一种明胶基倒胶状晶体水凝胶三维支架及其制备方法与应用与流程

本发明具体涉及生物材料技术领域，具体涉及一种明胶基倒胶状晶体水凝胶三维支架及其制备方法与应用。

背景技术：

人工合成的三维支架根据细胞外基质成分、机械性能和几何特征模仿靶组织，促进体内细胞基质和细胞间的相互作用。它们备受追捧，因为相比于二维基底，在这些三维支架进行的细胞研究提供了细胞形态和功能相关的生理信息。然而，体内的细胞外基质主要以蛋白质为基础、高度多孔、高度有序、有微观结构特征。尽管三维打印、微流体方法和静电纺丝有最新进展，对纯蛋白质为基础、具有均匀孔隙连通性、合适机械性能、用于组织工程的三维支架，它仍然是一个挑战，由于反蛋白石结构支架有规则的孔隙大小和孔隙之间高度互连这些独特的结构特征，反蛋白石结构支架已被用于三维结构从光学到能量储存的各种应用，kotov团队证明了倒胶状晶体(icc)水凝胶呈现出反蛋白石结构，因为其细胞和细胞外基质有良好的相互作用，可能有助于三维细胞培养。倒置胶体晶体(icc)支架是有希望的3d系统之一，拥有统一的孔，六角形排列和互连，且孔的尺寸是可控的，并且icc结构具有良好的扩散性以输送营养物和氧。该结构通常由基材和牺牲胶体晶体制成。

大部分倒胶状晶体由不可生物降解的合成聚合物构成，如聚丙烯酰胺，聚(乙二醇)，聚(甲基丙烯酸甲酯)，限制了它们的生物医学应用。

现有已经报道了天然天然聚合物的一些icc系统，例如藻酸盐，壳多糖，壳聚糖，包括它们的复合物。由于这些天然材料在水溶液中具有高粘度，因此在低于5％下制备基础材料溶液。另外，大多数系统使用离子或化学交联剂(氯化钙，京尼平等)进行交联，这需要更长的处理时间()，并且可能导致样品上的不均匀交联，导致具有低结构稳定性和低有序结构的icc支架。

甲基丙烯酰胺明胶(gelma)可以保持明胶的一些生物活性，例如细胞附着和酶降解，并且可以提供可定制的机械性能，其已经广泛用于许多生物应用。

技术实现要素：

为了解决现有技术的缺陷及不足。本发明提供了一种明胶基倒胶状晶体水凝胶三维支架及其制备方法与应用。

本发明采用的技术解决方案是：一种明胶基倒胶状晶体水凝胶三维支架，所述的明胶基倒胶状晶体水凝胶三维支架采用甲基丙烯酰胺明胶(gelma)制成，所述的甲基丙烯酰胺明胶制成的明胶基倒胶状晶体水凝胶具有反蛋白石结构。

所述的明胶基倒胶状晶体水凝胶三维支架采用质量浓度为高于20w/v％甲基丙烯酰胺明胶制成。

所述的明胶基倒胶状晶体水凝胶三维支架采用甲基丙烯酰胺明胶取代度为52-98％。

所述的明胶基倒胶状晶体水凝胶三维支架采用取代度为52％或76％的甲基丙烯酰胺明胶的质量浓度为高于30w/v％，所述的明胶基倒胶状晶体水凝胶三维支架采用取代度为98％的甲基丙烯酰胺明胶的质量浓度为高于20w/v％。

一种明胶基倒胶状晶体水凝胶三维支架的制备方法，包括以下步骤：

(1)制备甲基丙烯酰胺明胶；

(2)制备明胶基倒胶状晶体水凝胶三维支架：将震荡两晚直径为138±2.0μm的聚苯乙烯珠在聚丙烯模具中的乙醇溶液中自组装，并在134℃下退火6小时获得晶格，将具有不同取代度的gelma样品在50℃下在蒸馏水中溶解，通过在40℃下以15,000rpm离心10分钟，将含有1％i2959光引发剂的gelma溶液浸泡到晶格中，gelma渗透的晶格通过紫外光固化10分钟，然后在四氢呋喃中除去晶格，得到明胶基倒胶状晶体水凝胶三维支架。

所述的步骤(1)中甲基丙烯酰胺明胶的制备包括以下步骤：将a型明胶溶解在缓冲液中，调节ph值至9，随后将94％的甲基丙烯酸酐在500转/分的磁力搅拌下被添加到溶液中，反应进行3h，然后ph调整到7.4停止反应，经过滤、透析、冻干后的样品存放在-20℃待用。

