3,4,7‑三羟基异黄酮或3‑甲氧基大豆素在制备抑制炎症和脑缺血药物的应用的制作方法

本发明属于生物医学领域，具体涉及3,4,7-三羟基异黄酮或3-甲氧基大豆素在制备抑制炎症和脑缺血药物的应用。

背景技术：

炎症是血管系统的活体组织对损伤因子所发生的防御反应，是机体对于刺激的一种防御反应，表现为红、肿、热、痛。任何能够引起组织损伤的因素都可成为炎症的原因，可归纳为以下几类：生物性因子包括细菌、病毒、立克次体、支原体、真菌、螺旋体和寄生虫等为炎症最常见的原因；物理性因子，包括高温、低温、放射性物质及紫外线等和机械损伤；化学性因子包括外源性化学物质如强酸、强碱及松节油、芥子气等；此外还有异物、坏死组织和变态反应都能引起炎症。

严重的炎症反应也会导致凝血系统紊乱。这种紊乱包括促凝活性增强、抗凝活性减低和纤溶系统受抑等，此时多表现为微血管血栓形成或促进弥漫性血管内凝血发生、发展。凝血系统中的凝血酶和其它凝血因子也可以介导一系列的炎症反应。急性脑缺血的主要病因是脑血管栓塞，这是由于脑血管中形成血栓导致血流不畅，进而造成血管梗死。脑缺血后的炎症反应与脑缺血后的继发性脑损害密切相关，是以脑微血管内白细胞浸润、微血管功能紊乱及局部脑组织中液体和炎症因子积聚为标志的急性炎症过程。目前认为炎症因子可直接或间接参与炎细胞的活化和浸润，并对脑水肿的发生起重要作用。例如巨噬细胞产生的白细胞介素(IL)和肿瘤坏死因子(TNF)等可以加强白细胞的浸润和其它炎症因子的释放，加重局部炎症反应和急性脑缺血型脑损伤形成。鉴于炎症和急性脑缺血型脑损伤存在相互促进的恶性循环网络，那么可以同时针对凝血系统和炎症的药物将起到更加持久而有效的抗急性脑缺血型脑损伤的效果。

目前临床上用于预防和治疗炎症和急性脑缺血型脑损伤疾病的药物主要有抗凝血类药物，但是常见的炎症药物如阿司匹林、氯吡格雷等往往会产生药效减弱、肠胃刺激和粒细胞减少等副作用，另外，阿司匹林、氯吡格雷等药物还会造成出血风险增加，这严重影响临床使用和患者的生命健康。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供3,4,7-三羟基异黄酮或3-甲氧基大豆素在制备抑制炎症和脑缺血药物的应用，所述药物的应用能够降低出血风险，使用安全，扩大临床和医药用途。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了3,4,7-三羟基异黄酮或3-甲氧基大豆素在制备预防炎症的药物中的应用，所述3,4,7-三羟基异黄酮的结构式如式Ⅰ所示，所述3-甲氧基大豆素的结构式如式Ⅱ所示：

优选的，所述炎症由脂多糖诱导的巨噬细胞炎症因子引起。

优选的，所述药物的剂型为口服剂。

优选的，所述3,4,7-三羟基异黄酮按照不同体重的患者给药量≥100μmol/kg。

优选的，所述3-甲氧基大豆素按照不同体重的患者给药量≥100μmol/kg。

本发明提供了3,4,7-三羟基异黄酮或3-甲氧基大豆素在制备预防和/或治疗脑缺血再灌注型脑损伤的药物中的应用；所述3,4,7-三羟基异黄酮和3-甲氧基大豆素的结构式如权利要求1所述应用中的结构。

