本发明涉及一种抗菌抗病毒组合物及其应用，涉及食品和日化领域。
背景技术：
在食品加工过程中，来自于食品原料的引起食品腐败，变质的细菌和霉菌病毒等的数量仅占一小部分。事实上，从事食品生产的人员的手部和皮肤、食品制造的机械和器具的表面，和从空气落下的微生物，及食品生产过后清洗消毒不彻底而导致细菌繁殖，最终造成食品加速腐败的情况也不容小视。单独向食品中添加防腐剂而未有效控制作业环境的微生物细菌及病毒的发生并不能从根源杜绝食品危害事件的发生。因此，食品工业通常要求从业人员在进行食品加工前使用酒精制剂对手部进行消毒，并对食品制造的器具及机械表面进行喷洒消毒剂以进行杀菌，并防止细菌污染。然而，为了达到理想的抗菌抗病毒效果，酒精的浓度需要在70％以上，而且需要较长的作用时间。除此之外，酒精对于病毒无明显效果。高浓度的酒精消毒剂的频繁使用，不仅会造成手部脱脂和皮肤干燥，也可能对机械设备造成不良影响。因此，一种天然、有效的抗菌抗病毒的杀菌剂对于食品行业控制食品污染、提供绿色健康的操作空间具有重要的行业推动价值和巨大的应用潜力。
ε-聚赖氨酸ε-聚赖氨酸呈高聚合多价阳离子态，它能破坏微生物的细胞膜结构引起细胞的物质、能量和信息传递中断，还能与胞内的核糖体结合影响生物大分子的合成，最终导致细胞死亡。虽然，ε-聚赖氨酸对一些呈蝌蚪状的非收缩性长尾噬菌体也有抑制作用，但是由于病毒不具有细胞结构，所以ε-聚赖氨酸对于大多数病毒的几乎不具有明显的抑制作用。
葡萄柚籽提取物(Grapefruit seed extract，GSE)是一种商业化的植物提取物，从葡萄柚籽(Citrusparadisi,Macfaden)种子和果肉中提取出的酚类化合物。化学名称为复合联苯酚羟基苯。GSE中含有大量的多酚类物质，如儿茶酚、表儿茶酸以及二聚体、三聚体和四聚体原花青素。然而，目前对于GSE的抑菌机制及GSE中主要的抗菌物质尚不完全清楚，并且葡萄柚籽提取物在与酒精溶液混合时，容易出现沉淀，造成喷雾困难，难以在食品或者器械表面混合均匀，严重影响其应用前景。
技术实现要素：
针对现有技术存在的一系列上述不足，本发明的第一个目的是提供一种抗菌抗病毒的组合物，所述组合物含有质量浓度为0.02-1％的ε-聚赖氨酸或ε-聚赖氨酸盐酸盐和0.01-0.2％的葡萄柚籽提取物。
在本发明的一种实施方式中，所述组合物中ε-聚赖氨酸或ε-聚赖氨酸盐酸盐的浓度为0.2～10g/L，葡萄柚籽提取物的浓度为0.1～2g/L的。
在本发明的一种实施方式中，所述组合物溶解于酸性乙醇溶液，所述酸性乙醇溶液是pH为3.5～6.0，乙醇体积浓度为20～70％的溶液。
本发明的第二个目的是提供所述抗菌抗病毒组合物的制备方法，是配制ε-聚赖氨酸或ε-聚赖氨酸盐酸盐与葡萄柚籽提取物的混合物，控制所述ε-聚赖氨酸或ε-聚赖氨酸盐酸盐含量为0.02-1％；所述葡萄柚籽提取物含量为0.01-0.2％。
在本发明的一种实施方式中，所述方法是用酸性乙醇水溶液中溶解所述混合物，所述酸性乙醇水溶液中乙醇体积浓度为20～70％。
在本发明的一种实施方式中，所述酸性乙醇水溶液pH为3.5～6.0。
在本发明的一种实施方式中，采用乳酸，柠檬酸，苹果酸，乳酸钠，柠檬酸钠，苹果酸钠的一种或两种以上的组合调节pH。
本发明还提供一种抑菌方法，所述方法是将所述抗菌抗病毒组合物按1～2％的质量比加入至待处理的液体、半固体或固体中。
在本发明的一种实施方式中，所述方法是将所述抗菌抗病毒组合物喷洒在液体、半固体或固体表面，或在内部混匀。