所述的步骤(1)中a型明胶和甲基丙烯酸酐的加入量为每10ga型明胶加入1ml甲基丙烯酸酐。

所述的缓冲液为磷酸盐缓冲盐水和碳酸盐和碳酸氢盐缓冲液配制而成。

所述的缓冲液质量浓度为10-25w/v％。

一种明胶基倒胶状晶体水凝胶三维支架在用于制备组织工程材料上的应用。

一种明胶基倒胶状晶体水凝胶三维支架在用于作为药物筛选材料上的应用。

本发明的有益效果是：本发明提供了一种明胶基倒胶状晶体水凝胶三维支架及其制备方法与应用，本发明利用模板微制造技术和高浓度的可光致交联的甲基丙烯酰胺明胶(gelma)溶液制造具有均匀的孔隙互连性，结构稳定性和可调节的降解性质的基于蛋白质的三维支架。这些明胶基倒胶状晶体水凝胶三维支架提供良好的细胞附着位点和肝细胞的更好的细胞间相互作用，具有作为用于药物筛选的有效人工肝平台的潜力，但也是用于不同组织工程目的以及体内应用的多功能平台的潜力。本发明制备具有生物降解性、均一孔隙连通性的高度有序蛋白基反蛋白石水凝胶，可用于如三维生物打印，三维细胞培养、药物筛选和体内移植等生物应用，本发明在简单可控、可再生、经济、一步法甲基丙烯酰胺明胶合成方面提供详细技术，生产高取代度的甲基丙烯酰胺明胶，另外，其制备的，其明胶基倒胶状晶体水凝胶三维支架具有可降解性、均匀孔隙连通性、结构稳定。

附图说明

图1a为本发明明胶甲基丙烯酰(gelma)合成方案图。

图1b为作为取代度(ds)的52％，76％和98％的函数的gelma本体水凝胶(30w/v％，在具有1w/v％i2959的蒸馏水中)的储存模量。

图1c为通过icc模板的gelmaicc支架的制造过程的示意图。

图2a为具有不同gelma浓度(5，10，20，30和40w/v％)和不同ds(52，76和98％)的gelmaicc支架的光学图像。

图2b为gelmaicc支架的直径对不同浓度。

图3a为由聚苯乙烯珠制成的胶体晶体的光学显微图像，gelmaicc支架的光学显微图像，gelmaicc支架的扫描电子显微镜(sem)图像和通过免疫组织化学染色的纤连蛋白包被的gelmaicc支架的共聚焦图像(纤连蛋白红色的)。

图3b为具有不同ds(52，76和98％)的gelmaicc支架的尺寸，gelmaicc支架展示了高度有序的微孔和互连结构。

图4a为在酶促降解期间具有不同ds(比例尺＝100微米)的gelmaicc支架的微尺度表面形态观察。

图4b为在1mg/ml1a型胶原酶溶液(125u/ml)(n＝3；平均值±sd)下具有不同ds的gelmaicc支架的质量损失示意图。

图5a为评价huh7.5细胞活力和在3dgelmaicc支架和2dgelma底物上的生长模式。的活/死染色图像。绿色和红色分别表示活细胞和死细胞。

图5b为活/死染色图像定量的细胞活力值。

图5c为在凝胶支架腔icc细胞多层厚度用imagej的共聚焦图像定量分析图。

图6a为huh7.5形态在3dgelmaicc支架和培养期间2dgelma底物上的表征的正交投影图像。

图6b为通过共聚焦显微镜拍摄的3d重建图像，(红色：cyp3a4，绿色：f-肌动蛋白，蓝色：细胞核)。

图6c为扫描电镜观察显微图像。

图7a、b为评价huh7.5细胞构建体在3dgelmaicc支架和2dgelma底物上的肝脏特异性功能通过免疫组织化学的共聚焦显微镜图。

图7c为e-钙粘蛋白，白蛋白和gapdh的蛋白质印迹结果。

图8为肝细胞培养在3dgelmaicc支架和2dgelma底物对肝特异性基因表达的影响。在两个系统中培养huh7.5细胞，提取它们的rna用于(a)白蛋白，(b)aat，(c)cyp3a4，(d)cyp3a7，(e)葡萄糖6-磷酸的定量实时pcr分析，磷酸酶(g6pase)，(f)hnf4a，(g)hnf6，(h)e钙粘着蛋白，(i)n钙粘着蛋白，(j)紧密连接蛋白-1，(k)zo-通过相应的目标基因的相应日和第1天的gapdh来标准化mrna表达水平。(n＝3，平均值±sd；#：p＜0.05；##：p＜0.01；###：p＜0.001，在3dgelmaicc支架和2dgelma底物之间的比较)