优选的，所述脑缺血再灌注型脑损伤由炎症引起。

优选的，所述药物的剂型为口服剂。

优选的，所述3,4,7-三羟基异黄酮按照不同体重的患者给药量≥100μmol/kg。

优选的，所述3-甲氧基大豆素按照不同体重的患者给药量≥100μmol/kg。

本发明提供了3,4,7-三羟基异黄酮或3-甲氧基大豆素在制备抑制炎症和脑缺血再灌注型脑损伤的药物中的应用，所述3,4,7-三羟基异黄酮的结构式如式Ⅰ所示，所述3-甲氧基大豆素的结构式如式Ⅱ所示。所述3,4,7-三羟基异黄酮或3-甲氧基大豆素人能显著抑制LPS诱导的巨噬细胞IL-6、TNF-α的分泌；同时3,4,7-三羟基异黄酮灌胃对小鼠脑缺血再灌注模型中的脑损伤具有显著抑制作用。出血实验结果表明：和同等剂量的氯吡格雷相比，3,4,7-三羟基异黄酮和3-甲氧基大豆素都没有明显增加小鼠尾出血活性，而对照组同样浓度的氯吡格雷给药组有非常明显的出血活性，这说明本发明提供3,4,7-三羟基异黄酮或3-甲氧基大豆素在制备预治炎症和脑缺血再灌注型脑损伤药物中的应用，所述药物的应用能够降低出血风险，使用安全，扩大临床和医药用途。

附图说明

图1为实施例1中3,4,7-三羟基异黄酮和3-甲氧基大豆素对LPS诱导的巨噬细胞炎症因子IL-6、TNF-α、IFN-γ含量的抑制作用；

图2为实施例1中不同浓度下的3,4,7-三羟基异黄酮和3-甲氧基大豆素对LPS诱导的巨噬细胞炎症因子IL-6、TNF-α分泌的抑制作用；

图3为实施例2中3,4,7-三羟基异黄酮灌胃对小鼠脑缺血再灌注损伤的抑制作用；

图4为实施例3中3,4,7-三羟基异黄酮和氯吡格雷对小鼠尾出血时间的影响；

图5为实施例3中3-甲氧基大豆素和氯吡格雷对小鼠尾出血时间的影响。

具体实施方式

发明提供了3,4,7-三羟基异黄酮或3-甲氧基大豆素在制备预防炎症的药物中的应用，所述3,4,7-三羟基异黄酮的结构式如式Ⅰ所示，所述3-甲氧基大豆素的结构式如式Ⅱ所示：

本发明中，所述炎症优选由脂多糖诱导的巨噬细胞炎症因子引起。诱导的机理是巨噬细胞产生的白细胞介素(IL)和肿瘤坏死因子(TNF)等可以加强白细胞的浸润和其它炎症因子的释放，加重局部炎症反应。

本发明中，所述药物的剂型优选为口服剂。

本发明中，所述3,4,7-三羟基异黄酮对不同体重的患者用药量优选≥100μmol/kg，更优选为120μmol/kg～300μmol/kg，最优选为200μmol/kg，即患者每千克给药摩尔量≥100μmol/kg，根据不同质量的患者来确定用药的摩尔量。所述3,4,7-三羟基异黄酮的来源没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的3,4,7-三羟基异黄酮的来源即可。本发明实施例中，所述3,4,7-三羟基异黄酮购于北京普益华科技有限公司。

本发明中，所述3-甲氧基大豆素对不同体重的患者用药量优选≥100μmol/kg，更优选为120μmol/kg～300μmol/kg，最优选为200μmol/kg，即患者每千克给药摩尔量≥100μmol/kg，根据不同质量的患者来确定用药的摩尔量。所述3-甲氧基大豆素的来源没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的3-甲氧基大豆素的来源即可。本发明实施例中，所述3-甲氧基大豆素购于北京普益华科技有限公司。

本发明提供了3,4,7-三羟基异黄酮或3-甲氧基大豆素在制备预防和/或治疗脑缺血再灌注型脑损伤的药物中的应用；所述3,4,7-三羟基异黄酮和3-甲氧基大豆素的结构式如所述应用中的结构。

