具有至少约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％同一性。isg15可以是在seqidno:6中所列出的氨基酸序列的全长上具有至少约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％同一性的氨基酸序列。
一些实施方案涉及seqidno:5的片段。所述片段可包含至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的seqidno:5。在一些实施方案中，片段可以包括编码前导序列的序列，所述前导序列例如免疫球蛋白前导序列，如ige前导序列。在一些实施方案中，片段不含编码前导序列的编码序列。
可提供具有与seqidno:5的片段具有同一性的核苷酸序列的核酸的片段。所述片段可包含至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的与seqidno:5具有95％或更大同一性的核酸。一些实施方案涉及与本文的isg15核酸序列的片段具有96％或更大同一性的片段。一些实施方案涉及与本文的isg15核酸序列的片段具有97％或更大同一性的片段。一些实施方案涉及与本文的isg15核酸序列的片段具有98％或更大同一性的片段。一些实施方案涉及与本文的isg15核酸序列的片段具有99％或更大同一性的片段。在一些实施方案中，片段包括编码前导序列的序列，所述前导序列例如免疫球蛋白前导序列，诸如ige前导序列。在一些实施方案中，片段不含编码前导序列的编码序列。
可提供seqidno:6的片段。所述片段可包含至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的seqidno:6。在一些实施方案中，片段包含前导序列，例如，免疫球蛋白前导序列，诸如ige前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列。
可以提供具有与seqidno:6的片段具有同一性的氨基酸序列的蛋白质的片段。所述片段可包含至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的与seqidno:6具有95％或更大同一性的蛋白质。一些实施方案涉及与本文的isg15蛋白序列的片段具有96％或更大同一性的片段。一些实施方案涉及与本文的isg15蛋白序列的片段具有97％或更大同一性的片段。一些实施方案涉及与本文的isg15蛋白序列的片段具有98％或更大同一性的片段。一些实施方案涉及与本文的isg15蛋白序列的片段具有99％或更大同一性的片段。在一些实施方案中，片段包含前导序列，例如，免疫球蛋白前导序列，诸如ige前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列。
isg15可以是优化的核酸序列seqidno:7，其编码seqidno:8。在一些实施方案中，isg15可以是在seqidno:7中所列出的核酸序列的全长上具有至少约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％同一性的核酸序列。在其他实施方案中，isg15可以是编码以下氨基酸序列的核酸序列，所述氨基酸序列在seqidno:8中所列出的氨基酸序列的全长上具有至少约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％同一性。isg15可以是在seqidno:8中所列出的氨基酸序列的全长上具有至少约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％同一性的氨基酸序列。
一些实施方案涉及seqidno:7的片段。所述片段可包含至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的seqidno:7。在一些实施方案中，片段可以包括编码前导序列的序列，所述前导序列例如免疫球蛋白前导序列，如ige前导序列。在一些实施方案中，片段不含编码前导序列的编码序列。
可提供具有与seqidno:7的片段具有同一性的核苷酸序列的核酸的片段。所述片段可包含至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的与seqidno:7具有95％或更大同一性的核酸。一些实施方案涉及与本文的isg15核酸序列的片段具有96％或更大同一性的片段。一些实施方案涉及与本文的isg15核酸序列的片段具有97％或更大同一性的片段。一些实施方案涉及与本文的isg15核酸序列的片段具有98％或更大同一性的片段。一些实施方案涉及与本文的isg15核酸序列的片段具有99％或更大同一性的片段。在一些实施方案中，片段包括编码前导序列的序列，所述前导序列例如免疫球蛋白前导序列，诸如ige前导序列。在一些实施方案中，片段不含编码前导序列的编码序列。
可提供seqidno:8的片段。所述片段可包含至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的seqidno:8。在一些实施方案中，片段包含前导序列，例如，免疫球蛋白前导序列，诸如ige前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列。
可以提供具有与seqidno:8的片段具有同一性的氨基酸序列的蛋白质的片段。所述片段可包含至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的与seqidno:8具有95％或更大同一性的蛋白质。一些实施方案涉及与本文的isg15蛋白序列的片段具有96％或更大同一性的片段。一些实施方案涉及与本文的isg15蛋白序列的片段具有97％或更大同一性的片段。一些实施方案涉及与本文的isg15蛋白序列的片段具有98％或更大同一性的片段。一些实施方案涉及与本文的isg15蛋白序列的片段具有99％或更大同一性的片段。在一些实施方案中，片段包含前导序列，例如，免疫球蛋白前导序列，诸如ige前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列。
isg15可以是优化的核酸序列seqidno:9，其编码seqidno:10。在一些实施方案中，isg15可以是在seqidno:9中所列出的核酸序列的全长上具有至少约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％同一性的核酸序列。在其他实施方案中，isg15可以是编码以下氨基酸序列的核酸序列，所述氨基酸序列在seqidno:10中所列出的氨基酸序列的全长上具有至少约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％同一性。isg15可以是在seqidno:10中所列出的氨基酸序列的全长上具有至少约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％同一性的氨基酸序列。
一些实施方案涉及seqidno:9的片段。所述片段可包含至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的seqidno:9。在一些实施方案中，片段可以包括编码前导序列的序列，所述前导序列例如免疫球蛋白前导序列，如ige前导序列。在一些实施方案中，片段不含编码前导序列的编码序列。
可提供具有与seqidno:9的片段具有同一性的核苷酸序列的核酸的片段。所述片段可包含至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的与seqidno:9具有95％或更大同一性的核酸。一些实施方案涉及与本文的isg15核酸序列的片段具有96％或更大同一性的片段。一些实施方案涉及与本文的isg15核酸序列的片段具有97％或更大同一性的片段。一些实施方案涉及与本文的isg15核酸序列的片段具有98％或更大同一性的片段。一些实施方案涉及与本文的isg15核酸序列的片段具有99％或更大同一性的片段。在一些实施方案中，片段包括编码前导序列的序列，所述前导序列例如免疫球蛋白前导序列，诸如ige前导序列。在一些实施方案中，片段不含编码前导序列的编码序列。
可提供seqidno:10的片段。所述片段可包含至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的seqidno:8。在一些实施方案中，片段包含前导序列，例如，免疫球蛋白前导序列，诸如ige前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列。
可以提供具有与seqidno:10的片段具有同一性的氨基酸序列的蛋白质的片段。所述片段可包含至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的与seqidno:10具有95％或更大同一性的蛋白质。一些实施方案涉及与本文的isg15蛋白序列的片段具有96％或更大同一性的片段。一些实施方案涉及与本文的isg15蛋白序列的片段具有97％或更大同一性的片段。一些实施方案涉及与本文的isg15蛋白序列的片段具有98％或更大同一性的片段。一些实施方案涉及与本文的isg15蛋白序列的片段具有99％或更大同一性的片段。在一些实施方案中，片段包含前导序列，例如，免疫球蛋白前导序列，诸如ige前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列。
b.抗原
疫苗还可包含抗原或其片段或变体和如上所述的佐剂。抗原可以是在受试者中诱导免疫应答的任何物质。纯化的抗原通常其自身不是强免疫原性的，并且因此如上所述与佐剂组合。当与佐剂组合时可以加强或增加由抗原诱导的免疫应答。所述免疫应答可以是体液免疫应答和/或细胞免疫应答。在一些实施方案中，佐剂和抗原的组合可以加强或增加受试者中的细胞免疫应答。
抗原可以是核酸序列、氨基酸序列或其组合。所述核酸序列可以是dna、rna、cdna、其变体、其片段或其组合。核酸序列还可以包含编码通过肽键连接至抗原的接头序列或标签序列的另外序列。氨基酸序列可以是蛋白质、肽、其变体、其片段或其组合。
抗原可以含于来自任何数量的有机体(例如，病毒、寄生虫、细菌、真菌或哺乳动物)的蛋白质、核酸，或其片段、其变体或其组合中。抗原可以与自身免疫疾病、过敏或哮喘相关。在其他实施方案中，抗原可以与癌症、疱疹、流感、乙型肝炎、丙型肝炎、人乳头瘤病毒(hpv)或人免疫缺陷病毒(hiv)相关。优选地，抗原可以与流感或hiv相关。
一些抗原可以诱导强免疫应答。其他抗原可以诱导弱免疫应答。当如上所述与佐剂组合时，抗原可以引起更大的免疫应答。
(1)病毒抗原
抗原可以是病毒抗原，或其片段或其变体。病毒抗原可以来自一种病毒，所述病毒来自以下家族之一：腺病毒科(adenoviridae)、沙粒病毒科(arenaviridae)、布尼亚病毒科(bunyaviridae)、嵌杯病毒科(caliciviridae)、冠状病毒科(coronaviridae)、纤丝病毒科(filoviridae)、嗜肝dna病毒科(hepadnaviridae)、疱疹病毒科(herpesviridae)、正粘病毒科(orthomyxoviridae)、乳多空病毒科(papovaviridae)、副粘液病毒科(paramyxoviridae)、细小病毒科(parvoviridae)、小rna病毒科(picornaviridae)、痘病毒科(poxviridae)、呼肠孤病毒科(reoviridae)、逆转录病毒科(retroviridae)、弹状病毒科(rhabdoviridae)或披膜病毒科(togaviridae)。病毒抗原可以来自乳头瘤病毒，例如人乳头瘤病毒(hpv)、人免疫缺陷病毒(hiv)、脊髓灰质炎病毒、乙型肝炎病毒(hbv)、丙型肝炎病毒(hcv)、天花病毒(重型天花和轻型天花)、痘苗病毒、流感病毒、鼻病毒、登革热病毒、马脑炎病毒、风疹病毒、黄热病病毒、诺沃克病毒(norwalkvirus)、甲型肝炎病毒、人t-细胞白血病病毒(htlv-i)、多毛细胞白血病病毒(htlv-ii)、加州脑炎病毒、汉坦病毒(hantavirus)(出血热)、狂犬病病毒、埃博拉热病毒(ebolafevervirus)、马尔堡病毒(marburgvirus)、麻疹病毒、腮腺炎病毒、呼吸道合胞体病毒(rsv)、单纯性疱疹1(口腔疱疹)、单纯性疱疹2(生殖器疱疹)、带状疱疹(水痘-带状疱疹，也称为水痘)、巨细胞病毒(cmv)(例如，人cmv)、爱泼斯坦-巴尔病毒(epstein-barrvirus)(ebv)、黄病毒、口蹄疫病毒、基孔肯亚病毒(chikungunyavirus)、拉沙病毒(lassavirus)、沙粒病毒、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(lcmv)或致癌病毒。
(a)肝炎抗原
isg15可以与肝炎病毒抗原(即，肝炎抗原)或其片段或其变体联合或组合。肝炎抗原可以是来自甲型肝炎病毒(hav)、乙型肝炎病毒(hbv)、丙型肝炎病毒(hcv)、丁型肝炎病毒(hdv)和/或戊型肝炎病毒(hev)的抗原或免疫原。在一些实施方案中，肝炎抗原可以是编码来自hav、hbv、hcv、hdv和hev的一种或多种抗原的异源核酸分子(如质粒)。肝炎抗原可以是全长蛋白质的全长或免疫原性片段。
肝炎抗原可以包含共有序列和/或用于改善表达的一种或多种修饰。包括密码子优化、rna优化和添加高效免疫球蛋白前导序列以增加构建体的免疫原性的基因修饰可以包括在经过修饰的共有序列中。共有肝炎抗原可包含信号肽，如免疫球蛋白信号肽(如ige或igg信号肽)，并且在一些实施方案中，可包含ha标签。可以设计免疫原，以引起比相应密码子优化的免疫原更强并且更广泛的细胞免疫应答。
肝炎抗原可以是来自hav的抗原。肝炎抗原可以是hav衣壳蛋白、hav非结构蛋白、其片段、其变体或其组合。
肝炎抗原可以是来自hcv的抗原。肝炎抗原可以是hcv核衣壳蛋白(即，核心蛋白)、hcv包膜蛋白(例如，e1和e2)、hcv非结构蛋白(例如，ns1、ns2、ns3、ns4a、ns4b、ns5a和ns5b)、其片段、其变体或其组合。
肝炎抗原可以是来自hdv的抗原。肝炎抗原可以是hdvδ抗原、其片段或其变体。
肝炎抗原可以是来自hev的抗原。肝炎抗原可以是hev衣壳蛋白、其片段或其变体。
肝炎抗原可以是来自hbv的抗原。肝炎抗原可以是hbv核心蛋白、hbv表面蛋白、hbvdna聚合酶、由基因x编码的hbv蛋白、其片段、其变体或其组合。肝炎抗原可以是hbv基因型a核心蛋白、hbv基因型b核心蛋白、hbv基因型c核心蛋白、hbv基因型d核心蛋白、hbv基因型e核心蛋白、hbv基因型f核心蛋白、hbv基因型g核心蛋白、hbv基因型h核心蛋白、hbv基因型a表面蛋白、hbv基因型b表面蛋白、hbv基因型c表面蛋白、hbv基因型d表面蛋白、hbv基因型e表面蛋白、hbv基因型f表面蛋白、hbv基因型g表面蛋白、hbv基因型h表面蛋白、其片段、其变体或其组合。肝炎抗原可以是共有hbv核心蛋白或共有hbv表面蛋白。
在一些实施方案中，肝炎抗原可以是hbv基因型a共有核心dna序列构建体、连接至hbv基因型a核心蛋白的共有序列的ige前导序列，或hbv基因型a共有核心蛋白序列。
在其他实施方案中，肝炎抗原可以是hbv基因型b共有核心dna序列构建体、连接至hbv基因型b核心蛋白的共有序列的ige前导序列，或hbv基因型b共有核心蛋白序列。
在其他实施方案中，肝炎抗原可以是hbv基因型c共有核心dna序列构建体、连接至hbv基因型c核心蛋白的共有序列的ige前导序列，或hbv基因型c共有核心蛋白序列。