具体实施方式

为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例详细说明。

甲基丙烯酰胺明胶(gelma)合成

采自猪皮肤组织的a型凝胶，溶解在cb缓冲液(0.1m缓冲液：3.18克碳酸钠和5.86克碳酸氢钠溶解于1升蒸馏水中)，用5m氢氧化钠或6m盐酸调节ph值。随之，甲基丙烯酸酐(94％maa)在500转/分的磁力搅拌下被添加到溶液中。反应进行3h，然后ph调整到7.4停止反应。经过滤、透析、冻干后的样品存放在-20℃直到进一步的使用。合成的标准条件为：0.25m的cb缓冲液，初始ph值调为9，每a型明胶加入maa0.1ml，反应温度为50℃、反应时间为3h。在进行合成gelma方案详细描述时，对下面的实验参数进行了研究：cb的摩尔浓度(0.1，0.25，0.5，0.75，1m)，初始ph研究(ph值为8，9，10，11)，甲基丙烯酸(maa)用量(maa/明胶量：0.0125，0.25，0.5，0.1，0.2毫升/克)，凝胶浓度(1，2.5，5，10，20w/v％)和反应温度(35，40，45，50℃)。

gelma的储能模量的测量

制备不同ds的gelma样品(蒸馏水中含有30w/v％)，ds具体为25、36、68、96和98％。然后gelma溶液加入1w/v％2-羟基-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮(i2959，sigma-aldrich)。为了分析水凝胶的机械性能，用类似之前的方法进行频率扫描测量。保持其温度在37℃，140ml样品在测量装置和透明玻璃板之间的原位2分钟内被固化(365nm，150mw/cm2)。锥度为2度、几何形状为25毫米锥板这种测量装置被用于此测试，该测量装置适用于2％应变振幅，振荡频率为0.1-10赫兹。

凝胶基反蛋白石水凝胶支架的制备与降解

通过两晚的震荡和130℃退火6小时，138μm±2μm的聚苯乙烯珠用直径5.5mm的聚丙烯模在70％乙醇溶液中进行自组装。不同取代度的gelma样品溶解在50℃的蒸馏水中制得30％w/v。在40℃，15000转/分，离心10分钟，含1％i2959的gelma被浸泡在退火后的聚苯乙烯微球中。渗透了gelma的已退火的聚苯乙烯基质采用365nm30mwcm^-2的紫外光固化10min，接着聚苯乙烯珠被移入四氢呋喃。gelma反蛋白石水凝胶支架存放在4℃的pbs或蒸馏水中直到进一步的使用。gelmaioh支架在含3mm氯化钙的hank’s平衡盐溶液中用1mg/ml胶原酶进行降解测试。通过光学显微镜观察降解过程中的ioh支架形态，ioh支架的质量损失也可被测定。

在ioh支架上的huh-7.5细胞培养和活力测定

人肝癌细胞用含10％胎牛血清和1％青霉素/链霉素的dmem培养基保存在37℃5％co2的潮湿环境。用于三维细胞培养的细胞接种前每3天更换一次培养液。为了细胞接种，ioh支架在24孔板中用pbs清洗，并放在2毫升完全培养液中30分钟。用移液管吸取培养液，含有1x10⁶细胞的25μl培养液小心地移到每一个ioh支架上面。4小时后，接种了细胞的ioh支架被转移到新的24孔培养板中，每3天换一次液。支架上的细胞活力采用活/死细胞活力/细胞毒性试剂盒测定。总之，在培养液中制备4μm的钙黄绿素和8μm的乙锭同型二聚体-1(ethd-1)并加入到充满细胞的支架，37℃培养1小时。在488nm激光激发下用共聚焦显微镜观察，活细胞被钙黄绿素染色并用494-517nm发射滤波器显像呈绿色，死细胞被ethd-1染色用517-617nm发射滤波器显像呈红色。在ioh支架上的细胞增殖采用细胞计数试剂盒定量分析。总之，细胞在37℃用cck-8孵育1小时后，通过450nm波长的光波用读板仪测量显色培养基。用标准曲线将测量吸光度转换为细胞数量。实验重复三次。