本发明中，所述脑缺血再灌注型脑损伤优选由炎症引起。炎症引起脑缺血再灌注型脑损伤的机理是严重的炎症反应也会导致凝血系统紊乱，这种紊乱包括促凝活性增强、抗凝活性减低和纤溶系统受抑等，此时多表现为微血管血栓形成或促进弥漫性血管内凝血发生、发展。凝血系统中的凝血酶和其它凝血因子介导一系列的炎症反应。由于急性脑缺血的主要病因是脑血管栓塞，这是由于脑血管中形成血栓导致血流不畅，进而造成血管梗死。因此脑缺血后的炎症反应与脑缺血后的继发性脑损害密切相关，是以脑微血管内白细胞浸润、微血管功能紊乱及局部脑组织中液体和炎症因子积聚为标志的急性炎症过程。

本发明中，所述药物的剂型优选为口服剂。

本发明中，所述3,4,7-三羟基异黄酮对不同体重的患者用药量优选≥100μmol/kg，更优选为120μmol/kg～300μmol/kg，最优选为200μmol/kg，即患者每千克给药摩尔量≥100μmol/kg，根据不同质量的患者来确定用药的摩尔量。本发明中，所述3-甲氧基大豆素对不同体重的患者用药量优选≥100μmol/kg，更优选为120μmol/kg～300μmol/kg，最优选为200μmol/kg，即患者每千克给药摩尔量≥100μmol/kg，根据不同质量的患者来确定用药的摩尔量。

本发明中，所述口服剂还包括医学上接受的辅料。所述辅料包括但不限于溶剂、抛射剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、黏合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、包衣材料、芳香剂、抗黏合剂、整合剂、渗透促进剂、pH值调节剂、缓冲剂、增塑剂、表面活性剂、发泡剂、消泡剂、增稠剂、包合剂、保湿剂、吸收剂、稀释剂、絮凝剂与反絮凝剂、助滤剂、释放阻滞剂等。

本发明还提供所述口服剂的制备方法，包括下列质量百分含量组分：5～20％的活性成分，2～10％的崩解剂，0.2～2％的润滑剂，0.1～1.5％的助流剂及0～0.5％的添加剂，余量为填充剂混合，制成口服剂；所述活性成分为3,4,7-三羟基异黄酮或3-甲氧基大豆素。

本发明中，所述口服剂的用药频率为每日一次，3-7天为一个疗程。

下面结合实施例对本发明提供的3,4,7-三羟基异黄酮和3-甲氧基大豆素在制备抑制炎症和脑缺血药物的应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

细胞炎症因子检测实验使用培养于RPMI 1640完全培养基(含10％FBS和双抗)的人单核细胞系THP-1完成。THP-1(1×10⁵/孔)在200nM浓度佛波酯(phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA)的诱导下培养2天，分化为贴壁的巨噬细胞，之后用不含佛波酯的培养基平衡2天。使用100ng/mL大肠杆菌LPS诱导巨噬细胞产生炎症因子，同时加入不同浓度的3,4,7-三羟基异黄酮(3’,4’,7-Trihydroxyisoflavone)和3-甲氧基大豆素(3’-methoxydaidzein)共同培养24小时。取细胞上清稀释到合适的倍数后用细胞酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)检测IL-6、TNF-α、IFN-γ的含量。血栓小鼠的炎症因子含量测定使用新鲜取出的小鼠血清，稀释到合适的倍数后同样按照下述ELISA的流程进行检测：

a.使用前，将所有试剂充分混匀，避免产生泡沫。

b.根据实验孔(空白和标准品)数量，确定所需的板条数目。样品(含标准品)和空白都做复孔。

c.加样：100μL/well加入稀释后的Cytokine standard至标准品孔，100uL/well加入样品至样品孔，设置空白孔，用Dilution buffer R(1×)代替样本和标准品。