在一些实施方案中，肝炎抗原可以是hbv基因型d共有核心dna序列构建体、连接至hbv基因型d核心蛋白的共有序列的ige前导序列，或hbv基因型d共有核心蛋白序列。
在其他实施方案中，肝炎抗原可以是hbv基因型e共有核心dna序列构建体、连接至hbv基因型e核心蛋白的共有序列的ige前导序列，或hbv基因型e共有核心蛋白序列。
在一些实施方案中，肝炎抗原可以是hbv基因型f共有核心dna序列构建体、连接至hbv基因型f核心蛋白的共有序列的ige前导序列，或hbv基因型f共有核心蛋白序列。
在其他实施方案中，肝炎抗原可以是hbv基因型g共有核心dna序列构建体、连接至hbv基因型g核心蛋白的共有序列的ige前导序列，或hbv基因型g共有核心蛋白序列。
在一些实施方案中，肝炎抗原可以是hbv基因型h共有核心dna序列构建体、连接至hbv基因型h核心蛋白的共有序列的ige前导序列，或hbv基因型h共有核心蛋白序列。
在其他实施方案中，肝炎抗原可以是hbv基因型a共有表面dna序列构建体、连接至hbv基因型a表面蛋白的共有序列的ige前导序列，或hbv基因型a共有表面蛋白序列。
在一些实施方案中，肝炎抗原可以是hbv基因型b共有表面dna序列构建体、连接至hbv基因型b表面蛋白的共有序列的ige前导序列，或hbv基因型b共有表面蛋白序列。
在其他实施方案中，肝炎抗原可以是hbv基因型c共有表面dna序列构建体、连接至hbv基因型c表面蛋白的共有序列的ige前导序列，或hbv基因型c共有表面蛋白序列。
在其他实施方案中，肝炎抗原可以是hbv基因型d共有表面dna序列构建体、连接至hbv基因型d表面蛋白的共有序列的ige前导序列，或hbv基因型d共有表面蛋白序列。
在一些实施方案中，肝炎抗原可以是hbv基因型e共有表面dna序列构建体、连接至hbv基因型e表面蛋白的共有序列的ige前导序列，或hbv基因型e共有表面蛋白序列。
在其他实施方案中，肝炎抗原可以是hbv基因型f共有表面dna序列构建体、连接至hbv基因型f表面蛋白的共有序列的ige前导序列，或hbv基因型f共有表面蛋白序列。
在其他实施方案中，肝炎抗原可以是hbv基因型g共有表面dna序列构建体、连接至hbv基因型g表面蛋白的共有序列的ige前导序列，或hbv基因型g共有表面蛋白序列。
在其他实施方案中，肝炎抗原可以是hbv基因型h共有表面dna序列构建体、连接至hbv基因型h表面蛋白的共有序列的ige前导序列，或hbv基因型h共有表面蛋白序列。
(b)人乳头瘤病毒(hpv)抗原
isg15可以与人乳头瘤病毒(hpv)抗原或其片段或其变体联合或组合。hpv抗原可以来自引起宫颈癌、直肠癌和/或其他癌症的16型、18型、31型、33型、35型、45型、52型和58型hpv。hpv抗原可以来自引起生殖器疣并且已知为头颈癌原因的6型和11型hpv。
hpv抗原可以是来自每种hpv类型的hpve6或e7域。例如，对于16型hpv(hpv16)，hpv16抗原可以包括hpv16e6抗原、hpv16e7抗原、其片段、其变体或其组合。类似地，hpv抗原可以是hpv6e6和/或e7、hpv11e6和/或e7、hpv18e6和/或e7、hpv31e6和/或e7、hpv33e6和/或e7、hpv52e6和/或e7或者hpv58e6和/或e7、其片段、变体或组合。
(c)rsv抗原
isg15还可以与rsv抗原或其片段或其变体联合或组合。rsv抗原可以是人rsv融合蛋白(本文中还称为“rsvf”、“rsvf蛋白”和“f蛋白”)或其片段或变体。人rsv融合蛋白在a亚型rsv与b亚型rsv之间可以是保守的。rsv抗原可以是来自rsv长链(genbankaax23994.1)的rsvf蛋白或其片段或变体。rsv抗原可以是来自rsva2链(genbankaab59858.1)的rsvf蛋白或其片段或变体。rsv抗原可以是rsvf蛋白或其片段或变体的单体、二聚体或三聚体。rsv抗原可以是优化的氨基酸rsvf氨基酸序列或其片段或变体。
rsvf的融合后形式在经过免疫的动物中引起高滴度中和抗体，并且保护动物免于rsv激发。本发明在所要求的疫苗中利用这种免疫应答。根据本发明，rsvf蛋白可以呈融合前形式或融合后形式。
rsv抗原还可以是人rsv附着糖蛋白(本文中还称为“rsvg”、“rsvg蛋白”和“g蛋白”)或其片段或变体。人rsvg蛋白在a亚型rsv与b亚型rsv之间有所不同。抗原可以是来自rsv长链(genbankaax23993)的rsvg蛋白或其片段或变体。rsv抗原可以是来自以下的rsvg蛋白：b亚型rsv分离物h5601、b亚型rsv分离物h1068、b亚型rsv分离物h5598、b亚型rsv分离物h1123或其片段或变体。rsv抗原可以是优化的氨基酸rsvg氨基酸序列或其片段或变体。
在其他实施方案中，rsv抗原可以是人rsv非结构蛋白1(“ns1蛋白”)或其片段或变体。例如，rsv抗原可以是来自rsv长链(genbankaax23987.1)的rsvns1蛋白或其片段或变体。rsv抗原还可以是人rsv非结构蛋白2(“ns2蛋白”)或其片段或变体。例如，rsv抗原可以是来自rsv长链(genbankaax23988.1)的rsvns2蛋白或其片段或变体。rsv抗原还可以是人rsv核衣壳(“n”)蛋白或其片段或变体。例如，rsv抗原可以是来自rsv长链(genbankaax23989.1)的rsvn蛋白或其片段或变体。rsv抗原可以是人rsv磷蛋白(“p”)蛋白或其片段或变体。例如，rsv抗原可以是来自rsv长链(genbankaax23990.1)的rsvp蛋白或其片段或变体。rsv抗原还可以是人rsv基质蛋白(“m”)蛋白或其片段或变体。rsv抗原可以是来自rsv长链(genbankaax23991.1)的rsvm蛋白或其片段或变体。
在其他实施方案中，rsv抗原可以是人rsv小疏水(“sh”)蛋白或其片段或变体。例如，rsv抗原可以是来自rsv长链(genbankaax23992.1)的rsvsh蛋白或其片段或变体。rsv抗原还可以是人rsv基质蛋白2-1(“m2-1”)蛋白或其片段或变体。例如，rsv抗原可以是来自rsv长链(genbankaax23995.1)的rsvm2-1蛋白或其片段或变体。rsv抗原还可以是人rsv基质蛋白2-2(“m2-2”)蛋白或其片段或变体。例如，rsv抗原可以是来自rsv长链(genbankaax23997.1)的rsvm2-2蛋白或其片段或变体。rsv抗原可以是rsv聚合酶l(“l”)蛋白或其片段或变体。例如，rsv抗原可以是来自rsv长链(genbankaax23996.1)的rsvl蛋白或其片段或变体。
在另外的实施方案中，rsv抗原可以具有ns1、ns2、n、p、m、sh、m2-1、m2-2或l蛋白的优化的氨基酸序列。rsv抗原可以是人rsv蛋白或重组抗原，如由人rsv基因组编码的蛋白质中的任一种。
在其他实施方案中，rsv抗原可以是但不限于：来自rsv长链的rsvf蛋白、来自rsv长链的rsvg蛋白、优化的氨基酸rsvg氨基酸序列、rsv长链的人rsv基因组、优化的氨基酸rsvf氨基酸序列、来自rsv长链的rsvns1蛋白、来自rsv长链的rsvns2蛋白、来自rsv长链的rsvn蛋白、来自rsv长链的rsvp蛋白、来自rsv长链的rsvm蛋白、来自rsv长链的rsvsh蛋白、来自rsv长链的rsvm2-1蛋白、来自rsv长链的rsvm2-2蛋白、来自rsv长链的rsvl蛋白、来自b亚型rsv分离物h5601的rsvg蛋白、来自b亚型rsv分离物h1068的rsvg蛋白、来自b亚型rsv分离物h5598的rsvg蛋白、来自b亚型rsv分离物h1123的rsvg蛋白，或其片段或其变体。
(d)流感抗原
isg15可以与流感抗原或其片段或其变体联合或组合。流感抗原是能够在哺乳动物中引起针对一种或多种流感血清型的免疫应答的那些流感抗原。抗原可以包含全长翻译产物ha0、亚单位ha1、亚单位ha2、其变体、其片段或其组合。流感血凝素抗原可以是源自多种甲型流感血清型h1株的共有序列、源自多种甲型流感血清型h2株的共有序列、含有源自不同组的多种甲型流感血清型h1株的两个不同的共有序列的部分的杂交序列或源自多种乙型流感株的共有序列。流感血凝素抗原可以来自乙型流感。
流感抗原还可以含有至少一种抗原表位，所述抗原表位可以有效对抗特定流感免疫原，针对所述流感免疫原的免疫应答可以被诱导。抗原可以提供存在于完整流感病毒中的免疫原性位点和表位的全部谱系。抗原可以是可以源自血凝素抗原序列的共有血凝素抗原序列，所述血凝素抗原序列来自一种血清型的多种甲型流感病毒株，如血清型h1或血清型h2的多种甲型流感病毒株。抗原可以是可以通过组合两个不同的共有血凝素抗原序列或其部分获得的杂交共有血凝素抗原序列。两个不同的共有血凝素抗原序列各自可以源自不同组的一种血清型的多种甲型流感病毒株，如血清型h1的多种甲型流感病毒株。抗原可以是可以源自血凝素抗原序列的共有血凝素抗原序列，所述血凝素抗原序列来自多种乙型流感病毒株。
在一些实施方案中，流感抗原可以是h1ha、h2ha、h3ha、h5ha或bha抗原。另选地，流感抗原可以是包含共有h1氨基酸序列或共有h2氨基酸序列的共有血凝素抗原。共有血凝素抗原可以是包含两个不同的共有h1序列的部分的合成杂交共有h1序列，所述两个不同的共有h1序列各自源自来自另一者的不同组的序列。为合成杂交共有h1蛋白的共有ha抗原的实例是包含u2氨基酸序列的蛋白质。共有血凝素抗原可以是源自来自乙型流感株的血凝素序列的共有血凝素蛋白，如包含共有bha氨基酸序列的蛋白质。
共有血凝素抗原可还包含一种或多种另外的氨基酸序列元件。共有血凝素抗原还可在其n末端上包含ige或igg前导氨基酸序列。共有血凝素抗原可进一步包含免疫原性标签，所述免疫原性标签是可以通过可容易获得的抗体进行检测的独特免疫原性表位。所述免疫原性标签的实例是可以连接在共有血凝素c末端上的9个氨基酸的流感ha标签。在一些实施方案中，共有血凝素抗原还可在其n末端上包含ige或igg前导氨基酸序列并且在其c末端上包含ha标签。
共有血凝素抗原可以是由共有流感氨基酸序列或其片段和变体组成的共有血凝素蛋白。共有血凝素抗原可以是包含非流感蛋白质序列和流感蛋白质序列或其片段和变体的共有血凝素蛋白。
共有h1蛋白的实例包括可由共有h1氨基酸序列组成的那些共有h1蛋白或还包含另外元件(如ige前导序列或ha标签或ige前导序列和ha标签二者)的那些共有h1蛋白。
共有h2蛋白的实例包括可由共有h2氨基酸序列组成的那些共有h2蛋白或还包含ige前导序列或ha标签或ige前导序列和ha标签二者的那些共有h2蛋白。
杂交共有h1蛋白的实例包括可由共有u2氨基酸序列组成的那些杂交共有h1蛋白或还包含ige前导序列或ha标签或ige前导序列和ha标签二者的那些杂交共有h1蛋白。
杂交共有乙型流感血凝素蛋白的实例包括可以由共有bha氨基酸序列组成的那些杂交共有乙型流感血凝素蛋白或它可包含ige前导序列或ha标签，或ige前导序列和ha标签二者。
共有血凝素蛋白可以由共有血凝素核酸、其变体或其片段编码。与可以是源自来自不同株和变体的多种不同的血凝素序列的共有序列的共有血凝素蛋白不同，共有血凝素核酸是指编码共有蛋白质序列的核酸序列，并且所使用的编码序列可以不同于用于编码共有血凝素蛋白序列所源自的多个不同的血凝素序列中的特定氨基酸序列的那些编码序列。共有核酸序列可以是密码子优化的和/或rna优化的。共有血凝素核酸序列可包含位于5’非翻译区域中的kozak序列。共有血凝素核酸序列可包含编码前导序列的核酸序列。n末端前导序列的编码序列是血凝素编码序列的5’。n末端前导子可以促进分泌。n末端前导子可以是ige前导子或igg前导子。共有血凝素核酸序列可以包含编码免疫原性标签的核酸序列。免疫原性标签可以位于蛋白质的c末端上并且编码它的序列是ha编码序列的3’。免疫原性标签提供独特表位，存在针对所述表位的可容易获得的抗体，以使得可以在测定中使用所述抗体来检测和证实蛋白质的表达。免疫原性标签可以是位于蛋白质的c末端处的ha标签。
(e)人免疫缺陷病毒(hiv)抗原
isg15可以与hiv抗原或其片段或其变体联合或组合。hiv抗原可以包括经过修饰的免疫原共有序列。包括密码子优化、rna优化和添加高效免疫球蛋白前导序列以增加构建体的免疫原性的基因修饰可包括在经过修饰的共有序列中。可以设计新型免疫原，以引起比相应密码子优化的免疫原更强并且更广泛的细胞免疫应答。
在一些实施方案中，hiv抗原可以是a亚型共有包膜dna序列构建体、连接至a亚型包膜蛋白的共有序列的ige前导序列，或a亚型共有包膜蛋白序列。
在其他实施方案中，hiv抗原可以是b亚型共有包膜dna序列构建体、连接至b亚型包膜蛋白的共有序列的ige前导序列，或b亚型共有包膜蛋白序列。
在其他实施方案中，hiv抗原可以是c亚型共有包膜dna序列构建体、连接至c亚型包膜蛋白的共有序列的ige前导序列，或c亚型共有包膜蛋白序列。
在另外的实施方案中，hiv抗原可以是d亚型共有包膜dna序列构建体、连接至d亚型包膜蛋白的共有序列的ige前导序列，或d亚型共有包膜蛋白序列。
在一些实施方案中，hiv抗原可以是b亚型nef-rev共有包膜dna序列构建体、连接至b亚型nef-rev蛋白的共有序列的ige前导序列，或b亚型nef-rev共有蛋白序列。
在其他实施方案中，hiv抗原可以是a、b、c和d亚型dna序列构建体的gag共有dna序列、连接至gag共有a、b、c和d亚型蛋白的共有序列的ige前导序列，或共有gaga、b、c和d亚型蛋白序列。
在其他实施方案中，hiv抗原可以是mpoldna序列或mpol蛋白序列。hiv抗原可以是enva、envb、envc、envd、bnef-rev、gag以及其任何组合的核酸或氨基酸序列。
(f)淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(lcmv)抗原
isg15可以与lcmv抗原或其片段或其变体联合或组合。lcmv抗原可以包含共有序列和/或用于改善表达的一种或多种修饰。包括密码子优化、rna优化和添加高效免疫球蛋白前导序列以增加构建体的免疫原性的基因修饰可以包括在经过修饰的序列中。lcmv抗原可包含信号肽，诸如免疫球蛋白信号肽(例如，ige或igg信号肽)，并且在一些实施方案中，可包含ha标签。可以设计免疫原，以引起比相应密码子优化的免疫原更强并且更广泛的细胞免疫应答。
lcmv抗原可以是来自lcmvarmstrong的抗原。lcmv抗原可以是来自lcmv克隆13的抗原。lcmv抗原可以是来自lcmv的核蛋白(np)、来自lcmv的糖蛋白(gp；例如，gp-1、gp-2和gp-c)、来自lcmv的l蛋白、来自lcmv的z多肽、其片段、其变体或其组合。
(2)寄生虫抗原
抗原可以是寄生虫抗原或其片段或变体。寄生虫可以是原生动物、蠕虫或外寄生物。蠕虫(即，肠虫(worm))可以是扁形虫(例如，吸虫和绦虫)、棘头虫或蛔虫(例如，蛲虫)。外寄生物可以是虱子、跳蚤、壁虱和螨虫。
寄生虫可以是引起以下疾病的任何寄生虫：棘阿米巴角膜炎、阿米巴病(amoebiasis)、蛔虫病、巴贝西虫病(babesiosis)、小袋虫病、浣熊蛔虫病、恰加斯病、华支睾吸虫病、锥蝇属病(cochliomyia)、隐孢子虫病、裂头绦虫病、龙线虫病(dracunculiasis)、包虫病、象皮病、蛲虫病、片吸虫病、姜片虫病、丝虫病、贾第鞭毛虫病、颚口线虫病、膜壳绦虫病、等孢子球虫病、片山热(katayamafever)、利什曼病(leishmaniasis)、莱姆病(lymedisease)、疟疾、后殖吸虫病、蝇蛆病、盘尾丝虫病、虱病、疥疮、血吸虫病、昏睡症、类圆线虫病、绦虫病、弓蛔虫病、弓形虫病、旋毛虫病以及鞭虫病。