免疫染色和共聚焦显微镜

充满细胞的ioh支架在不同时间点(1，3，6，9天)收集用于免疫细胞化学。细胞构建体用pbs清洗两次，4％pfa固定五分钟，在pbs中用0.1％的tritonx-100渗透30分钟，再用pbs清洗两次，在pbs中的3％bsa封闭缓冲液中培养1小时。cyp3a4和白蛋白分别用特定的初级抗体(在4℃染色一晚，然后用pbs清洗三次除去未结合的初级抗体。用与alexaflour(lifetechnologies)共轭的抗小鼠二级抗体培养细胞。同时，丝状肌动蛋白(f-actin)用alexa标记的鬼笔环肽在室温下染色2h。用pbs清洗两次后，核用10μg/ml2，6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐染色10分钟。染色的细胞图像用共聚焦显微镜捕获。

数据分析

本发明合成具有各种ds的gelma样品用于制造icc支架，如图1所示。具有52，76和98％的不同ds的gelma样品以相同的maa(1ml)与明胶(10g)的进料比制备，在三种不同的系统(pbs，cb和cb加ph9调整)。gelma水凝胶(30w/v％，在具有1w/v％i2959的蒸馏水中)的体积刚度分别为22，61和99kpa。具有较高ds的gelma水凝胶表现出较高的刚度。为了制造gelmaicc支架，通过直径为138.1±2.2μm的聚苯乙烯珠的自组装来制备第一胶体晶体(图1c)。随后将干燥的聚苯乙烯珠退火以获得模板晶格。接着，通过在40℃下离心，将gelma水溶液(5，10，20，30和40w/v％)渗透到晶格中。由于gelma是高度水溶性的，由于减少的离子分子间相互作用，所有溶液可以穿透晶格的间隙。对于更具体的实例，30w/v％的gelma溶液具有粘度值(52％ds在394±97mpa.s，76％ds在191±19mpa·s，98％ds在215±27mpa·s在37℃，100s-1)，如补充图1所示。在gelma渗透的晶格的uv交联之后，通过四氢呋喃除去模板以获得gelmaicc支架。就结构完整性而言，由5和10w/v％gelma溶液制成的gelmaicc支架不管ds如何都显示塌陷，并且具有最高ds(98％)的gelmaicc在高于20w/v％浓度下提供最佳的结构完整性，而具有52和76％ds的凝胶具有良好的结构完整性在30w/v％以上的结构完整性。测量30w/v％的gelmaicc支架的机械刚度，其储存模量表现出1-4kpa的范围，如补充图2所示，取决于gelmaicc的ds。这些结果显示如何通过高浓度gelma的胶体晶体模板和通过有效的uv交联克服高度多孔的基于蛋白质的水凝胶的短缺(缺乏结构完整性和机械性质)。关于gelmaicc的尺寸大小，gelmaicc如图2b所示，较低的ds稍微肿胀。由于较少的足够的机械支持，低于20w/v％制备的gelmaicc样品更容易从水性介质中塌陷。gelmaicc支架的总体尺寸高于30w/v％。保持良好。因此，具有三种不同ds(52，76和98％)的30w/v％的gelmaicc支架，导致良好的结构稳定性用于进一步的研究。图3a中的gelmaicc支架的sem图像和显微镜图像显示gelmaicc支架具有六边形蜂巢状梳状微结构，具有约139μm的均匀空腔，且连接窗通道为约30μm，与ds无关(52，76，和98％)。gelmaicc支架在每个腔中显示六个均匀连接窗口通道，如3d共焦图像中所示。在icc系统中，腔体和腔之间的连接通道的尺寸分别由自组装聚苯乙烯珠粒的尺寸和退火温度控制，影响细胞构建体的尺寸和孔之间的细胞-细胞相互作用。我们使用大约140微米直径的聚苯乙烯ps珠，以便不超过细胞构建体(150-200微米)32中氧和营养物的最大渗透性。在不退火牺牲珠的情况下制造的icc支架可导致孔的不规则形成。均匀性不仅对重现性重要，而且对于良好的内部扩散性也是重要的，导致更好的细胞活性33.在我们的系统中，我们使用紧密退火的胶体晶体作为牺牲模板，因此产生具有均匀微孔性和互连性的高度组织的结构。是组织工程特别是体内应用的支架的基本要求。