本发明还提供所述抗菌抗病毒组合物在食品安全、日化领域的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述应用包括作为食品添加剂、抑菌剂、防腐剂添加至食品中，作为杀菌剂用于食品加工设备的清洁消毒，作为洗涤助剂用于皮肤表层清洁。
有益效果：本发明通过将ε-聚赖氨酸和葡萄柚籽提取物复配，并采用酸性乙醇溶液使二者形成稳定溶液，解决了ε-聚赖氨酸或葡萄柚籽提取物在单独制备抗菌消毒剂中出现沉淀的问题，保存期限可达12月以上，二者的抗菌抗病毒效果能够产生协同作用，比单独使用单一成分的抗菌消毒剂效果提高2倍以上。本发明的抗菌抗病毒组合物，抗菌谱广，而且产品安全绿色，成本低廉，经济环保，可广泛用于食品加工企业的器具杀菌，从业人员的手部杀菌等领域。
具体实施方式
本发明采用的评价方法如下：
(1)抗菌抗病毒组合物稳定性评价
取20g将抗菌抗病毒组合物分别置于4度，20度，45度下静置1天，1个月，6个月，12个月后，观察是否有沉淀析出。
(2)抗菌性能测定
将金黄色葡萄球菌，大肠杆菌，绿脓杆菌，沙门氏菌置于营养肉汤培养基上培养24h，用接种环挑取典型形态的供试菌落，接种于5mL LB液体培养基中，37℃，200r/min，培养2～6h至对数生长期。取适量菌液，用LB液体培养基调整菌浓度至105CFU/mL。对最小抑菌浓度MIC进行测定。无菌条件下，依次将各实施例的步骤1组分按比稀释。按稀释度从低到高依次加入到无菌96孔板的第1列至第11列，每孔50μL，第12列为阳性对照，加等量无菌水。随后每孔再加入50μL菌液，密封混匀。此时，第1孔至第4孔抗菌抗病毒组合物的终质量浓度为0.005％，0.02％，0.2％，1％；第5孔至第8孔为1-4孔的平行样；第9-12孔为空白，使用无菌水替代组合物。然后将96孔板置于37℃培养箱中培养5分钟后用平板或者纸片培养测定活菌落数目。
抗菌活性＝log起始生菌数/mL(放置5分钟前的菌体数目)–log抑菌后的生菌数/mL(放置5分钟后的菌体数目)
当抗菌活性的数值大于或者等于2时认为体现出良好的抗病毒效果。
(3)抗病毒性能测定
使用已经确立培养方法的猫杯状病毒替代诺如病毒进行试验。使用50％细胞感染浓度法(TCID50法)评价抗病毒效果。将病毒液用含2％犊牛血清的MEM细胞培养液连续进行10倍稀释(10-1～10-12)，向96孔板各孔依次加入100μL稀释好的病毒液，重复4次，由后向前依次加F81细胞100μL/孔。置37℃细胞培养箱，5d后观察细胞病变情况并按Reed-Muench公式计TCID50。向FCV－SH株病毒液(7.67logTCID50/mL)中按照与制剂比例为1:1缓慢加入制剂溶液，充分振荡混匀，在37℃恒温摇床中120r/min灭活5分钟后分别取样微量滴定法检测灭活病毒滴度变化。
抗病毒活性＝logTCID50/mL(放置5分钟前的病毒混合液的感染效价)-logTCID50/mL(放置5分钟后的病毒混合液的感染效价)，当抗病毒活性大于或者等于3时认为体现出良好的抗病毒效果。
下面结合实施例对本发明做进一步说明。
实施例中的葡萄柚籽提取物购自美国拜尔康生物化学研究所，也可采用其他商业来源的葡萄柚籽提取物。
实施例1
按照下述步骤进行抗菌抗病毒组合物的制备和评价。
(1)以质量百分比，按照以下原料配制抗菌抗病毒组合物：0.2％ε-聚赖氨酸或者ε-聚赖氨酸盐酸盐，0.1％葡萄柚籽提取物，55％酒精。
(2)通过添加乳酸和乳酸钠分别调节抗菌抗病毒组合物的pH为2.0，3.0，3.5，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0。依次对应编号A1-A9的实验组。
