功能蛋白载体及其制备方法与流程

本发明涉及一种基于配位自组装作用的功能蛋白载体及其制备方法，属于蛋白载体技术领域。

背景技术：

蛋白药物与传统的小分子化学药物相比，因其具有高效、安全、耐受性好、高选择性、高效价、低损耗等优点，而受6到越来越多的关注。目前已有大约60种重组蛋白和单克隆抗体应用到临床中。但是，由于蛋白药物具有易水解和氧化、有聚集趋势、半衰期短、消除迅速、通常不能口服、膜渗透性低等缺陷，使其大多数情况下只能作为细胞外靶点药物使用。然而，许多与疾病相关的靶点是存在于细胞内的，需要药物透过细胞膜进入细胞才能作用于靶点，发挥其治疗作用。本课题所研究的——基于配位自组装作用的胞内药物传递体系不仅具有蛋白药物的普遍优点，同时改善了蛋白药物的膜渗透性，其胞内传递效率有显著提高。

为提高蛋白的穿膜效率，有研究者使用穿膜肽对蛋白进行共价修饰或特异性配体修饰，或利用蛋白自身所具有的负电性，与带正电性的分子静电结合成纳米粒，通过细胞内吞作用进入胞内。然而以上方法或对蛋白自身结构有特殊要求，或需要特定化学修饰才能完成。因此，需要建立一种易制备且对蛋白结构没有特殊要求的胞内蛋白传递系统。

近年来常出现利用配位键用于药物递送的研究。配位键是一种特殊的共价键，通过对配合物，离子的筛选，可以实现配位键对生理环境的响应性断裂。

综上，本发明拟利用蛋白、功能聚合物以及金属离子之间的配位作用和自组装形成纳米粒，并对其制备方法、处方优化、纳米粒表征以及蛋白活性等方面进行详细探究，以得到安全、稳定、适用广的胞内蛋白药物传递体系。

技术实现要素：

目的：为了克服现有技术中存在的不足，本发明提供一种基于配位自组装作用的功能蛋白载体。

技术方案：为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：

一种功能蛋白载体，其特征在于：所述功能蛋白载体包括富含胍基或咪唑基末端的功能聚合物、金属离子和蛋白；金属离子同时与功能聚合物和蛋白形成配位键，诱导自组装形成纳米颗粒的功能蛋白载体；所述功能聚合物为pcah或鱼精蛋白。