寄生虫可以是棘阿米巴(acanthamoeba)、异尖线虫、人蛔虫、肤蝇、结肠小袋虫、臭虫、多节绦虫亚纲(绦虫)、恙螨、螺旋蝇蛆、溶组织内阿米巴、肝片吸虫、兰伯贾第虫(giardialamblia)、钩虫、利什曼虫(leishmania)、锯齿舌形虫、肝吸虫、罗阿丝虫(loaloa)、并殖吸虫属-肺吸虫、蛲虫、恶性疟原虫、血吸虫、粪类圆线虫、螨虫、绦虫、刚地弓形虫、锥体虫、鞭虫或吴策线虫(wuchereriabancrofti)。
(a)疟疾抗原
isg15可以与疟疾抗原(即，pf抗原或pf免疫原)或其片段或其变体联合或组合。抗原可以来自引起疟疾的寄生虫。引起疟疾的寄生虫可以是恶性疟原虫。恶性疟原虫抗原可以包括环子孢子(cs)抗原。
在一些实施方案中，疟疾抗原可以是编码恶性疟原虫免疫原cs、lsa1、trap、celtos和ama1中的一个或多个的核酸分子(诸如质粒)。免疫原可以是全长蛋白质的全长或免疫原性片段。免疫原包含共有序列和/或用于改善表达的修饰。
在其他实施方案中，疟疾抗原可以是从genbank数据库中的所有全长恶性疟原虫trap/ssp2序列(总共28个序列)设计的trap(也称为ssp2)的共有序列。共有trap免疫原(即，contrap免疫原)可包含信号肽(如免疫球蛋白信号肽，如ige或igg信号肽)，并且在一些实施方案中，可包含ha标签。
在其他实施方案中，疟疾抗原可以是celtos，其也称为ag2并且是高度保守的疟原虫抗原。共有celtos抗原(即，conceltos免疫原)可包含信号肽(如免疫球蛋白信号肽，如ige或igg信号肽)，并且在一些实施方案中，可包含ha标签。
在另外的实施方案中，疟疾抗原可以是ama1，其为高度保守的疟原虫抗原。疟疾抗原还可以是ama1(即，conamai免疫原)的共有序列，其在一些情况下包含信号肽(如免疫球蛋白信号肽，如ige或igg信号肽)，并且在一些实施方案中，可包含ha标签。
在一些实施方案中，疟疾抗原可以是共有cs抗原(即，共有cs免疫原)，其在一些情况下包含信号肽(如免疫球蛋白信号肽，如ige或igg信号肽)，并且在一些实施方案中，可包含ha标签。
在其他实施方案中，疟疾抗原可以是包含本文所述的两种或更多种pf蛋白的组合的融合蛋白。例如，融合蛋白可包含直接彼此相邻地连接或者间隔子以之间具有间隔子或一个或多个氨基酸连接的共有cs免疫原、conlsa1免疫原、contrap免疫原、conceltos免疫原和conama1免疫原中的两种或更多种。在一些实施方案中，融合蛋白包含两个pf免疫原；在一些实施方案中，融合蛋白包含三个pf免疫原；在一些实施方案中，融合蛋白包含四个pf免疫原；并且在一些实施方案中，融合蛋白包含五个pf免疫原。具有两个共有pf免疫原的融合蛋白可包含：cs和lsa1、cs和trap、cs和celtos、cs和ama1、lsa1和trap、lsa1和celtos、lsa1和ama1、trap和celtos、trap和ama1；或者celtos和ama1。具有三个共有pf免疫原的融合蛋白可包含：cs、lsa1和trap；cs、lsa1和celtos；cs、lsa1和ama1；lsa1、trap和celtos；lsa1、trap和ama1；或者trap、celtos和ama1。具有四个共有pf免疫原的融合蛋白可包含：cs、lsa1、trap以及celtos；cs、lsa1、trap以及ama1；cs、lsa1、celtos以及ama1；cs、trap、celtos以及ama1；或者lsa1、trap、celtos以及ama1。具有五个共有pf免疫原的融合蛋白可包含cs或cs-alt、lsa1、trap、celtos以及ama1。
在一些实施方案中，融合蛋白包含连接至n末端的信号肽。在一些实施方案中，融合蛋白包含连接至每个共有pf免疫原的n末端的多个信号肽。在一些实施方案中，间隔子可包含在融合蛋白的pf免疫原之间。在一些实施方案中，融合蛋白的pf免疫原之间的间隔子可以是蛋白水解裂解位点。在一些实施方案中，间隔子可以是由在意图向其施用疫苗和/或摄取疫苗的细胞内发现的蛋白酶识别的蛋白水解裂解位点。在一些实施方案中，间隔子可包含在融合蛋白的pf免疫原之间，其中间隔子是由在意图向其施用疫苗和/或摄取疫苗的细胞内发现的蛋白酶识别的蛋白水解裂解位点，并且融合蛋白包含连接至每个共有pf免疫原的n末端的多个信号肽，以使得在裂解时，每个共有pf免疫原的信号肽使共有pf免疫原转移至细胞外。
(3)细菌抗原
抗原可以是细菌抗原或其片段或变体。细菌可以来自以下门中的任一种：酸杆菌门、放线菌门、产水菌门、拟杆菌门、caldiserica门、衣原体门、绿菌门、绿弯菌门、产金菌门、蓝藻菌门、脱铁杆菌门、异常球菌-栖热菌门、网团菌门、elusimicrobia门、纤维杆菌门、厚壁菌门、梭杆菌门、芽单胞菌门、黏胶球形菌门、硝化螺旋菌门、浮霉菌门、变形菌门、螺旋菌门、互养菌门、无壁菌门、热脱硫杆菌门、热袍菌门以及疣微菌门。
细菌可以是革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌。细菌可以是好氧细菌或厌氧细菌。细菌可以是自氧细菌或异氧细菌。细菌可以是嗜温菌、嗜中性菌、嗜极菌、嗜酸菌、嗜碱菌、嗜热菌、嗜冷菌、嗜盐菌或嗜高渗菌。
细菌可以是炭疽细菌、耐抗生素细菌、致病细菌、食物中毒细菌、传染性细菌、沙门氏菌属(salmonella)细菌、葡萄球菌属细菌、链球菌属细菌或破伤风细菌。细菌可以是分枝杆菌(mycobacteria)、破伤风梭菌(clostridiumtetani)、鼠疫杆菌(yersiniapestis)、炭疽芽孢杆菌(bacillusanthracis)、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistantstaphylococcusaureus)(mrsa)或者艰难梭菌(clostridiumdifficile)。细菌可以是结核分支杆菌。
(a)结核分支杆菌抗原
isg15可以与结核分支杆菌抗原(即，tb抗原或tb免疫原)或其片段或其变体联合或组合。tb抗原可以来自tb抗原的ag85家族，例如ag85a和ag85b。tb抗原可以来自tb抗原的esx家族，例如esxa、esxb、esxc、esxd、esxe、esxf、esxh、esxo、esxq、esxr、esxs、esxt、esxu、esxv以及esxw。
在一些实施方案中，tb抗原可以是编码来自ag85家族和esx家族的一种或多种结核分支杆菌免疫原的核酸分子(诸如质粒)。免疫原可以是全长蛋白质的全长或免疫原性片段。免疫原可包含共有序列和/或用于改善表达的修饰。共有免疫原可包含信号肽(如免疫球蛋白信号肽，如ige或igg信号肽)，并且在一些实施方案中，可包含ha标签。
(4)真菌抗原
抗原可以是真菌抗原或其片段或变体。真菌可以是曲霉菌属(aspergillusspecies)、皮炎芽生菌(blastomycesdermatitidis)、假丝酵母(candidayeasts)(例如，白色念珠菌(candidaalbicans))、球孢子菌属(coccidioides)、新型隐球菌(cryptococcusneoformans)、格特隐球菌(cryptococcusgattii)、皮肤真菌(dermatophyte)、镰刀菌属(fusariumspecies)、荚膜组织胞浆菌(histoplasmacapsulatum)、毛霉菌亚门(mucoromycotina)、耶氏肺孢子菌(pneumocystisjirovecii)、申克孢子丝菌(sporothrixschenckii)、明脐菌属(exserohilum)或者枝孢菌属(cladosporium)。
c.载体
疫苗可包含一种或多种载体，所述载体包含编码抗原和佐剂的核酸。一种或多种载体可以能够表达抗原和佐剂。一种或多种载体可以是表达构建体，所述表达构建体通常是用于将特定基因引入靶细胞中的质粒。一旦表达载体位于细胞内部，那么通过细胞转录和翻译机器核糖体复合物产生由基因编码的蛋白质。质粒经常经过工程改造以含有调控序列，所述调控序列充当增强子和启动子区域，并且导致表达载体上携带的基因的有效转录。本发明的载体表达大量稳定的信使rna，和因此形成的蛋白质。
载体可具有表达信号(诸如强启动子、强终止密码子)、启动子与克隆基因之间的距离的调节以及转录终止序列和ptis(可移动翻译起始序列)的插入。
(1)表达载体
载体可以是环状质粒或线性核酸。环状质粒和线性核酸能够指导适当的受试者细胞中的特定核苷酸序列的表达。载体可以具有可操作地连接至编码抗原的核苷酸序列或编码佐剂的核苷酸序列的启动子，这些核苷酸序列可以可操作地连接至终止信号。载体还可以含有核苷酸序列的正确翻译所需的序列。包含目标核苷酸序列的载体可以是嵌合的，这意味着至少一种其组分相对于至少一种它的其他组分是异源的。表达盒中的核苷酸序列的表达可在组成型启动子或诱导型启动子的控制下，所述启动子仅在宿主细胞暴露于一些特定外部刺激时起始转录。在多细胞有机体的情况下，启动子还可以是对特定组织或器官或发育阶段特异性的。
(2)环状载体和线性载体
载体可以是环状质粒，所述环状质粒可通过整合至细胞基因组中来转化靶细胞或存在于染色体外(例如，具有复制起点的自主复制质粒)。
载体可以是pvax、pcdna3.0或provax，或能够表达编码抗原或佐剂的dna并且使细胞能将序列翻译成由免疫系统识别的抗原或者佐剂的任何其他表达载体。
本文还提供能够经由电穿孔有效地递送至受试者并且表达一种或多种所需的抗原或者一种或多种所需的佐剂的线性核酸疫苗或线性表达盒(“lec”)。lec可以是没有任何磷酸主链的任何线性dna。dna可编码一种或多种抗原或者一种或多种佐剂。lec可包含启动子、内含子、终止密码子和/或多腺苷酸化信号。抗原或佐剂的表达可由启动子控制。lec可不包含任何抗生素抗性基因和/或磷酸主链。lec可不包含与所需的抗原基因表达或所需的佐剂表达不相关的其他核酸序列。
lec可源自能够线性化的任何质粒。质粒可能够表达抗原或佐剂。质粒可能够表达佐剂isg15。质粒可以是pnp(puertorico/34)或pm2(newcaledonia/99)。质粒可以是wlv009、pvax、pcdna3.0或provax，或者能够表达编码抗原或编码佐剂的dna并且使细胞能将序列翻译成由免疫系统识别的抗原或者佐剂的任何其他表达载体。
lec可以是pcrm2。lec可以是pcrnp。pcrnp和pcrmr可以分别源自pnp(puertorico/34)和pm2(newcaledonia/99)。
(3)启动子、内含子、终止密码子和多腺苷酸化信号
载体可具有启动子。启动子可以是能够驱动基因表达并且调控所分离核酸的表达的任何启动子。所述启动子是经由dna依赖性rna聚合酶转录所需的顺式作用序列元件，所述顺式作用序列元件转录本文所描述的抗原序列或佐剂序列。用于指导异源核酸表达的启动子的选择取决于具体应用。在载体中，启动子可定位在距离转录起始点与其天然环境中距离转录起始位点大约相同的位置上。然而，可容许所述距离的变化而不丧失启动子功能。
启动子可以可操作地连接至编码抗原以及转录物的有效多腺苷酸化、核糖体结合位点和翻译终止所需的信号的核酸序列。启动子可以可操作地连接至编码佐剂和转录物的高效多腺苷酸化、核糖体结合位点和翻译终止所需的信号的核酸序列。
启动子可以是cmv启动子、sv40早期启动子、sv40晚期启动子、金属硫蛋白启动子、鼠乳腺肿瘤病毒启动子、劳斯(rous)肉瘤病毒启动子、多角体蛋白启动子，或对于真核细胞中的表达显示有效的另一种启动子。
载体可包含增强子和具有功能性剪接供体和受体位点的内含子。载体可含有位于结构基因下游的转录终止区来提供有效终止。可从与启动子序列相同的基因获得或可从不同的基因获得终止区。
d.赋形剂和疫苗的其他组分
疫苗可还包含药学上可接受的赋形剂。药学上可接受的赋形剂可以是功能性分子，诸如媒介物、除isg15之外的佐剂、载体或稀释剂。所述药学上可接受的赋形剂可以是转染促进剂，其可包括表面活性剂如免疫刺激复合物(iscoms)、费氏(freunds)不完全佐剂、lps类似物(包括单磷酰酯a)、胞壁肽、苯醌类似物、囊泡如角鲨烯和角鲨烯、透明质酸、脂质、脂质体、钙离子、病毒蛋白质、聚阴离子、聚阳离子或纳米粒子或其他已知的转染促进剂。
所述转染促进剂是聚阴离子、聚阳离子(包括聚-l-谷氨酸(lgs))或脂质。转染促进剂是聚-l-谷氨酸盐，并且聚-l-谷氨酸盐可以小于6mg/ml的浓度存在于疫苗中。转染促进剂还可包括表面活性剂，如免疫刺激复合物(iscoms)、弗氏不完全佐剂、lps类似物(包括单磷酰脂质a)、胞壁酰肽、醌类似物以及囊泡(如角鲨烯和角鲨烯)，并且透明质酸还可结合基因构建体施用而使用。dna质粒疫苗还可包含转染促进剂，如脂质、脂质体(包括卵磷脂脂质体或本领域已知的其他脂质体，如dna-脂质体混合物(参见例如w09324640))、钙离子、病毒蛋白、聚阴离子、聚阳离子或纳米颗粒，或其他已知的转染促进剂。所述转染促进剂是聚阴离子、聚阳离子(包括聚-l-谷氨酸(lgs))或脂质。转染剂在所述疫苗中的浓度为小于4mg/ml、小于2mg/ml、小于1mg/ml、小于0.750mg/ml、小于0.500mg/ml、小于0.250mg/ml、小于0.100mg/ml、小于0.050mg/ml或小于0.010mg/ml。
药学上可接受的赋形剂可以是除isg15之外的佐剂。另外的佐剂可以是在替代性质粒中表达的或在疫苗中作为蛋白质与以上质粒组合递送的其它基因。佐剂可选自由以下各项组成的组：α-干扰素(ifn-α)、β-干扰素(ifn-β)、γ-干扰素、血小板衍生的生长因子(pdgf)、tnfα、tnfβ、gm-csf、表皮生长因子(egf)、皮肤t细胞虏获趋化因子(ctack)、上皮胸腺表达趋化因子(teck)、粘膜相关上皮趋化因子(mec)、il-12、il-15、mhc、cd80、cd86(包括信号序列缺失的il-15并且任选地包括来自ige的信号肽)。佐剂可以是il-12、il-15、il-28、ctack、teck、血小板衍生的生长因子(pdgf)、tnfα、tnfβ、gm-csf、表皮生长因子(egf)、il-1、il-2、il-4、il-5、il-6、il-10、il-12、il-18或其组合。
除isg15之外可以用作佐剂的其他基因包括编码以下的那些基因：mcp-1、mip-la、mip-1p、il-8、rantes、l-选择蛋白、p-选择蛋白、e-选择蛋白、cd34、glycam-1、madcam-1、lfa-1、vla-1、mac-1、pl50.95、pecam、icam-1、icam-2、icam-3、cd2、lfa-3、m-csf、g-csf、il-4、il-18的突变体形式、cd40、cd40l、血管生长因子、成纤维细胞生长因子、il-7、il-22、神经生长因子、血管内皮生长因子、fas、tnf受体、flt、apo-1、p55、wsl-1、dr3、tramp、apo-3、air、lard、ngrf、dr4、dr5、killer、trail-r2、trick2、dr6、半胱天冬酶ice、fos、c-jun、sp-1、ap-1、ap-2、p38、p65rel、myd88、irak、traf6、ikb、无活性的nik、sapk、sap-1、jnk、干扰素应答基因、nfkb、bax、trail、trailrec、trailrecdrc5、trail-r3、trail-r4、rank、rankligand、ox40、ox40ligand、nkg2d、mica、micb、nkg2a、nkg2b、nkg2c、nkg2e、nkg2f、tap1、tap2以及其功能性片段。
疫苗可还包含如1994年4月1日提交的美国序列号021,579中所描述的基因疫苗促进剂，所述专利文献以引用的方式全部并入。