在这里，我们使用胶原酶1mg/ml(125u/ml)进行了gelmaicc支架的加速降解测试。如图4所示，gelmaicc支架由酶的降解是明显的，并且其速度高度依赖于gelma的ds，其涉及gelma的交联密度。gelmaicc支架的ds越低，降解越快观察到的。具有52％ds的gelmaicc支架在2小时内损失其质量的一半。gelmaicc支架的76和98％ds的半衰期分别为约3和5小时。此外，如图4a所示，通过显微镜监测降解过程中gelmaicc支架的形态特征。其形态变化的时间曲线与其质量损失的时间曲线一致。具有52和76％ds的第一层gelmaicc支架的腔环分别在1和2小时后分解，而具有98％ds的gelmaicc支架的腔环在4和6小时之间开始丧失其完整性。显然，gelmaicc支架可以维持胶原酶切割位点(-r-pro-x-gly-pro-r-，x：中性氨基酸)，甚至在化学修饰过程之后，因为甲基丙烯酰基主要与明胶的游离氨基反应这些结果表明，甚至具有相对高浓度(30w/v％)的gelmaicc支架对酶促降解敏感，并且它们的降解由gelma的设计的ds控制。为了理解基于蛋白质的微架构的效果3dgelmaicc支架在细胞上，我们使用肝细胞系(huh7.5)作为替代模型细胞，因为高度可用的huh7.5细胞仍保留几种肝功能，例如肝特异性基因表达，肝酶活性以及允许性hcv感染。肝细胞所在的微观单位是大致六边形的小叶，而胶原是ecm的主要结构蛋白。由于gelmaicc可以提供类似的肝脏小叶的微环境，我们假设具有高度有序的微孔隙和互连的gelmaicc将是肝组织工程和药物筛选应用的良好候选者。我们制备了gelmaicc细胞载体构建体，并在2d和3dgelma(30w/v％，98％ds)系统中评估其组织，细胞活力，生长和功能。在huh7.5细胞接种到gelmaicc支架的空腔中之后，huh7.5细胞快速渗透通过空腔并附着到空腔壁。在图5中的活/死显微照片中所示，在培养期的9天中，空腔中的细胞区域变得更大和更大。图像显示huh7.5细胞在3dicc支架中高度可行(高于80％)，在2d衬底上。在gelmaicc支架中，huh7.5细胞沿着腔壁拉伸并且随着时间出现形成更厚和更厚的细胞片层。3d细胞层的厚度的结果显示从第1天的约22μm至第9天的50μm(从p＜0.0001，单向anova)增加两倍以上。三维共聚焦图像(蓝色：细胞核；绿色：肌动蛋白；红色：图6a，b中的cyp3a4)和sem图像(图6c)显示在3dgelma支架和2dgelma底物上生长的细胞之间的清楚的形态学差异。凝胶icc支架中的huh7.5细胞最初锚定片状至腔壁，然后逐渐生长至细胞片构建体。在第9天，大多数空腔用细胞填充，以3d方式生长成多细胞簇。这种趋势在第一层和第二层中是显着的(补充图5)。另一方面，2d衬底上的细胞最初形成由几个细胞组成的岛状簇，在第1天，然后他们被合并形成只有几个细胞层的大细胞片。细胞增殖在3dgelmaicc支架和通过使用cck-8试剂的比色测定来定量2dgelma底物。2d衬底中细胞的增殖逐渐增加直到第6天，然后在第9天突然下降。相反，3dgelmaicc支架中的细胞的cck值在培养期间适度改变。尽管与2d底物相比，试剂在gelmaicc的整个层内扩散可能有一些限制，但它显示2d底物上的细胞似乎生长更快。这个结果类似于以前的报告，在两个不同的系统中的原发性肝细胞34；在球体系统中的肝细胞少得多增殖，而形成单层的肝细胞更快地增加其数量。反之，与2d相比，白细胞生成在肝泡球体中维持良好，其中细胞几乎停止白蛋白产生。这些结果表明在3d文化中具有高细胞间相互作用的肝细胞可以保持其功能比那些在2d文化。如下研究gelmaicc支架中的细胞功能。为了理解支架对细胞功能的影响，通过免疫组织化学染色和如所示的western印迹测定来评估2dgelma底物和3dgelmaicc支架上的huh7.5细胞免疫组织化学染色的靶蛋白是白蛋白和cyp3a4，它们分别是必需的分泌蛋白和药物代谢酶。图像显示形态学1改变huh7.5细胞的2d和3d，揭示了白蛋白和cyp3a4的细胞内活性。