所述pcah的化学结构式如下：

其中，x为正整数，y为自然数。

作为优选方案，所述pcah的分子量为1000-100000。

作为优选方案，所述的功能蛋白载体，其特征在于：鱼精蛋白为鲱精蛋白、鲑精蛋白。

作为优选方案，所述蛋白为白蛋白，选自牛血清白蛋白、人血清白蛋白、重组人血清白蛋白、卵白蛋白、卵清蛋白、乳白蛋白、肌白蛋白、麦白蛋白、豆白蛋白；

或为荧光蛋白，选自绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白；

或为激素类蛋白，选自胰岛素、牛胰岛素、重组人胰岛素、重组促红细胞生成素、重组人生长激素、白细胞介素，

或为酶类蛋白，选自中性蛋白酶，碱性蛋白酶，酸性蛋白酶，菠萝蛋白酶，木瓜蛋白酶，过氧化氢酶、半乳糖苷酶、cas9酶；

或为单抗类蛋白，选自曲妥珠单抗、贝伐珠单抗、利妥昔单抗、阿达木单抗、尼妥珠单抗。

本发明还提供上述的功能蛋白载体的制备方法，包括以下步骤：

(1)首先将功能聚合物与蛋白按照一定比例进行混合，得功能聚合物与蛋白的复合物；

(2)在搅拌条件下，将含有金属离子的金属盐逐滴加入到功能聚合物与蛋白的复合物溶液中；

(3)使用0.1mnaoh溶液调节ph至6.5-8.0，然后在0～50℃下搅拌0.5-12h即得。

作为优选方案，所述的功能蛋白载体的制备方法，其特征在于：加入的功能聚合物与蛋白的质量比为1:0.025～1:1。

作为优选方案，所述的功能蛋白载体的制备方法，其特征在于：所述的金属盐为可溶性的锌盐、铁盐、铜盐、钴盐、锰盐、镍盐、镧盐、钆盐、银盐、锆盐、钛盐。

作为优选方案，所述的功能蛋白载体的制备方法，其特征在于：所述的金属盐选自硝酸锌，硝酸铁，硝酸铜，硝酸钴，硝酸锰，硝酸镍，硝酸镧，硝酸钆，硝酸银，硝酸锆，硝酸钛，氯化锌，氯化铁，氯化铜，氯化钴，氯化锰，氯化镍，氯化锆，氯化镧，氯化钆，氯化银，氯化锆，氯化钛，硫酸锌、硫酸铁、硫酸铜、硫酸钴、硫酸锰、硫酸镍、硫酸镧，硫酸钆，硫酸银，硫酸锆，硫酸钛中的一种或几种。

有益效果：本发明提供的功能蛋白载体与现有技术相比，由富含胍基或咪唑基末端的功能聚合物、金属离子和蛋白药物组成；金属离子同时和功能聚合物、蛋白药物形成配位键，诱导自组装形成纳米颗粒。该纳米制剂可以通过内吞作用进入细胞，在内涵体的酸性环境中，一方面配位键ph响应性断裂，释放蛋白药物，另一方面，功能聚合物内含有的基团可以有效促进内涵体逃逸，并最终使蛋白药物释放到细胞质中，发挥作用。通过体外表征说明该纳米制剂能够实现对多种蛋白药物的有效包裹，具有较好的ph响应性；并通过细胞水平上的活性评价，证明该系统能够有效地将药物递送到细胞内实现较好的ph响应性释放，并发挥作用。本发明的蛋白递送载体具有很好的胞内传递功能，为胞内靶点疾病治疗提供了一种有效的手段。具有以下优点：

(1)载体的制备是通过配位介导的自组装作用实现的，与现有的细胞内蛋白递送载体相比，不需要复杂的合成步骤，制备过程简单，迅速；

(2)载体中用到的高分子pcah或鱼精蛋白具有高含量的胍基，可以促进细胞摄取；

(3)本细胞内蛋白递送系统对包裹的蛋白没有结构要求，不同等电点和立体结构的蛋白均可以利用该方法包裹进去。

附图说明

图1是本发明蛋白载体的粒径电位(1a)，粒径分布(1b)与配位表征(1c)；

图2是本发明蛋白载体对bsa结合的凝胶电泳图(1：bsa；2：pcah-fe纳米粒；3：bsa/fe混合物；4：pcah/bsa混合物；5：bsa纳米粒)；

图3是本发明蛋白载体对模型蛋白(a：β-gal；b：egfp；c：cat；d：epo；e：bro；f：ova)结合的凝胶电泳图(1：蛋白；2：pcah-fe纳米粒；3：pcah/蛋白混合物；4：蛋白纳米粒)；

图4是本发明蛋白载体ph响应释放蛋白的凝胶电泳图(a：bsa；b：epo；c：egfp)；

图5是本发明蛋白载体的细胞摄取实验；

图6是本发明蛋白载体在hela细胞上转染效果图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作更进一步的说明。

实施例1：基于配位自组装作用的蛋白载体的制备

以水合粒径作为指标，固定pcah的浓度(250μg/ml)，加入不同浓度的fe(no3)3水溶液，然后分别调节ph至7.4，可发现粒径随着fe³⁺浓度的升高逐渐减小(图1a)，当fe³⁺浓度为0.56μg/ml时，粒径分布如图1b所示。对fe³⁺浓度为0.56μg/ml时，pcah与fe形成的配位键进行氢谱表征(图1c)。¹h-nmr图显示，pcah-fecwns的δ7.2-8.5(nh)化学位移相比于pcah来说增大，而这两种样品的δ6.25(pcah上残存的c＝ch位移)化学位移没有变化，说明pcah-fe纳米粒中fe-n化学键的形成。