可以根据待使用的施用方式来配制疫苗。可注射的疫苗药物组合物可以是无菌、不含热原并且不含微粒的。可以使用等渗制剂或溶液。用于等渗性的添加剂可以包括氯化钠、右旋糖、甘露醇、山梨醇和乳糖。疫苗可以包含血管收缩剂。等渗溶液可以包括磷酸盐缓冲盐水。疫苗还可包含稳定剂(包括明胶和白蛋白)。稳定剂可以允许制剂在室温或环境温度下稳定持续延长的时间段，所述稳定剂包括lgs或聚阳离子或聚阴离子。
3.疫苗接种方法
本发明还涉及一种在受试者中增加免疫应答的方法。增加免疫应答可用于治疗和/或预防受试者中的疾病，例如，如以下更详细描述的癌症。方法可包括向受试者施用本文所公开的疫苗。与仅施用抗原的受试者相比，施用疫苗的受试者具有增加或加强的免疫应答。在一些实施方案中，免疫应答可以增加约75％至约200％。另选地，施用疫苗的受试者中的免疫应答可以增加约90％至约130％。在仍其他替代性实施方案中，施用疫苗的受试者中的免疫应答可增加约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、约100％、约101％、约102％、约103％、约104％、约105％、约106％、约107％、约108％、约109％、约110％、约111％、约112％、约113％、约114％、约115％、约116％、约117％、约118％、约119％、约120％、约121％、约122％、约123％、约124％、约125％、约126％、约127％、约128％、约129％或约130％。
在其他实施方案中，施用疫苗的受试者中的免疫应答可增加至少1.5倍、至少2.0倍、至少2.5倍、至少3.0倍、至少3.5倍、至少4.0倍、至少4.5倍、至少5.0倍、至少5.5倍、至少6.0倍、至少6.5倍、至少7.0倍、至少7.5倍、至少8.0倍、至少8.5倍、至少9.0倍、至少9.5倍或至少10.0倍。
疫苗剂量可以是在1μg至10mg之间的活性组分/kg体重/时间，并且可以是20μg至10mg组分/kg体重/时间。可以每隔1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或31天施用疫苗。用于有效治疗的疫苗剂量的数目可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
a.癌症的治疗和预防
与仅施用抗原的受试者相比，施用疫苗的受试者可具有增加或加强的免疫应答。增加免疫应答可用于治疗和/或预防受试者中的疾病。疾病可以是癌症，例如，hpv相关癌症、hbv相关癌症、卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、脑癌、头颈癌、喉癌、肺癌、肝癌(livercancer)、胰腺癌、肾癌、骨癌、黑素瘤、转移性癌症、htert相关癌症、fap抗原相关癌症、非小细胞肺癌、血癌、食管鳞状细胞癌、子宫颈癌、膀胱癌、结直肠癌、胃癌(gastriccancer)、肛门癌、滑膜肉瘤(synovialcarcinoma)、睪丸癌、复发性呼吸道乳头状瘤病、皮肤癌、成胶质细胞瘤、肝肿瘤(hepatocarcinoma)、胃癌(stomachcancer)、急性髓性白血病、三阴性乳腺癌、以及原发性皮肤t细胞淋巴瘤。癌症可以是hpv相关癌症。
所述方法还可包括减小受试者中的已形成肿瘤或病变的大小。与施用不含isg15的疫苗相比，可使肿瘤的大小减小约50％至约100％、约60％至约100％、约70％至约100％、约80％至约100％、约90％至约100％、约50％至约95％、约60％至约95％、约70％至约95％、约80％至约95％、约90％至约95％、约50％至约90％、约60％至约90％、约70％至约90％，或约80％至约90％。与施用不含isg15的疫苗相比，可使肿瘤的大小减小约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％。
在一些实施方案中，与施用不含isg15的疫苗相比，施用所述疫苗可使肿瘤、可使肿瘤大小减小至少约10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。
所述方法还可包括与仅施用抗原的受试者相比增加受试者中的肿瘤消退。与施用不含isg15的疫苗相比，施用所述疫苗可使肿瘤消退增加约40％至约60％、约45％至约55％，或约50％。施用疫苗还可增加肿瘤消退的速率。与施用不含isg15的疫苗相比，施用所述疫苗可进一步使受试者中的肿瘤消退达到约80％至约100％、约85％至约100％、约90％至约100％、约95％至约100％、约80％至约95％、约85％至约95％、约90％至约95％、约80％至约90％，或约85％至约90％。与施用不含isg15的疫苗相比，施用疫苗的受试者中的肿瘤消退可以是约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％，或约100％。施用疫苗的受试者中的肿瘤消退还可以是约90％或约100％。
在一些实施方案中，与施用不含isg15的疫苗相比，施用所述疫苗可使肿瘤消退增加至少约10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。
所述方法还可包括预防施用疫苗的受试者中的癌症或肿瘤生长。所述预防可使得施用疫苗的受试者在将来的癌症中存活下来。换句话讲，疫苗向施用疫苗的受试者提供针对癌症的保护。与施用不含isg15的疫苗相比，施用所述疫苗的受试者可具有约90％至约100％的癌症存活率。与施用不含isg15的疫苗相比，施用所述疫苗的受试者可具有约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％，或约100％的癌症存活率。
b.治疗和预防感染性疾病
与仅施用抗原的受试者相比，施用疫苗的受试者可具有增加或加强的免疫应答。增加免疫应答可用于治疗和/或预防受试者中的疾病。疾病可以是感染性疾病，例如病毒感染和细菌感染。细菌感染可以是炭疽细菌、耐抗生素细菌、致病细菌、食物中毒细菌、传染性细菌、沙门氏菌属(salmonella)细菌、葡萄球菌属细菌、链球菌属细菌或破伤风细菌。细菌可以是分枝杆菌(mycobacteria)、破伤风梭菌(clostridiumtetani)、鼠疫杆菌(yersiniapestis)、炭疽芽孢杆菌(bacillusanthracis)、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistantstaphylococcusaureus)(mrsa)或者艰难梭菌(clostridiumdifficile)。细菌可以是结核分支杆菌、单核细胞增多性李斯特菌(listeriamonocytogenes)、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒。
病毒感染可以是乳头瘤病毒，例如人乳头瘤病毒(hpv)、人免疫缺陷病毒(hiv)、脊髓灰质炎病毒、乙型肝炎病毒(hbv)、丙型肝炎病毒(hcv)、天花病毒(重型天花和轻型天花)、痘苗病毒、流感病毒、鼻病毒、登革热病毒、马脑炎病毒、风疹病毒、黄热病病毒、诺沃克病毒(norwalkvirus)、甲型肝炎病毒、人t-细胞白血病病毒(htlv-i)、多毛细胞白血病病毒(htlv-ii)、加州脑炎病毒、汉坦病毒(hantavirus)(出血热)、狂犬病病毒、埃博拉热病毒(ebolafevervirus)、马尔堡病毒(marburgvirus)、麻疹病毒、腮腺炎病毒、呼吸道合胞体病毒(rsv)、单纯性疱疹1(口腔疱疹)、单纯性疱疹2(生殖器疱疹)、带状疱疹(水痘-带状疱疹，也称为水痘)、巨细胞病毒(cmv)(例如，人cmv)、爱泼斯坦-巴尔病毒(epstein-barrvirus)(ebv)、黄病毒、口蹄疫病毒、基孔肯亚病毒(chikungunyavirus)、拉沙病毒(lassavirus)、沙粒病毒、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(lcmv)或致癌病毒。病毒感染可以是lcmv。
所述方法还可包括预防感染性疾病在施用疫苗的受试者中的有害影响。所述预防可使得施用疫苗的受试者在感染性疾病中存活下来。换句话讲，疫苗向施用疫苗的受试者提供针对感染性疾病的保护。与施用不含isg15的疫苗相比，施用所述疫苗的受试者可具有约90％至约100％的感染性疾病存活率。与施用不含isg15的疫苗相比，施用所述疫苗的受试者可具有约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％，或约100％的感染性疾病存活率。
c.施用
所述疫苗可根据药物领域中的技术人员熟知的标准技术来配制。这类组合物可通过医学领域技术人员熟知的技术以考虑到如具体受试者中的年龄、性别、体重和条件及施用途径的剂量来施用。受试者可以是哺乳动物，如人、马、牛、猪、绵羊、猫、狗、大鼠或小鼠。
可以预防性地或治疗性地施用疫苗。在预防性施用中，可以足以诱导免疫应答的量施用疫苗。在治疗性应用中，以足以引起治疗效果的量向有需要的受试者施用疫苗。足以达到此目标的量定义为“治疗有效剂量”。对于这种用途有效的量取决于(例如)所施用的疫苗方案的具体组成、施用方式、疾病的阶段和严重程度、患者的总体健康状况以及处方医师的判断。
可以通过如文献中所描述的本领域熟知的方法来施用疫苗，所述文献如下：donnelly等(ann.rev.immunol.15:617-648(1997))；felgner等(美国专利号5,580,859，1996年12月3日发布)；felgner(美国专利号5,703,055，1997年12月30日发布)；以及carson等(美国专利号5,679,647，1997年10月21日发布)，所有所述文献的内容以引用的方式整体并入本文。可以(例如)使用疫苗枪将疫苗的dna与可以施用至个体的颗粒或珠粒进行复合。本领域的技术人员将知道药学上可接受的载体(包括生理学上可接受的化合物)的选择取决于(例如)表达载体的施用途径。
可以经由多种途径来递送疫苗。典型的递送途径包括肠胃外施用，例如，皮内、肌内或皮下递送。其他途径包括口服施用、鼻内和阴道内途径。特别是对于疫苗的dna来说，可以将疫苗递送至个体的组织的间隙空间(felgner等，美国专利号5,580,859和5,703,055，所有所述专利的内容以引用的方式整体并入本文)。还可以将疫苗施用至肌内，或可以经由皮内或皮下注射或经皮(如通过离子电渗疗法)施用。还可以采用疫苗的表皮施用。表皮施用可以涉及机械地或化学地刺激表皮的最外层，以刺激对刺激物的免疫应答(carson等，美国专利号5,679,647，所述专利的内容以引用的方式整体并入本文)。
还可以配制疫苗，用于经由鼻通道施用。适合用于经鼻施用的制剂(其中载体是固体)可以包括具有(例如)在约10微米至约500微米范围中的颗粒大小的粗糙粉末，所述粗糙粉末以其中采用鼻吸的方式来施用，即，通过鼻道从靠近鼻子的粉末的容器中快速吸入。制剂可以是鼻用喷雾剂、滴鼻剂或通过喷雾器进行气雾剂施用。制剂可以包含疫苗的水性溶液或油性溶液。
疫苗可以是液体制剂，如混悬剂、糖浆或酏剂。疫苗还可以是用于肠胃外、皮下、皮内、肌内或静脉内施用(例如，可注射施用)的制剂，如无菌混悬剂或乳剂。
疫苗可以掺入脂质体、微球体或其他聚合物基质中(felgner等，美国专利号5,703,055；gregoriadis,liposometechnology,第i卷至第iii卷(第2版，1993)，所述文献的内容以引用的方式整体并入本文)。脂质体可以由磷脂或其他脂质组成，并且可以是制造和施用相对简单的无毒的、生理学上可接受的和可代谢的载体。
可以经由电穿孔，(如)通过美国专利号7,664,545中所描述的方法来施用疫苗，所述专利的内容以引用的方式并入本文。电穿孔可以通过美国专利号6,302,874、5,676,646、6,241,701、6,233,482、6,216,034、6,208,893、6,192,270、6,181,964、6,150,148、6,120,493、6,096,020、6,068,650和5,702,359中所描述的方法和/或装置来进行，所述专利的内容以引用的方式整体并入本文。可通过微创设备来进行电穿孔。
微创电穿孔设备(“mid”)可以是用于将以上所描述的疫苗和相关流体注射至身体组织中的装置。所述设备可包括中空针、dna盒和流体递送部件，其中所述设备适于在使用中致动流体递送部件，以便在将针插入身体组织中的过程中同时(例如，自动地)将dna注射至所述身体组织中。这具有以下优点：在插入针的同时逐渐注射dna和相关流体的能力导致通过身体组织的流体的更均匀分布。由于注射的dna分布在较大面积上，可减少注射过程中经受的疼痛。
mid可在不使用针的情况下将疫苗注射至组织中。mid可将疫苗作为小的流或射流以使得疫苗穿透组织的表面并且进入下层组织和/或肌肉的力进行注射。小的流或射流之后的力可由压缩气体(如在几分之一秒内通过微小孔的二氧化碳)的膨胀提供。微创电穿孔设备的实例和使用它们的方法在公布的美国专利申请号20080234655、美国专利号6,520,950、美国专利号7,171,264、美国专利号6,208,893、美国专利号6,009,347、美国专利号6,120,493、美国专利号7,245,963、美国专利号7,328,064和美国专利号6,763,264中进行描述，每个所述专利的内容以引用的方式并入本文。
mid可包括产生无痛地穿透组织的液体的高速射流的注射器。这类无针注射器可商购获得。可在本文中利用的无针注射器的实例包括美国专利号3,805,783；4,447,223；5,505,697；及4,342,310中所述的那些，这些专利的内容各自以引用的方式并入本文。
可以使用无针注射器将呈适用于直接或间接电转运形式的所需的疫苗引入(例如注射)至待治疗的组织中，通常通过将组织表面与注射器接触，以便以足以导致疫苗渗透至组织中的力致动药剂射流的递送。例如，如果待治疗的组织是粘膜、皮肤或肌肉，那么将药剂朝向粘膜或皮肤表面以足以导致药剂渗透穿过角质层并且进入真皮层中或分别进入下层组织和肌肉中的力进行喷射。
无针注射器非常适合于将疫苗递送至所有类型的组织，特别是递送至皮肤和粘膜。在一些实施方案中，无针注射器可以用于将含有疫苗的液体推送至表面并且进入受试者中的皮肤或粘膜中。可以使用本发明的方法治疗的各种类型的组织的代表性实例包括胰腺、喉、鼻咽、下咽部、口咽、唇、咽、肺、心脏、肾、肌肉、乳房、结肠、前列腺、胸腺、睾丸、皮肤、粘膜组织、卵巢、血管或其任何组合。
mid可具有将组织电穿孔的针电极。通过在多电极阵列(例如设置成矩形或正方形图案)中的多对电极之间脉冲来提供优于在一对电极之间脉冲的结果的改良的结果。例如，在标题为“needleelectrodesformediateddeliveryofdrugsandgenes”的美国专利号5,702,359中公开的是针阵列，其中多对针可在治疗性治疗过程中进行脉冲。在所述应用中(其以引用的方式并入本文，如同其全文陈述一样)，针安置在环形阵列中，但具有连接器和转换装置，从而实现相对对的针电极之间的脉冲。可使用用于将重组表达载体递送至细胞的一对针电极。这种设备和系统在美国专利号6,763,264中进行描述，所述专利的内容以引用的方式并入本文。另选地，可使用单针设备，所述设备允许dna注射和使用类似于正常注射针的单针电穿孔并且施加比通过目前所使用设备递送的电压低的电压的脉冲，从而减少患者经受的电感觉。
mid可包括一个或多个电极阵列。阵列可包括具有相同直径或不同直径的两个或多个针。针可均匀或不均匀地间隔开。针可介于0.005英寸与0.03英寸之间、0.01英寸与0.025英寸之间，或0.015英寸与0.020英寸之间。针的直径可以是0.0175英寸。针可间隔开0.5mm、1.0mm、1.5mm、2.0mm、2.5mm、3.0mm、3.5mm、4.0mm或更多。