d.加检测抗体：50μL/well加入稀释后的Biotinylated antibody。混匀后，盖上封板膜，37摄氏度温育90分钟。

e.洗板：扣去孔内液体，300μL/well加入1×washing buffer；停留1min后弃去孔内液体。重复4次，最后一次在滤纸上扣干。

f.加酶：100μL/well加入稀释后的Streptavidin-HRP。盖上封板膜，37℃温育30min。

g.洗板：重复步骤5。

h.显色：100μL/well加入TMB，37℃避光温育5-30分钟之间，根据孔内颜色的深浅来判定终止反应，达到深蓝色即可。通常显色在10-20分钟可以达到很好的效果。

i.终止反应：100μL/well迅速加入终止液终止反应。

j.读板：终止后10分钟内，用检测波长450nm读值。

300μmol/kg 3,4,7-三羟基异黄酮及3-甲氧基大豆素灌胃组小鼠血清中的IL-6、TNF-α、IFN-γ炎症因子含量显著降低。3,4,7-三羟基异黄酮及3-甲氧基大豆素对TNF-α、IFN-γ的抑制作用要优于同样浓度的氯吡格雷(图1)。在LPS诱导的巨噬细胞炎症因子分泌实验中，3,4,7-三羟基异黄酮和3-甲氧基大豆素能够浓度梯度依赖地抑制IL-6、TNF-α的分泌，并分别在3μM和10μM浓度下与对照组产生显著性差异(图2)。

实施例2

小鼠急性脑缺血再灌注模型

小鼠手术前30min灌胃给药，实验组灌胃浓度为60mg/kg，对照组为生理盐水，体积100μL，每组6只。使用2％戊巴比妥钠(80mg/kg)麻醉昆明小鼠(30～35g)，中深度麻醉后，颈正中切口逐层切开大鼠皮肤及皮下组织，分离胸锁乳突肌，切断二腹肌前腹，暴露右侧颈总动脉(CCA)，颈内动脉(ICA)和颈外动脉(ECA)，使用电凝器凝结ECA上甲状腺动脉和咽动脉并剪断。结扎ECA的远心端，并在其近心端挂线，暂时夹闭CCA和ICA，剪断ECA，将线栓从ECA残端插入ICA，结扎ECA残端，移除ICA的动脉夹，由ICA向内上方缓慢推进。适当调整方向，插入到线栓标记处(从CCA分叉处计算10mm)，开始计时，1h后移去线栓，观察无活动性出血后缝合切口。整个过程用电热毯保温，温度为36～37℃。将苏醒后的动物放回笼内，使其自由饮食。24h后麻醉小鼠剪下头部，取出脑组织，置于脑模具中(冰上)，沿视交叉向后切成2mm厚的切片，将其放入2％TTC的磷酸盐缓冲液，于37℃温箱中染色30min，再用4％多聚甲醛过夜固定并拍照。60mg/kg 3,4,7-三羟基异黄酮灌胃给药可以有效减轻脑缺血再灌注造成的损伤(图3)。

实施例3

3,4,7-三羟基异黄酮和3-甲氧基大豆素的出血风险评估

雄性C57BL/6(18-20g)8只一组，测试样品及对照组通过灌胃给药，给药3、6、12小时后，将小鼠置于自制的专用固定器中，使其尾部穿过修剪后的1mL移液器枪头，用消毒保险刀片切去尾尖5mm，立即将鼠尾浸入37℃的生理盐水中，以血流停止时间为指标，观察记录断尾出血停止的时间。

结果如图4所示，在80mg/kg剂量时，3,4,7-三羟基异黄酮组与未给药组相比在各个时间点都没有表现出明显的出血活性，而同样浓度的氯吡格雷给药组有非常明显的出血活性。结果如图5所示，在80mg/kg剂量时，3-甲氧基大豆素组与未给药组相比在各个时间点都没有表现出明显的出血活性，而同样浓度的氯吡格雷给药组有非常明显的出血活性。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。