总体而言，凝胶icc支架中的huh7.5细胞似乎产生更高浓度的白蛋白和在培养物中随时间的更明显的cyp活性。相比之下，那些在gelma2d底物上的活性小得多，并且在细胞形成岛状簇的早期显示出峰值。在簇合并成片状后，它们的表达强度降低。这些结果意味着形态和细胞功能的相关性，通过蛋白质印迹测定进一步研究。对白蛋白和e-钙粘蛋白(粘附连接的跨膜组分)进行western印迹测定。在肝脏中，e-钙粘蛋白存在于围产期区中，其中具有更高的白蛋白表达.在体外，据报道肝泡球体是其增强的细胞-细胞相互作用和肝功能维持的研究良好的配置，与细胞悬液相比具有e-钙粘蛋白的高表达。蛋白质印迹分析的结果显示白蛋白和e-钙粘蛋白表达之间的紧密相关性。在gelma2d系统中，当它们形成球体簇时，两种蛋白质的表达水平在第3天达到最大。同时，在gelmaicc系统中，其中细胞构建体逐渐生长并且以3d方式在空腔之间互连，蛋白质表达随着培养时间的进行而增加。这个结果表明具有高度组织的3d互连的gelmaicc系统可以提供具有持久的细胞间相互作用的肝细胞构建体，导致连续的白蛋白产生。为了研究基因表达水平的广泛的细胞功能，huh7的肝细胞特异性基因表达。细胞在2dgelma底物上和在3dgelmaicc支架中通过rt-qpcr定量。选择调节肝脏分泌蛋白39的表达的肝细胞核因子(hnf)和包括白蛋白，cyp，α1-抗胰蛋白酶(aat)和葡萄糖6-磷酸酶(g6pase)的肝特异性分子作为肝标记，图8a-g。在这些分子中，在cyp中观察到2d和3d之间的显着差异；cyp3a4和cyp3a7的基因表达水平在3dgelma系统中显着增加，而2dgelma系统中的基因表达水平在培养9天后下降超过一半。此外，hnf和其他分泌分子在3dgelmaicc系统中显着上调，与2dgelma系统中的那些相比，其保持适度增加。也对细胞连接上的mrna水平进行定量。图8h-k显示粘附连接，e-钙粘蛋白和n-钙粘蛋白的跨膜组分的结果。至于e-钙粘蛋白，3dgelmaicc支架在第9天的表达显着高于2dgelma底物。该结果与western印迹一致，支持3dgelmaicc支架中更好的肝脏行为。n-钙粘蛋白在2d和3d之间没有显示大的差异。在两种系统中，第1天和第9天之间的差异仍然不显着(p＞0.05)。由于n-钙粘蛋白与细胞运动性相关并且在肝纤维化期间增加40，该结果表明gelma系统上的细胞显示有利的非间充质特征。还评估了其他细胞紧密连接蛋白(紧密连接蛋白1和闭塞(zo)-1)。在肝脏中，细胞之间存在紧密连接，并在调节细胞旁扩散和维持细胞极性41，42中起重要作用。在3dgelmaicc支架中，紧密连接蛋白1和z0-1的基因表达水平在第3天后增加超过培养物另一方面，2dgelma底物中的那些在第6天达到峰值，并且不显示时间依赖性行为。这个结果表明增强的细胞间通信和极性维持在3dgelmaicc支架。总之，这些结果基因表达显示3dgelmaicc支架与2dgelma基板相比的上调肝功能。结论总而言之，我们构建了成功的基于明胶的icc水凝胶支架，具有高度组织的互连多孔结构，可调降解性质，易于处理的特点。这种3dgelma系统不需要额外的ecm涂层，这是麻烦的，并且可能不能确保再现性。gelmaicc支架的孔是高度相互连接和规则，使优异的细胞浸润和孔之间随后的细胞间相互作用。支架易受胶原酶降解，这可以是可调整的不同ds的gelma。在3dgelmaicc支架中装载的肝细胞在9天培养期间显示高活力和增强的细胞-细胞和细胞-ecm相互作用。在3dgelmaicc系统中多种肝细胞特异性基因的mrna水平显着上调，可能是由于来自3dge的改善的细胞-细胞和细胞-材料相互作用lamicc几何与gelma2d系统相比。这些gelmaicc支架不仅可以是用于药物筛选的有效的人工肝平台，而且可以是用于不同组织工程目的以及体内应用的多功能平台。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。