mid可由脉冲发生器和在单个步骤中递送疫苗和电穿孔脉冲的两个或更多个针疫苗注射器组成。脉冲发生器可允许经由闪存卡操作的个人计算机灵活地编程脉冲和注射参数，以及电穿孔和患者数据的全面记录和储存。脉冲发生器可在短的时间段期间递送多种伏特脉冲。例如，脉冲发生器可递送100ms持续时间的三个15伏特脉冲。所述mid的实例是inoviobiomedicalcorporation的elgen1000系统，所述系统在美国专利号7,328,064中进行描述，所述专利的内容以引用的方式并入本文。
mid可以是cellectra(inoviopharmaceuticals,plymouthmeetingpa)设备和系统，其是便于将大分子(诸如dna)引入身体或植物中选定组织的细胞中的模块化电极系统。模块化电极系统可包括多个针电极、皮下针、提供从可编程恒流脉冲控制器至多个针电极的导电链路的电连接器，以及电源。操作者可以抓住固定在支撑结构上的多个针电极并将它们坚固地插入到身体或植物中所选定的组织中。然后经由皮下针将大分子递送到选定组织中。启动可编程的恒定电流脉冲控制器，并将恒定电流电脉冲施加到多个针电极中。所施加的恒流电脉冲促进将大分子引入多个电极之间的细胞中。由于细胞的过度加热造成的细胞死亡通过借助于恒流脉冲限制组织中的功率消耗而得以最小化。cellectra设备和系统在美国专利号7,245,963中进行描述，所述专利的内容以引用的方式并入本文。
mid可以是elgen1000系统(inoviopharmaceuticals)。elgen1000系统可包括提供中空针的设备；和流体递送部件，其中装置适于在使用中致动流体递送部件，以便在将针插入身体组织中的过程中同时(例如，自动地)将流体(本文所描述的疫苗)注射至所述身体组织中。优点是：在插入针的同时逐渐注射流体的能力导致通过身体组织的流体的更均匀分布。还据信，由于注射的流体的体积分布在较大面积上，减少了在注射过程中经受的疼痛。
此外，流体的自动注射有助于所注射流体的实际剂量的自动监测和配准。可以根据需要出于文件编制目的通过控制单元来储存这一数据。
应理解，注射速率可以是线性或非线性的，并且可在已经将针插入穿过待治疗的受试者中的皮肤之后并且在将所述针进一步插入身体组织中时进行注射。
可通过本发明的装置将流体注射至其中的适合组织包括肿瘤组织、皮肤或肝组织，但也可以是肌肉组织。
装置还包括用于引导针插入身体组织中的针插入部件。通过针插入的速率来控制流体注射的速率。这具有以下优点：既可以控制针插入，又可以控制流体的注射，以使得可以根据需要使插入速率与注射速率相匹配。它还使装置更易于用户操作。如果需要，可以提供用于将针自动地插入身体组织中的部件。
用户可以选择何时开始流体的注射。然而，理想地，在针的尖端到达肌肉组织时开始注射，并且装置可包括用于感测针何时插入至足以开始注射流体的深度的部件。这意味着当针达到所需深度(其将通常是肌肉组织开始处的深度)时，可以提示以自动地开始流体的注射。肌肉组织开始处的深度可以(例如)采用为预设针插入深度(如4mm的值)，所述深度将被认为是对于针穿过皮肤层来说是足够的。
感测部件可包括超声探针。感测部件可包括用于感测阻抗或电阻的变化的部件。在这种情况下，部件可不如此记录针在身体组织中的深度，而将相反适于随着针从不同类型的身体组织移动至肌肉中来感测阻抗或电阻的变化。这些替代方案中的任一个提供相对准确和简单地操作的感测可开始注射的部件。还可根据需要记录针的插入深度，并且所述深度可以用于控制流体的注射，以使得根据正被记录的针的插入深度来确定待注射的流体的体积。
装置可还包括：用于支撑针的底座和用于在其中接纳底座的壳体，其中底座可相对于壳体移动，以使得当底座相对于壳体处于第一后方位置时，针缩回壳体内，并且当底座在壳体内处于第二前方位置时，针延伸出壳体外。由于壳体可以在患者的皮肤上对准，并且然后可以通过相对于底座移动壳体来将针插入患者的皮肤中，所以这对于用户来说是有利的。
如上所述，希望实现流体注射的受控速率，以使得在将针插入皮肤中时，流体在针的长度上均匀分布。流体递送部件可包括适于以受控速率注射流体的活塞驱动部件。可以(例如)通过伺服马达来激活活塞驱动部件。然而，可通过在轴向方向上相对于壳体移动的底座来致动活塞驱动部件。应理解，可以提供用于流体递送的替代装置。因此，(例如)可以提供可以被挤压用于以受控或非受控速率流体递送的封闭容器来代替注射管和活塞系统。
以上所描述的装置可以用于任何类型的注射。然而，设想到它在电穿孔的领域中尤其有用，并且因此它可还包括用于向针施加电压的部件。这允许针不仅用于注射，而且还用作电穿孔过程中的电极。这一点是尤其有利的，因为它意味着电场被施加至与所注射的流体相同的面积上。电穿孔在传统上存在的问题在于很难使电极与先前注射的流体准确对准，且因此使用者已倾向于在较大区域注射体积大于所需的流体且在较大区域施加电场以试图保证注射物质与电场之间重叠。使用本发明，可减少所注射流体的体积和所施加电场的大小，同时实现电场与流体之间的良好配合。
本发明具有多个方面，所述方面通过以下非限制性实施例说明。
4.实施例
实施例1
用于实施例2-6的材料和方法
dna构建和表达:使用小鼠isg15的genbank登录号q64339来合成编码野生型isg15(wtisg15)的dna构建体。突变型isg15(mutisg15)是wtisg15的变体，所述变体在其c末端缀合位点(lrlrgg(seqidno:12)处具有至aaaagg(seqidno:13)的点突变。所有构建体均含有插入在基因5’端的高效免疫球蛋白e(ige)前导序列。构建体通过商业途径合成并且进行优化，如先前在以下文献中所述那样：villarrealdo,wisemc,waltersjn,reuschelel,choimjobeng-adjein等alarminil-33actsasanimmunoadjuvanttoenhanceantigen-specifictumorimmunity.cancerres2014；74:1789-800(villarreal等)；和shedlockdj,avilesj,talbottkt,wongg,wusj,villarrealdo等inductionofbroadcytotoxictcellsbyprotectivednavaccinationagainstmarburgandebola.molther2013；21:1432(shedlock等)，这些文献均以引用的方式整体并入。含有e6和e7抗原的hpv16质粒如先前在在以下文献中所述那样制备：yanj,reichenbachdk,corbittn,hokeyda,ramananthanmp,mckinneyka等,inductionofantitumorimmunityinvivofollowingdeliveryofanovelhpv-16dnavaccineencodingane6/e7fusionantigen(yan等).vaccine2009；27:431-40，所述文献以引用的方式整体并入。两种isg15构建体的体外表达通过蛋白质印记(wb)分析使用确认。将人横纹肌肉瘤(rd)细胞保持在杜氏改良型伊格尔培养基(dulbecco’smodifiedeagle’smedium)(lifetechnologies,grandislandnyusa)中并且补充有10％热灭活的胎牛血清以及青霉素和链霉素。在每孔接种3.0x105个细胞之后，根据制造商方案使用neofectin(neobiolabcambridgema)进行转染。用2ug的包括pvax1空载体主链作为阴性对照的各dna构建体转染细胞。在48小时孵育之后，收集细胞上清液并且用冷的pbs洗涤细胞。在离心之后，使用细胞裂解缓冲液(cellsignalingtechnologydanvers,ma)和不含edta的蛋白酶抑制剂混合液(sigma-aldrichst.louis,mo)裂解细胞。将细胞裂解液在具有mes缓冲液(lifetechnologiesgrandislandnyusa)的10％tris-醋酸盐凝胶上运行并且转移到pvdf膜(millipore,darmstadt,germany)上。使用odyssey封闭缓冲液(licor,lincoln,nebraska)在室温下将膜封闭三小时，然后在兔抗小鼠isg15(cellsignalingtechnologydanvers,ma)和作为负载对照的小鼠抗人β-肌动蛋白(sigma-aldrichst.louis,mo)存在下在4℃下过夜探测。在用pbs-吐温洗涤之后，在室温下添加第二山羊抗小鼠irdye680rd和山羊抗兔irdye800cw(li-cor,lincoln,nebraska)，持续1小时。然后将膜洗涤并且在odysseyclx(licor,lincoln,nebraska)上成像。此外，还在转染后48小时收集上清液并且通过使用circulex小鼠isg15elisa试剂盒(mblinternational)根据制造商方案检查细胞因子分泌。使用bioteckel312ebio-kinetics读取器(biotekus,winooski,vt)测量450nm下的光密度。所有上清液一式两份地进行测试，每个质粒具有两个独立的上清液样品。
动物：所有动物根据nih和宾夕法尼亚大学实验动物护理和使用委员会指南(universityofpennsylvaniainstitutionalanimalcareandusecommitteeguidelines)进行和供养。雌性c57bl/6(h-2b)8周龄小鼠和h2bb6.129s7-rag1tm1mom/j小鼠(rag1ko)购自jackson实验室。
动物免疫：在胫骨前肌中肌内(i.m.)免疫所有小鼠。免疫后立即使用cellectra自适应恒定电流电穿孔设备(inoviopharmaceuticals)在相同位点递送体内电穿孔(ep)，如先前在shedlock等中所述。用5μgpvax1和伴有或不伴有11μgwtisg15和mutisg15的5μghpv16构建体免疫小鼠。所有研究均重复至少两次。
elispot测定：在最终免疫后7天收获脾并且进行处理，如先前在villarreal等和shedlock等中所述。在收获和处理脾之后，进行ifnγelispot测定以确定来自免疫小鼠的抗原特异性细胞因子分泌，如先前在villarreal等；shedlock等；和yan等中详细所述那样。hpv16ag特异性t细胞应答通过用e6或e7汇集肽(2.5μg/ml最终浓度的肽)刺激脾细胞测量。e7汇集肽含有来自h-2b背景的cd8t细胞免疫显性hpv16dbe749-57表位(rahynivtf)。
流式细胞术：从脾和外周血中分离淋巴细胞并且对所述淋巴细胞进行处理，如先前在以下文献中所述那样：villarreal等；shedlock等；和angelosnatojm,blackburnsd,crawforda,wherryej.progressivelossofmemorytcellpotentialandcommitmenttoexhaustionduringchronicviralinfection.jvirol2012；86:8161-70，所述文献以引用的方式整体并入。用cd8、klrg1和hpv16h-2dbe749-57的mhci类肽四聚体(rahynivtf)(mblinternational)染色淋巴细胞，如先前在以下文献中所述那样：villarreal等，和duikerens,fransenmf,redekera,wielesb,platenburgg,krebberwj等vaccine-inducedeffector-memorycd8+tcellresponsespredicttherapeuticefficacyagainsttumors.jimmunol2012；189:3397-403，所述文献以引用的方式整体并入。在用hpv16e7肽dbe7(rahynivtf)(2.5μg/ml最终浓度的肽)或e7汇集肽离体刺激5小时之后进行细胞内细胞因子染色以评估cd4t应答。在用于测量脱粒的培养中，在刺激时间期间添加抗-cd107a(fitc；克隆1d4b；biolegend)以捕集通过暴露于刺激诱导的ag特异性细胞脱粒。然后对细胞进行固定和染色，如在以下文献中任何地方描述的：villarreal等和villarrealdo,waltersj,laddydj,yanj,weinerdb.multivalenttbvaccinestargetingtheesxgenefamilygeneratepotentandbroadcell-mediatedimmuneresponsessuperiortobcg.humvaccinimmunother2014；10:2188-98，所述文献以引用的方式整体并入。以下抗体用于表面染色：live/dead可固定紫色死细胞染色试剂盒(invitrogen)、cd4(fitc；克隆rm4-5；ebioscience)、cd8(apc-cy7；克隆53-6.7；bdbiosciences)、nk1.1(fitc；克隆pk136；biolegend)；cd49b(fitc；克隆dx5；ebioscience)。对于细胞内染色，使用以下抗体：ifnγ(apc；克隆xmg1.2；biolegend)、tnfα(pe；克隆mp6-xt22；ebioscience)、cd3(percp/cy5.5；克隆145-2c11；biolegend)、il-2(pecy7；克隆jes6-sh4；ebioscience)。使用lsrii流式细胞仪(bdbiosciences)收集所有数据并且使用flowjo软件(treestar,ashland,or)和spicev5.3(免费获自http://exon.niaid.nih.gov/spice/)来分析。使用flowjo软件进行布尔选通(booleangating)以检查来自接种动物的t细胞的多功能性。
肿瘤细胞系：tc-1细胞系是philadelphia,pa宾夕法尼亚大学的yvonnepaterson博士亲切给予的赠送。tc-1细胞系是充分表征的肺上皮无限增殖化细胞系、组成型地表达e6和e7并且具有高度致肿瘤性。简而言之，tc-1细胞购自美国典型培养物保藏所并且如先前所述培养。
体内治疗性研究：将b6小鼠分成各自10只小鼠的四组，并且将5x104个tc-1细胞皮下植入到每只小鼠的右侧腹中。在肿瘤植入后第4天，分别用pvax1、hpv16、hpv16/wtisg15、hpv16/mutisg15肌内/电穿孔地免疫每组的小鼠，并且在第11、第18和第25天进行加强。使用电子卡尺测量肿瘤大小[肿瘤体积＝1/2(长度x宽度2)]。每周两次监测小鼠的肿瘤生长并且进行测量，如先前在villarreal等和yan等中所述那样。根据宾夕法尼亚大学实验动物护理指南，当肿瘤大小达到18-20mm时处死小鼠。
体内cd8t细胞消耗研究：在治疗性疫苗接种期间，在肿瘤接种前1天用200μg抗-cd8(53-6.72，bioxcell)腹膜内注射b6小鼠并且在肿瘤接种后每三天重复一次。成功的t细胞消耗通过外周血单核细胞的流式细胞术分析确认。
t细胞纯化和过继性转移：在不具有肿瘤的小鼠中在最终免疫后1周从疫苗接种的b6小鼠的脾细胞中分离cd8t细胞(图2a)。对于过继性转移，将于200μlpbs中的～4x106cd8t细胞通过尾静脉静脉内注射到每只h2bb6.129s7-rag1tm1mom/j小鼠中。
统计分析：通过匹配、双尾、非配对学生t检验完成组分析以分析此研究中产生的所有定量数据的统计显著性。p<0.05视为统计学上显著的。误差线指示sem并且所有测试使用prism软件(*,p<0.05；**,p<0.01；***,p<0.001与hpv16免疫相比)进行。