(3)将抗菌抗病毒组合物室温放置1个月，3个月，12个月，观察有无沉淀析出。
(4)测定抗菌抗病毒组合物的抗菌性能，抗病毒活性。
在pH为3.5～9.0的范围内，所配制的抗菌抗病毒组合物稳定，当pH小于3.5时，组合物长期保存会出现沉淀。
抗菌抗病毒组合物的稳定性实验结果如表1所示。
表1抗菌抗病毒组合物的稳定性结果※
※有：表示有沉淀析出；无：表示无沉淀析出
将配制的抗菌抗病毒组合物存放3个月后的抗菌抗病毒活性进行测定，结果如表2所示。组合物A3-A6效果优异，长期保存也能够保持稳定。
表2抗菌抗病毒组合物的抗菌抗病毒活性※
※抗菌抗病毒组合物的相对于菌悬液的终质量浓度为1％。
实施例2
按照下述步骤进行抗菌抗病毒组合物的制备和评价。
(1)以质量百分比，按照以下原料配制抗菌抗病毒组合物：1％ε-聚赖氨酸或者ε-聚赖氨酸盐酸盐，0.1％葡萄柚籽提取物，依次调整酒精浓度为10％，20％，40％，60％，70％，80％。依次对应编号B1-B6的实验组。
(2)通过添加乳酸和乳酸钠调节抗菌抗病毒组合物的pH为5.0。
(3)将抗菌抗病毒组合物室温放置1个月，3个月，12个月，观察有无沉淀析出。
(4)测定抗菌抗病毒组合物的抗菌性能，抗病毒活性。
在酒精浓度高于70％的情况下，所配制的抗菌抗病毒组合物出现不稳定现象。当酒精浓度低于20％情况下，抗菌抗病毒活力出现较大衰减。
抗菌抗病毒组合物的稳定性实验结果如表3所示。
表3抗菌抗病毒组合物的稳定性实验结果※
※有：表示有沉淀析出；无：表示无沉淀析出
表4抗菌抗病毒组合物的抗菌抗病毒活性※
※抗菌抗病毒组合物的相对于菌悬液的终质量浓度为1％。
实施例3
按照下述步骤进行抗菌抗病毒组合物的制备和评价。
(1)以质量百分比，按照以下原料配制抗菌抗病毒组合物：0.2％葡萄柚籽提取物，ε-聚赖氨酸或者ε-聚赖氨酸盐酸盐浓度为0，0.005％，0.02％，0.2％，1％，依次对应编号C1-C5的实验组。酒精浓度为55％。
(2)通过添加乳酸和乳酸钠调节抗菌抗病毒组合物的pH为5.0。
(3)将抗菌抗病毒组合物室温放置1个月，3个月，12个月，观察有无沉淀析出。
(4)测定抗菌抗病毒组合物的抗菌性能，抗病毒活性。
实施例4
按照下述步骤进行抗菌抗病毒组合物的制备和评价。
(1)以质量百分比，按照以下原料配制抗菌抗病毒组合物：0.2％ε-聚赖氨酸或者ε-聚赖氨酸盐酸盐，葡萄柚籽提取物浓度为0，0.002％，0.01％，0.1％，1％，依次对应编号D1-D5的实验组。酒精浓度为55％。
(2)通过添加乳酸和乳酸钠调节抗菌抗病毒组合物的pH为5.0。
(3)将抗菌抗病毒组合物室温放置1个月，3个月，12个月，观察有无沉淀析出。
(4)测定抗菌抗病毒组合物的抗菌性能，抗病毒活性。
实施例3与4的结果如表5与6所示，采用ε-聚赖氨酸和葡萄柚籽提取物共同制备抗菌抗病毒组合物，其抗菌抗病毒效果比单独使用任何一种物质效果显著增强，且优于单独使用其中任何一种化合物的效果加和。
表5抗菌抗病毒组合物的稳定性实验结果※
※有：表示有沉淀析出；无：表示无沉淀析出
表6抗菌抗病毒组合物的抗菌抗病毒活性※
※抗菌抗病毒组合物的相对于菌悬液的终质量浓度为1％。
本发明还对抗菌抗病毒组合物的组分及浓度进行了其它调整，结果显示，在ε-聚赖氨酸浓度低于0.02％的情况下，所配制的抗菌抗病毒组合物难以达到理想的抗菌效果。当葡萄柚籽提取物浓度低于0.01％情况下，抗病毒活力出现较大衰减。而当葡萄柚籽提取物浓度高于1％时，配制组成物初始未出现沉淀，但是长期保存时不稳定。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。