实施例2
isg15构建体的设计和表达
使用检索自genbank(登录号：q64339)的具有若干种修饰的小鼠isg15序列生成野生型isg15(wtisg15)佐剂构建体(图1a)。isg15含有c末端lrlrgg基序，其是为isg15在称为isg化的过程中缀合至多种靶蛋白质所需的。因此，使isg15缀合序列位点突变(lrlrgg至aaaagg)以生成不能够缀合的突变体isg15(mutisg15)(图1a)。这种突变将评估游离isg15增强独立于isg化的疫苗诱导的免疫的能力。对两种isg15构建体进行基因优化并且将其亚克隆到改进的pvax1哺乳动物表达载体中(图1b)。为了验证两种isg15编码构建体的表达，用每种载体单独地转染人横纹肌肉瘤(rd)细胞并且通过wb检查。如图1c中所示，对于转化后48小时收获的细胞裂解液中的每种，使用抗-isg15单克隆抗体(mab)用于检测，观察到～15kda游离isg15。作为阴性对照，在pvax1组中未能检测到isg15表达。接下来，通过酶联免疫吸附测定(elisa)，从转染rd细胞48小时后获得的细胞上清液监测到游离isg15的分泌。作为预测，与wtisg15(4.4ng/ml)相比，来自mutisg15转染的rd细胞的上清液具有较高浓度的可检测分泌的游离isg15(7.2ng/ml)(图1d)。这支持了以下观点：通过使isg15的缀合基序突变，更多未缀合的isg15将是可得的并且分泌到细胞外环境。
实施例3
用isg15佐剂的免疫诱导强力的hpve7特异性cd8t细胞免疫应答。
为了评估isg15的免疫原性特性，使用ifnγelispot测定来确定响应于含有cd8免疫显性表位h-2-dbe749-57(e7)的e7汇集肽的疫苗诱导的e7特异性ifnγ分泌细胞的数目。免疫方案示出在图2a中。简而言之，以两周为间隔对b6小鼠组(n＝4-5/组)如下地进行疫苗接种两次：(i)hpv16dna/ep；(ii)hpv16/wtisg15dna/ep；(iii)hpv16/mutisg15dna/ep；和(iv)pvax1/ep。与单独hpv16免疫组(～66sfc/百万个脾细胞)相比，hpv16与wtisg15的共施用使得e7特异性ifnγ应答增加3.5倍(～230sfc/百万个脾细胞)。isg15是缀合至靶蛋白的遍在蛋白样蛋白质并且是控制某些病毒感染和细菌感染的关键。已知除了isg15的缀合形式，isg15以未缀合形式(游离isg15))存在并且还可在免疫调节方面或感染期间起重要作用。因此，在相同实验中，我们通过用脱离于缀合的突变形式的isg15免疫小鼠检查了疫苗诱导的诱导是否独立于缀合。有趣的是，类似于wtisg15，与单独hpv16组相比，mutisg15疫苗接种组展示出总e7特异性应答的类似(～4倍)增加，这表明isg15还可独立于缀合诱导其效应。未发现e6特异性疫苗诱导的应答的相对较高的诱导水平。总起来看，细胞因子样分子isg15可充当佐剂来增强并且刺激e7特异性th1介导的cd8t细胞应答。此外，这种数据证实抗原(ag)特异性应答最可能归因于游离isg15。
实施例4
isg15佐剂诱导稳健的多功能性hpve7特异性细胞介导的应答
考虑到cd8+t细胞免疫应答被认为是促进肿瘤的控制和消除所必要的，我们进一步检查了来自疫苗接种的小鼠的e7特异性cd8t细胞群体响应于dbe749-57肽刺激分泌ifnγ、tnfα和il-2的功能性分布。细胞内细胞因子多参数流式细胞术分析的门控策略示出在图3a中。最终疫苗接种后一周，所有测试的疫苗接种方案诱导产生所有三种效应细胞因子的可检测的cd8t细胞应答(图3)。与无佐剂组相比，两个isg15疫苗方案均诱导产生总ifnγ(wtisg15，0.68％；mutisg15，0.92％)(图3b)和总ifnγ(wtisg15，0.42％；mutisg15，0.54％)(图3c)的大量e7特异性cd8t细胞。然而，isg15仅诱导分泌il-2的ag特异性cd8t细胞的较小增加(图3d)重要的是，大量的e7特异性cd8t细胞是多功能性的，在疫苗接种后7天isg15免疫组在脾中引起显著较高频率的产生单独ifnγ或双重ifnγ+tnfα+的cd8t细胞(图3e)。在isg15处理组中还存在三阳性ifnγ+tnfα+il-2+cd8分泌细胞的适度增加。因为isg15可对nk细胞具有影响，所以我们监测了疫苗诱导的nk应答。在用isg15疫苗接种之后未看见显著变化(图7a)。此外，isg15的施用未在离体e7汇集肽刺激之后增加疫苗诱导的cd4t细胞应答(图7b)。
鉴于细胞毒性cd8t淋巴细胞(ctl)是保护方面的关键组分，评估了同时经受脱粒和分泌效应细胞因子的佐剂诱导的ctl应答的溶细胞特性(图5)。与单独hpv16组相比，用免疫佐剂isg15疫苗接种的组显示出较高百分比的脱粒标记物cd107a(wtisg15，2.4％；mutisg15，3.1％)(图4a)。更有趣地，含hpv16佐剂的疫苗引起显著较高频率的多功能性ctl，大量表示细胞显示出一种、两种和三种免疫学功能(图4b-c)。值得注意的是，与仅施用hpv16相比，isg15处理组显示出显著较高频率的共表达cd107a+ifnγ+tnfα+(wtisg15，0.35％；mutisg15，0.43％)的cd8t细胞(图4c)。总起来说，高频率的分泌抗病毒细胞因子的效应细胞指示isg15(1)细胞因子样特性，(2)增强疫苗效能的佐剂效应以及(3)其诱导功能性效应ctl免疫的潜力。总体上，本文的重要发现是表达不能够缀合的mutisg15的dna质粒维持了wt形式中显示出的佐剂效应，表明isg化很可能不是为cd8t细胞的免疫调节所需的。
实施例5
isg15佐剂扩增稳健的ag特异性效应记忆cd8t细胞应答
还研究了可与疫苗诱导的hpv肿瘤控制相关的四聚体特异性cd8t应答。为此，用前述疫苗接种制剂和图2a中的方案对不具有肿瘤的b6小鼠免疫。最终免疫后一周，利用脾和血液中的hpv16e749-57h2-db-rahynivtf四聚体的cd8表位特异性检查ag特异性cd8t细胞应答的幅度和亚组分化(图5)。与单独hpv16组相比，wtisg15和mutisg15构建体能够显著增加脾中的dbe7四聚体特异性cd8t细胞应答(图5a和5b)。此外，两种isg15质粒的递送还显著扩增外周血中的dbe7四聚体特异性cd8t细胞的数量，推断出肿瘤靶标特异性ctl的肿瘤转移(图5e)。wtisg15和mutisg15组内血液中的e7四聚体t细胞的频率与无佐剂组相比分别高4倍至5.5倍。所述数据确认免疫佐剂isg15可扩增ag特异性cd8t细胞。
已表明效应记忆cd8t细胞是用于保护免疫的最佳亚组并且可预测针对肿瘤的治疗效果。效应记忆t细胞是癌症疫苗的焦点，因为其可引发快速的效应子功能并且快速迁移到感染位点或肿瘤位点。在此研究中，基于klrg1(效应记忆-teff)的表达标记物测量了dbe7mhci类四聚体疫苗诱导的效应/效应记忆cd8+t细胞亚组(图5)。与单独hpv16疫苗接种组相比，施用wtisg15使得脾中的teff细胞百分比增加～3倍(图5c和5d)。类似地，包含mutisg15还显著增强脾中的teff应答(图5d)。此外，如图5f中所示，在佐剂组中血液中teff细胞百分比显著较高。这些数据表明免疫佐剂isg15可增强e7特异性cd8t细胞应答的幅度和质量。
实施例6
isg15充当诱导抗肿瘤免疫的效应cd8t细胞免疫佐剂
接下来研究isg15在具有tc-1肿瘤的小鼠模型中的治疗效果。首先用tc-1肿瘤(5x104)细胞皮下接种初始受体b6小鼠(n＝10/组)，然后在肿瘤植入后四天(肿瘤已达到2mm的平均尺寸)进行hpv16、hpv16/wtisg15、hpv16/mutisg15或pvax1疫苗接种，随后以1周为间隔进行三次加强(图6a)。与单独hpv16疫苗接种组相比，用hpv16/wtisg15混合物免疫的小鼠中的肿瘤生长显著缓慢(图6b)。相比之下，pvax1对照组未显示出任何治疗效果，到第35天所有小鼠死亡。有趣地，与给予hpv16/mutisg15的小鼠相比，给予hpv16/mutisg15的小鼠显著诱导较佳的肿瘤控制，这可能归因于诱导较高的ctl应答。此外，与hpv16/wtisg15相比，hpv16/mutisg15组合快速诱导更多形成tc-1肿瘤的消退(图8)。肿瘤植入后42天时，与hpv16(1/10)或hpv16-wtisg15(2/10)相比，hpv16-mutisg15中6/10小鼠没有肿瘤(图8)。合起来看，isg15的佐剂特性证实对hpv具有肿瘤的小鼠的有效控制和治疗性治愈。
鉴于增强为靶向形成的预先存在的hpv感染必要的e7特异性-ctl应答的isg15佐剂特性，研究了isg15引起的cd8t细胞用于hpvtc-1肿瘤消除的重要作用。因此，在治疗环境中，通过以下方式来消耗cd8t细胞：在肿瘤接种前1天开始腹膜内注射商业抗-cd8抗体，并且在肿瘤植入后每三天重复一次(图6c)。结果揭示cd8消耗显著消除了isg15佐剂的治疗效果，并且所有小鼠在≤30天时死亡(图6d)。为了确认这些发现，在t细胞免疫缺陷b6rag1ko小鼠中进行cd8t细胞过继性转移实验。在接种tc-1细胞后4天，静脉内注射纯化自hpv16、hpv16/wtisg15和hpv16/mutisg15免疫小鼠(图2a)的脾细胞的4x106个cd8t细胞(图6e)。与hpv16和初始对照相比，接受wtisg15或mutisg15疫苗诱导的cd8t细胞的小鼠产生显著较缓慢的肿瘤生长(图6f)，这可能是由于其功能性ctl表型(图3和4)。合起来看，证明了在hpvtc-1治疗模型中isg15引起的cd8t细胞在延长存活率和控制肿瘤生长方面是必要的。
实施例1-6证实了isg15免疫佐剂特性增强ag特异性cd8t细胞肿瘤免疫的治疗功效。使用临床前hpv治疗激发模型来测试isg15在dna疫苗环境中的佐剂效应。此研究的主要结果是包含isg15可(i)增加多功能性ag特异性ctl应答；(ii)诱导效应子样记忆cd8t细胞亚组分化；(iii)具有抗肿瘤治疗效果；以及(iv)独立于缀合引起疫苗诱导的保护性免疫，进一步形成游离isg15细胞因子样特性。
实施例7
用于实施例8-10的材料和方法
小鼠：isg15-/-小鼠及其同基因野生型品系c57bl/6j获自jackson实验室(barharbor,me)并且繁殖和饲养在宾夕法尼亚大学hillpavilion动物设施中和ttuhscabilenelarc中。在具有无菌水和uv处理或高压灭菌的标准啮齿动物饲料条件下，将小鼠在亮/暗循环中放置12小时。所有小鼠实验根据ttuhsc和宾夕法尼亚大学的实验动物护理和使用委员会的规章、根据美国国立卫生研究院的指南进行。
细菌菌株：将lm菌株10403s培养在补充有50ug/ml链霉素的bhi(脑心浸液，cm1135，oxoidltd,hampshire,england)培养基中、在对数生长中期(0.6-0.8，在o.d.600)收获、等分样品用液n2快速冷冻，并且储存在-80℃下。lm储备液滴度通过以下方式测定：系列稀释解冻的储备液小瓶、将稀释液铺板到bhi-链霉素琼脂板上，并且在37℃下18-24小时后计数菌落形成单位数(cfu)。对于每个感染实验，冷冻储备液小瓶是新鲜解冻的，细菌通过离心沉淀并且将沉淀用1x磷酸盐缓冲盐水(pbs)洗涤两次。
体外lm感染：骨髓来源的巨噬细胞(bmm)的感染如先前在以下文献中所述那样进行：singh,r.,a.jamieson和p.cresswell,giltisacriticalhostfactorforlisteriamonocytogenesinfection.nature,2008.455(7217):第1244-7页(singh等)，所述文献以引用的方式整体并入。对于mrna分析，将bmm接种到组织培养处理皿上、过夜孵育并且用lm以10感染复数(moi)进行感染。洗涤感染的细胞、感染后30min添加庆大霉素并且处理细胞以便根据制造商说明书使用rneasy微型试剂盒(qiagen)进行rna分离。
体内lm感染：对于用以由qpcr和elisa确定细胞因子应答的初次感染研究，在用于200μl无菌1xpbs中的105cfulm腹膜内(i.p.)注射后三天，使6-8周龄c57bl/6和isg15-/-小鼠安乐死。为了确定isg15在poly(i:c)加重的李斯特菌病中的作用，用单独104cfulmi.p.感染c57bl/6j和isg15-/-小鼠或在lm感染后两天向所述小鼠i.p.施用150μgpoly(i:c)。在感染后第4天使所有小鼠安乐死并且提取脾。将脾处理成单细胞悬浮液、进行系列稀释、铺板到补充有50ug/ml链霉素的bhi琼脂板上，并且在37℃下过夜生长后计数菌落形成单位数。对于纵向感染研究，对6-8周龄c57bl/6j和isg15-/-小鼠i.p.注射于200μl无菌1xpbs中的104cfulm。在实验结束时，使小鼠安乐死并且进行处理以供细菌负载。如先前在singh中所述那样确定脾和肝中的lmcfu。在图1中，对小鼠i.p.注射于200μl1xpbs中的103、104和105cfulm并且在感染后第4天使所述小鼠安乐死。收获感染小鼠的脾和肝脏并且通过系列稀释单细胞悬浮液确定lm细菌负载量并且在于补充有50ug/ml链霉素的bhi琼脂上生长过夜后计数菌落形成单位数。在图2中，用103cfu减毒δactalm菌株dpl-4029感染6-8周龄c57bl/6和isg15-/-小鼠。随后用105cfulm的腹膜内注射激发这些小鼠以及初始wt和isg15-/-小鼠。激发后五天，使小鼠安乐死并且处理器官以用于流式细胞术分析和细菌负载确定
定量pcr：使用rneasyplus微型试剂盒(qiagen)将rna从脾细胞和骨髓来源的巨噬细胞分离。使用nanodrop分光光度计定量rna并且使用高容量cdna逆转录试剂盒(appliedbiosystems)将1ugrna转化为cdna。使用来自lifetechnologies的steponeplus实时系统与fastsybrgreen(appliedbiosystems)的组合用于qpcr分析。为了确定组之间靶基因的相对量，使用18srrna作为参照。
elisa：通过安乐死后的心穿刺取血收集血清并且在4℃下孵育30分钟后去除血凝块，然后进行离心。将血清样品进行1:40稀释并且根据制造商说明书使用小鼠elisaready-set-go！试剂盒(ebiosciences,sandiego,ca,usa)测定ifn-γ的水平。使用微板读取器(synergyht,biotek)获得o.d.450下的结果并且将结果在gen5(ver1.08)上分析。
流式细胞术分析：在图1-2中，将脾从小鼠中提取出并且放置在5ml完全培养基(corningcellgro；dmem1x；目录号15-013-cm)中。将脾机械地软化分离并且使其通过40um细胞网式过滤器(fisher，目录号22363549,22363547)以产生单细胞悬浮液。在室温下用ack裂解缓冲液处理细胞3-5分钟并且在1xpbs中洗涤三次。将细胞悬浮于完全培养基中并且使用beckmancoultervi-cellxr确定细胞计数。对于t细胞刺激，将2x106个细胞铺板于96孔圆底板中并且在37℃，5％co2下在莫能菌素(monensin)存在下用5ug/ml肽或pma/离子霉素刺激6小时。对于细胞表面染色，在用抗cd16/cd32(克隆93；14-0161-85)fc-封闭之后使用荧光染料标记的mab针对各种细胞表面标记物对脾细胞进行染色。所有样品在lsrii或lsrfortessa流式细胞仪(bectondickinsonbiosciences,sanjose,ca,usa)上获得，并且使用flowjo软件(v10,treestar)分析数据。在图3中，将脾细胞加入96孔板(1x106/孔)中并且在37c/5％co2下在蛋白质转运抑制剂混合液(布雷菲德菌素a(brefeldina)和莫能菌素)(ebioscience)的存在下根据制造商说明书用来自h-2b背景(dbnp396-404(np396))(invitrogen)的lcmv免疫显性lcmv表位刺激所述脾细胞，持续5-6小时。使用细胞刺激混合液(加上蛋白质转运抑制剂)(佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(pma)、离子霉素、布雷菲德菌素a和莫能菌素)(ebioscience)作为阳性对照并且使用r10培养基作为阴性对照。然后如由制造商说明书(bd,sandiego,ca)所述就表面和细胞内蛋白质对所有细胞染色。简言之，将细胞在facs缓冲液(含有0.1％叠氮化钠和1％fcs的pbs)中洗涤，之后用荧色物缀合的抗体进行表面染色。用facs缓冲液洗涤细胞，使用bdcytofix/cytopermtm(bd,sandiego,ca,usa)根据制造商方案进行固定和透化，然后进行细胞内染色。使用lsrii流式细胞仪(bdbiosciences)收集所有数据并且使用flowjo软件(treestar,ashland,or)和spicev5.2(免费获自http://exon.niaid.nih.gov/spice/)来分析。使用flowjo软件进行布尔选通(booleangating)以检查来自接种动物的t细胞的多功能性。通过在live/dead可固定的紫色死细胞染色试剂盒(invitrogen)上相对于前向散射(fsc-a)进行门控来移除死细胞。
质粒构建：使用小鼠isg15的genbank登录号q64339.4来合成isg15质粒dna构建体。isg15质粒dna构建体具有插入在基因5’端的高效免疫球蛋白e(ige)前导序列。构建体通过商业途径合成并且针对小鼠中的表达进行基因优化(密码子-和rna-优化)，并且然后亚克隆到(所有通过genscript,piscataway,nj进行)改进的pvax1哺乳动物表达载体(invitrogen,carlsbad,ca)中。如先前在以下文献中所述制备表达plcmv-np(np)的质粒：shedlock,d.j.等,ahighlyoptimizeddnavaccineconferscompleteprotectiveimmunityagainsthigh-doselethallymphocyticchoriomeningitisviruschallenge.vaccine,2011.29(39):第6755-62页(shedlock2013等)，所述文献以引用的方式整体并入。
质粒的转染和表达：体外isg15通过蛋白质印记(wb)分析确认。将293t细胞培养在6孔板中并且使用neofectin转染试剂(neobiolab)根据制造商方案用构建体转染所述293t细胞。四十八小时后，使用改进的细胞裂解缓冲液(cellsignaling)和完全蛋白酶抑制剂混合液片剂(roche)使细胞裂解并且收集细胞裂解液。使用抗-isg15抗体(cellsignaling)进行wb分析并且使用odyssey成像系统(li-cor)利用irdye800cw山羊抗兔抗体(li-cor)进行可视化。β-肌动蛋白充当负载对照并且使用irdye680山羊抗兔抗体(li-cor)进行可视化。此外，还执行间接免疫荧光显微镜法测定确认isg15dna构建体的表达。将横纹肌肉瘤(rd)细胞涂布于双孔室载玻片(bdbiosciences)上并且使其在具有5％co2的37孵育器中生长过夜至70％汇合度。使用turbofectintm8.0转染试剂(origene)根据制造商说明书用1μg的il-33构建体和对照质粒pvax(1μg/孔)转染细胞。四十八小时后，使用冰冷的甲醇将细胞在载玻片上固定10min。将细胞用抗-isg15小鼠单克隆抗体(cellsignaling)染色并且随后与alexa555缀合的抗大鼠二级抗体(cellsignaling)一起孵育。使用具有dapi(southernbiotechnology)的fluoromountg固定载玻片。通过荧光显微镜法(leicadm4000b,leicamicrosystemsinc,usa)分析图像并且使用spot高级软件程序(spottmdiagnosticinstruments,inc)进行定量。
疫苗接种和lcmv激发：在胫骨前肌中肌内(i.m.)免疫小鼠一次，如先前在villarreal等和shedlock等中所述那样。疫苗接种后立即使用cellectra自适应恒定电流电穿孔设备(inoviopharmaceuticals)在相同部位递送体内电穿孔。用10μgpvax1或伴有或不伴有11μgisg15构建体的10μgplcmv-np免疫小鼠(n＝5)。所有研究均重复至少三次。对于致死激发研究，用在30μl病毒稀释液(具有20％fbs和1xanti-anti(invitrogen,carlsbad,ca)的pbs)中的40xld50的lcmvarmstrong(如先前在shedlock2013等中所述)以i.c方式激发小鼠。将所有lcmv激发小鼠饲养于bsl-2设施中并且每天观察持续21天。
elispot测定：在免疫后21天收获脾以监测疫苗诱导的应答，如先前在villarreal等和shedlock等中所述那样。在收获和处理脾之后，进行ifnγelispot测定以确定来自免疫小鼠的抗原特异性细胞因子分泌，如先前在villarreal等和shedlock等中所述那样。
统计分析：运用学生t检验来比较由感染或疫苗接种诱导的细胞免疫应答的定量数据。通过应用rout法将统计显著的异常值从数据集去除。所有误差线指示sem并且所有测试使用prism软件(lajolla,ca)(*,p<0.05；**,p<0.01；***,p<0.001与np相比)进行。存活曲线通过对数秩(mantel-cox)检验分析。
实施例8
isg15对先天性免疫应答的影响
为了确定isg15在针对模型病原体单核细胞增多性李斯特菌(lm)的先天性免疫应答中的相关性，在野生型c57/bl6小鼠中在lm感染之后检查isg15基因表达。用105lmcfu感染小鼠并且在第3天感染峰值处使所述小鼠以及未感染小鼠组安乐死。将脾切除、处理成单细胞悬浮液，并且提取rna。在转化为cdna后，通过qpcr分析评估脾的isg15表达。在m-csf存在下使骨髓来源的巨噬细胞(bmm)分化并且用lm感染(n＝3/组)。在感染后的8小时和16小时后将bmm以及未感染对照裂解并且进行处理以供rna提取。在cdna转化后，评估bmm的isg15基因表达以及其e1活化酶的基因ube1l。在感染后第3天使用105lmcfu感染的野生型(n＝4)和isg15-/-小鼠(n＝5)安乐死并且收集血清以通过isg15elisa评估分泌的isg15蛋白的水平。用lm感染bmm，然后在感染后一小时用同种型对照或ifn-β封闭抗体处理(n＝3/组)。在实验结束时，裂解bmm、提取mrna、转化为cdna并且通过qpcr分析评估isg15基因表达。用单独104cfulmi.p.感染野生型(n＝4)和isg15-/-(n＝5)小鼠或在lm感染后两天向所述小鼠i.p.施用150μgpoly(i:c)(n＝3/组)。在感染后第4天使所有小鼠安乐死并且将脾切除并处理成单细胞悬浮液。将悬浮液进行系列稀释并且铺板到bhi-链霉素琼脂板上以测定菌落形成单位数(cfu)/个脾。用104cfulmi.p.感染野生型和isg15-/-小鼠(n＝3/组)并且在感染后第1、第3和第5天使其安乐死。将脾和肝脏从感染的小鼠中切除并且处理成单细胞悬浮液。将悬浮液进行系列稀释并且铺板到bhi-链霉素琼脂板上以测定菌落形成单位数(cfu)/个器官。通过添加lmcfu确定每只小鼠的脾和肝的总细菌负载量。为了确定对lm感染的易受性是否是剂量依赖性的，用对数范围的lmcfu剂量i.p.感染wt和isg15-/-小鼠(n＝5/组)。在感染后第4天，提取脾和肝脏、处理成单细胞悬浮液、进行系列稀释并且铺板到bhi-链霉素琼脂板上。制备出绘示了在用对数范围剂量感染后wt和isg15-/-的脾中的lmcfu的散点图。还制备出绘示了在用对数范围剂量感染后野生型和isg15-/-的肝脏中的lmcfu的散点图。用105cfulmi.p.感染野生型(n＝5/组)和isg15-/-小鼠(n＝3/组)并且在感染后第3天感染峰值处使其安乐死。将脾切除、处理成单细胞悬浮液，并且提取rna。在转化为cdna后，评估脾的促炎性细胞因子基因ifng的表达。ifn-γ的产生和分泌通过elisa分析在感染后第3天感染峰值处来自用105cfulm感染的wt和isg15-/-小鼠(n＝5/组)的血清来确认。使用蛋白质标准物计算血清中的ifn-γ蛋白质的量。*,p<0.05；**,p<0.01；***,p<0.001。
与未感染的对照小鼠相比，在第3天感染峰值处显著诱导了isg15mrna表达，在感染主要位点脾中具有高100倍的isg15表达。用lm感染骨髓来源的巨噬细胞(bmm)也产生isg15和编码isg15e1缀合酶的基因ube1l的短暂诱导。此外，在lm感染峰值处可在感染wt小鼠的血清中检测到分泌的isg15蛋白，而在isg15-/-对照中并未如此。在lm感染期间isg15的表达是i型ifn依赖性的，因为抗体介导的ifn-β封闭显著钝化了lm-感染的bmm中的isg15诱导(图1d)。这些数据表明isg15途径在lm感染期间被诱导并且依赖于i型ifn的产生。与病毒感染不同，i型ifn通过减弱针对lm的先天性和适应性应答而加剧某些细菌感染(包括李斯特菌病)。为了确定isg15是否介导李斯特菌病的i型ifn加剧，用lm感染isg15-/-小鼠并且通过施用dsrna模拟分子poly(i:c)诱导i型ifn。令人惊奇的是，isg15不是为i型ifn介导的李斯特菌病加剧所必需的并且两个独立实验表明isg15-/-小鼠可甚至更易受lm感染。isg15在针对lm的先天性免疫中的作用进一步通过时程感染来探究。感染后第1天，isg15-/-小鼠对lm的急性感染更具有抵抗力，如通过显著减少的细菌负荷证实的。然而，与野生型对应物不同，isg15-/-小鼠中的细菌负荷在第3天感染峰值处显著升高并且随后继续升高。因为先前研究显示出对lm具有剂量依赖性易受性，所以接下来确定此结果是否仅在初始感染剂量104cfu处是相关的。用103cfu至105cfulm的对数范围的感染剂量感染wt和isg15-/-小鼠。在接受最低剂量的lm(103cfu)的wt小鼠的脾中，仅40％的小鼠具有李斯特菌病的迹象。然而，80％的isg15-/-小鼠在其脾中具有可检测的lm水平。在接受最低剂量的wt和isg15-/-的肝中观察到类似结果，其中分别20％和100％的小鼠展示出李斯特菌病。在较高的起始剂量下也在isg15-/-小鼠的脾和肝中观察到显著增加的李斯特菌病。虽然nk细胞数是类似的(图1i)，但是isg15-/-小鼠中对急性lm感染的易受性增加确实与脾ifng表达和ifn-γ血清水平(清除lm感染中的必要促炎细胞因子)的显著降低相关。
实施例9
isg15对适应性免疫应答的影响
因为先前已报道lm毒性与针对lm的适应性免疫负相关，所以确定isg15缺陷是否损害针对lm的适应性免疫应答。在伴有或不伴有103cfu减毒lm菌株dpl-4029的之前感染下用105cfulmi.p.感染野生型(wt)和isg15-/-小鼠。在伴有和不伴有用佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(pma)(50ng/ml)和离子霉素(800ng/ml)的刺激下，对来自lm-感染的wt和isg15-/-小鼠的llo特异性ifnγ产生脾cd4+t细胞进行鉴定和分析。对针对lm的先天性和适应性应答期间的脾cd8+t细胞数和脾cd4+t细胞进行鉴定和分析。分析wt和isg15-/-小鼠的小鼠中、脾和肝脏中的总lm细菌负荷。对针对lm的先天性和适应性应答期间的脾髓样细胞进行鉴定和分析。lm感染期间的cd11chi髓样细胞的百分比和常规dc的脾细胞的总百分比。用1uglps刺激wt和isg15-/-脾6小时并且针对cd86、cd80的表达以及cd80和cd86的共表达通过流式细胞术评估与dc成熟相关联的标记物的表面表达。*,p<0.05；**,p<0.01；***,p<0.001；****,p<0.0001。
在之前用高度减毒的lm菌株(dpl-4029)感染之后，用毒性10403s菌株lm激发wt和isg15-/-小鼠并且在感染后第5天评估适应性免疫的发展。在lm激发后，isg15-/-小鼠生成类似数目的llo特异性脾cd4+t细胞。另外，wt小鼠与isg15-/-小鼠之间的脾cd4+和cd8+细胞的总体数目是相当的。然而，当评估总体细菌负载量时，isg15-/-小鼠似乎发起不太有效的针对lm的适应性免疫应答。有趣的是，这些缺陷是组织特异性的，因为在先前感染的小鼠中isg15-/-小鼠与wt小鼠之间的脾lm细菌负载量是相当的，这与脾t细胞数目一致。然而，先前感染的isg15-/-小鼠中的肝脏细菌负载量比先前感染的wt小鼠中的高大约100倍(图2g)。虽然这种结果表明isg15可能涉及肝脏免疫赦免，但是也可能是其他因素在起作用。针对lm的适应性应答改变可以归因于髓室中观察到的缺陷，因为isg15-/-小鼠的脾中观察到较大数目的髓样细胞，但是存在显著较少的有利于诱导肝脏的稳健t细胞应答的常规树突状细胞。此外，用lps刺激脾树突状细胞揭示isg15缺陷损害树突状细胞成熟，如通过共刺激分子cd80和cd86的表面水平降低所证实。这些结果表明isg15可能在通过增大抗原呈递细胞数目和增强功能来促进t细胞介导的适应性免疫方面是重要的。
实施例10
isg15作为佐剂用于增强免疫应答的作用
为了确定这些观察到的isg15的免疫调节特性是否可被治疗性地利用来增强免疫赦免位点的应答，通过递送isg15作为dna疫苗佐剂来增强t细胞介导的免疫来诱导野生型小鼠中的isg15过表达。通过蛋白质印迹分析检查isg15在293t细胞中的表达。通过抗-isg15mab检测蛋白质，并且通过免疫荧光显微镜法检测isg15的表达。在将空pvax和pvax-misg15转染在3t3细胞中(n＝3/组)之后通过条件培养基的elisa确认isg15的分泌。在伴有或不伴有isg15的情况下对b6小鼠(n＝5/组)免疫一次。21天后，将小鼠处死并且对脾进行处理以监测疫苗诱导的免疫应答。进行ifn-γelispot以检测针对lcmvdbnp396-404抗原(np396)与isg15(通过电穿孔用于im免疫时)的组合的抗原特异性免疫应答。使用多参数流式细胞术来测定多功能性cd8+t细胞细胞因子分布的百分比。np特异性cd8+t细胞的百分比作为分泌细胞因子的三阳性、双阳性、单阳性cd8+t细胞展示出。生成饼形图并且所述饼形图示出每种细胞因子亚群的相对比例。利用ep用10ug空载体对照质粒(pvax)或伴有或不伴有isg15佐剂的10uglcmv-npim免疫小鼠(n＝10/组)一次。在疫苗接种后21天时，用40xld50lcmv颅内激发小鼠并且分析动物存活率。将实验以独立实验形式进行至少三次。*,p<0.05；**,p<0.01；****,p<0.0001。
开发出体内哺乳动物isg15表达dna质粒。简而言之，将小鼠isg15基因克隆到受cmv启动子控制并且具有ige前导序列以实现分泌的pvax哺乳动物表达载体中。在用pvax-misg15转染293t细胞之后，细胞高效地表达出细胞内鼠类isg15，如通过蛋白质印迹分析和荧光显微镜法确定的。如先前所记载的，isg15蛋白存在于细胞质和细胞核中，如通过用核染色dapi的共定位测定的(图3c)。与空载体转染的细胞相比，由于包含ige前导序列，用pvax-misg15转染还使得小鼠isg15高效分泌到来自pvax-misg15转染的3t3细胞的培养上清液中。为了确定isg15是否可被治疗性地利用来增强cd8+t细胞介导的免疫，用isg15不相关的感染模型即颅内(i.c.)淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(lcmv)感染模型进行进一步的研究。lcmv感染模型是建立的模型以研究感染小鼠脑的cd8+t细胞应答。因此，为了表征isg15驱动的cd8+t细胞应答，在伴有或不伴有表达misg15的质粒下向小鼠组肌内施用表达lcmv结构蛋白np的质粒。与接受pvax-np或单独空pvax质粒的小鼠相比，接受在含misg15条件下施用的np疫苗的小鼠生成显著更多的dbnp396-40(np396)特异性ifn-γ斑点形成细胞(sfc)。此外，与接受仅表达抗原的载体的小鼠相比，在含misg15条件下施用的np疫苗诱导显著较高百分比的np特异性多功能cd8+t细胞。为了确定观察到的misg15的佐剂效应是否影响存活率，在疫苗接种后21天用致死颅内剂量(40xld50)的lcmvarmstrong菌株激发小鼠。与接受单独np抗原的组相比，在misg15和np疫苗组中观察到经受致死lcmv感染的存活率显著增加(图3g)。合起来看，这些数据证实misg15可充当免疫佐剂来活化甚至针对免疫赦免位点的高效抗原特异性cd8+t细胞应答。
实施例7-10的研究支持isg15在免疫中的扩展作用，因为已发现其涉及针对细菌病原体lm的先天性免疫。此外，虽然isg15缺陷未阻碍脾lm特异性t细胞应答的形成，但是在后续lm激发之后isg15-/-小鼠的肝脏中的保护性适应性免疫不明显。另外，来自isg15-/-小鼠的脾dc具有降低的成熟标记物表达并且wt小鼠对isg15的过表达能够增强病原体特异性cd8+t细胞应答并且增加经受致死颅内lcmv激发的存活率。实施例7-10表明isg15为先天性抗菌免疫的关键调节剂和适应性免疫的强力活化剂。
应理解先前详细描述和随附实施例仅是说明性的，并且不应视为对本发明的范围的限制，所述范围仅由随附权利要求和它们的等效物限定。
所公开的实施方案的各种改变和改进对本领域技术人员是显而易见的。在不偏离其本质和范围的前提下，可进行与包括但不限于本发明的化学结构、取代基、衍生物、中间体、合成、组合物、制剂和/或使用方法有关的此类改变和改进。
为了完整起见，在以下编号条款中列出本发明的各个方面：
条款1.一种疫苗，其包含抗原和isg15。
条款2.如条款1所述的疫苗，其中isg15由选自由以下各项组成的组的核苷酸序列编码：与如在seqidno:1中列出的核苷酸序列具有至少约95％同一性的核苷酸序列、如在seqidno:1中列出的核苷酸序列、与如在seqidno:3中列出的核苷酸序列具有至少约95％同一性的核苷酸序列、如在seqidno:3中列出的核苷酸序列、与如在seqidno:5中列出的核苷酸序列具有至少约95％同一性的核苷酸序列、如在seqidno:5中列出的核苷酸序列、与如在seqidno:7中列出的核苷酸序列具有至少约95％同一性的核苷酸序列、如在seqidno:7中列出的核苷酸序列、与如在seqidno:9中列出的核苷酸序列具有至少约95％同一性的核苷酸序列，以及如在seqidno:9中列出的核苷酸序列。
条款3.如条款2所述的疫苗，其中isg15由如在seqidno:1中列出的所述核苷酸序列编码。
条款4.如条款2所述的疫苗，其中isg15由如在seqidno:3中列出的所述核苷酸序列编码。
条款5.如条款2所述的疫苗，其中isg15由如在seqidno:5中列出的所述核苷酸序列编码。
条款6.如条款2所述的疫苗，其中isg15由如在seqidno:7中列出的所述核苷酸序列编码。
条款7.如条款2所述的疫苗，其中isg15由如在seqidno:9中列出的所述核苷酸序列编码。
条款8.如条款1所述的疫苗，其中所述抗原由第一核酸编码，并且isg15由第二核酸编码。
条款9.如条款1所述的疫苗，其中所述抗原选自由以下各项组成的组：人乳头瘤病毒(hpv)抗原、人免疫缺陷病毒(hiv)抗原、流感抗原、恶性疟原虫抗原、结核分枝杆菌抗原、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎(lcmv)抗原，以及其片段。
条款10.如条款9所述的疫苗，其中所述hpv抗原选自由以下各项组成的组：hpv16e6抗原、hpv16e7抗原，以及其组合。
条款11.如条款9所述的疫苗，其中所述hpv抗原选自由以下各项组成的组：enva、envb、envc、envd、bnef-rev、gag，以及其任何组合。
条款12.如条款9所述的疫苗，其中所述流感抗原选自由以下各项组成的组：h1ha、h2ha、h3ha、h5ha、bha抗原，以及其任何组合。
条款13.如条款9所述的疫苗，其中所述恶性疟原虫抗原包括环子孢子(cs)抗原。
条款14.如条款9所述的疫苗，其中所述结核分枝杆菌抗原选自由以下各项组成的组：ag85a、ag85b、esxa、esxb、esxc、esxd、esxe、esxf、esxh、esxo、esxq、esxr、esxs、esxt、esxu、esxv、esxw，以及其任何组合。
条款15.如条款9所述的疫苗，其中所述lcmv抗原选自由以下各项组成的组：核蛋白(np)、糖蛋白(gp)，以及其组合。
条款16.如条款1所述的疫苗，其还包含药学上可接受的赋形剂。
条款17.如条款8所述的疫苗，其中所述第二核酸还包含表达载体。
条款18.一种用于在有需要的受试者中增加免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用条款1或2所述的疫苗。
条款19.如条款18所述的方法，其中施用所述疫苗包括电穿孔。
条款20.如条款18所述的方法，其中与施用不含isg15的疫苗相比，所述受试者中的所述免疫应答增加至少约2倍。
条款21.如条款20所述的方法，其中与施用不含isg15的疫苗相比，所述受试者中的所述免疫应答增加至少约4倍。
条款22.如条款21所述的方法，其中增加所述受试者中的所述免疫应答包括增加所述受试者中的细胞免疫应答。
条款23.一种用于在有需要的受试者中治疗癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用条款1或2所述的疫苗。
条款24.如条款23所述的方法，其还包括与施用不含isg15的疫苗相比，使所述受试者中的肿瘤大小减小至少10％。
第25条.如条款23所述的方法，其还包括与施用不含isg15的疫苗相比，使所述受试者中的肿瘤消退增加至少10％。
条款26.如条款23所述的方法，其中所述癌症选自由以下各项组成的组：hpv相关癌症、hbv相关癌症、卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、脑癌、头颈癌、喉癌、肺癌、肝癌、胰腺癌、肾癌、骨癌、黑素瘤、转移性癌症、htert相关癌症、fap抗原相关癌症、非小细胞肺癌、血癌、食管鳞状细胞癌、子宫颈癌、膀胱癌、结直肠癌、胃癌、肛门癌、滑膜肉瘤、睪丸癌、复发性呼吸道乳头状瘤病、皮肤癌、成胶质细胞瘤、肝肿瘤、胃癌、急性髓性白血病、三阴性乳腺癌，以及原发性皮肤t细胞淋巴瘤。
条款27.如条款23所述的方法，其中所述癌症是所述hpv相关癌症。
条款28.一种核酸分子，其包含选自由以下各项组成的组的一种或多种核苷酸序列：与如在seqidno:1中列出的核苷酸序列具有至少约95％同一性的核苷酸序列、如在seqidno:1中列出的核苷酸序列、与如在seqidno:3中列出的核苷酸序列具有至少约95％同一性的核苷酸序列、如在seqidno:3中列出的核苷酸序列、与如在seqidno:5中列出的核苷酸序列具有至少约95％同一性的核苷酸序列、如在seqidno:5中列出的核苷酸序列、与如在seqidno:7中列出的核苷酸序列具有至少约95％同一性的核苷酸序列、如在seqidno:7中列出的核苷酸序列、与如在seqidno:9中列出的核苷酸序列具有至少约95％同一性的核苷酸序列、如在seqidno:9中列出的核苷酸序列，以及其任何组合。
条款29.如条款28所述的核酸分子，其中所述核酸分子是质粒。
条款30.如条款28所述的核酸分子，其中所述核酸分子是一个或多个质粒。
条款31.如条款8所述的疫苗，其还包含由以下各项中的一种编码的抗原肽：seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5、seqidno:7或seqidno:9。
条款32.如条款31所述的疫苗，其还包含由以下各项中的一种编码的isg15肽：seqidno:2、seqidno:4、seqidno:6、seqidno:8或seqidno:10。
序列表
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serglyleugluglyvalglnaspaspleuphetrpleuthrpheglu
130135140
glylysproleugluaspglnleuproleuglyglutyrglyleulys
145150155160
proleuserthrvalphemetasnalaargalaargglyalaalathr
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gluproglyglyargser
180
<210>7
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<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<221>cds
<223>wtisg15人dna
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gtcgcccacctgaagcagcaggtgagcggactggagggagtccaggacgatctgttctgg420
ctgacctttgaggggaagcccctggaagatcagctgcctctgggagaatatggcctgaaa480
cccctgagcactgtctttatgaatctgaggctgagaggcgggggaactgaacctggaggg540
cggagc546
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<213>人工序列(artificialsequence)
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<223>wtisg15人蛋白质
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hisserglytrpaspleuthrvallysmetleualaglyasngluphe
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glnvalserleusersersermetservalsergluleulysalagln
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ilethrglnlysileglyvalhisalapheglnglnargleualaval
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hisproserglyvalalaleuglnaspargvalproleualasergln
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glyleuglyproglyserthrvalleuleuvalvalasplyscysasp
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gluproleuserileleuvalargasnasnlysglyargserserthr
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serglyleugluglyvalglnaspaspleuphetrpleuthrpheglu
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proleuserthrvalphemetasnleuargleuargglyglyglythr
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gluproglyglyargser
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<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
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<223>mutisg15人型式2dna
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<210>10
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<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<221>chain
<223>mutisg15人型式2蛋白质
<400>10
metasptrpthrtrpileleupheleuvalalaalaalathrargval
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202530
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ilethrglnlysileglyvalhisalapheglnglnargleualaval
505560
hisproserglyvalalaleuglnaspargvalproleualasergln
65707580
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145150155160
proleuserthrvalphemetasnleualaleualaalaalaglythr
165170175
gluproglyglyargser
180
<210>11
<211>9
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<221>site
<223>cd8hpv16e7表位
<400>11
argalahistyrasnilevalthrphe
15
<210>12
<211>6
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<221>site
<223>isg15的c末端缀合位点
<400>12
leuargleuargglygly
15
<210>13
<211>6
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<221>site
<223>isg15的突变型c末端位点
<400>13
alaalaalaalaglygly
15
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