实施例2：基于配位自组装作用的蛋白载体对蛋白结合能力测定

利用蛋白的凝胶电泳实验检验pcah-fe纳米粒对蛋白的结合能力：分别将蛋白marker，牛血清白蛋白(bsa)溶液，pcah-fe纳米粒及装载bsa的pcah-fe纳米粒加入sds-page凝胶的上样孔中。在80v，30min以及100v，90min的条件下电泳。电泳结束之后利用银染法显色。结果发现：bsa，bsa与fe的混合物，pcah与bsa混合物都不能结合蛋白，只有pcah-fe纳米粒组对bsa有效结合(图2)。而且我们同时尝试了pcah-fe纳米粒对其它不同分子量与等电点蛋白质的结合效率，表1是验证蛋白递送系统的模型蛋白的英文全称、简称、分子量及等电点信息；凝胶电泳显示，pcah-fe纳米粒对这些蛋白都有很好的结合效率(图3)。

表1

^[a]bromelaincontainsamixtureof9differentproteaseswithdistinctmolecularweights

实施例3：基于配位自组装作用的蛋白载体ph响应释放蛋白实验

一个评价蛋白递送系统的重要指标是原型蛋白是否可以从载体中释放出来。配位键是可响应断裂的基团，在酸性环境中会断裂释放蛋白。分别将bsa纳米粒与不同ph的pbs溶液孵育30min，然后进行凝胶电泳实验，检测处理后pcah-fe对各种蛋白的结合状态，凝胶电泳实验参考实施例2。如图4a所示，随着ph值的降低，bsa纳米粒中bsa的释放量增高，这证明了pcah-fe纳米粒的ph响应性。同时，我们也另选取了egfp和epo这两种代表性蛋白做了响应性实验，并得到了类似的结果(图4b，图4c)。

实施例4：基于配位自组装作用的蛋白载体的细胞摄取实验

利用激光共聚焦显微镜及流式细胞仪测试fitc标记的bsa纳米粒在hela细胞的摄取情况：将5×10⁴个hela细胞接种于直径35mm的激光共聚焦培养皿中，然后在37℃，5％的二氧化碳培养箱中孵育12h。细胞贴壁后将培养基移除，然后用pbs清洗细胞两遍，分别将bsa，pcah/bsa混合物和bsa纳米粒处理细胞16h，然后移除上清，用pbs清洗三遍，紧接着在37℃，5％的二氧化碳培养箱中与lysotrackerreddnd-99(100nm，60min)孵育2h，孵育结束后细胞用pbs清洗三遍。然后在培养皿内加入2ml溶于pbs中的hoechst33342(100mm)，在37℃，5％的二氧化碳培养箱中染色10min，染色结束后细胞用pbs清洗三遍，然后利用4％的多聚甲醛固定，最后用激光共聚焦显微镜观察拍摄。结果发现，相比于bsa及pcah/bsa混合物，bsa组有着更亮的荧光强度，说明蛋白载体可以帮助更多地蛋白进入细胞(图5)。

实施例5：基于配位自组装作用的蛋白载体在hela细胞上转染效果实验

β-半乳糖苷酶(β-gal)的分子量很大(464kda)，由于其透过细胞膜的能力很弱，所以常用作模型蛋白来验证蛋白递送系统的效果。β-gal可以催化半乳糖和其它化合物中间的β-半乳糖苷键断裂，所以可以通过测定底物来评价β-gal活性。我们将β-gal和β-gal纳米粒分别处理hela细胞24h，吸除上清后加入x-gal。β-gal可催化x-gal氧化，生成不溶性的蓝色吲哚衍生物沉淀，可在光学显微镜下观察到。所以，β-gal在细胞内的活性也可由蓝色沉淀物的多少得到直观体现。将2×10⁵个hela细胞接种于6孔板中，然后在37℃，5％的二氧化碳培养箱中孵育12h。细胞贴壁后将培养基移除，然后用pbs清洗细胞两遍，分别将β-半乳糖苷酶(β-gal)，pcah/β-gal混合物和β-gal纳米粒处理细胞24h，使用pbs处理的细胞作为对照。利用β-gal活性检测试剂盒：除去上清液，用pbs清洗3次，加入1mlβ-gal染色固定液，室温固定15min。吸除细胞固定液，用pbs清洗细胞3次，每次3min。吸除pbs，每孔加入1ml染色工作液(每1ml的染色工作液含有10μl的β-gal染色液a，10μl的β-gal染色液b，930μl的β-gal染色液c和50μl的x-gal溶液)。37℃孵育2h，光学显微镜下观察，拍照。β-gal纳米粒处理组细胞的蓝色沉淀物最多(图6)，证明蛋白载体成功地将β-gal递送到了细胞内，并发挥了催化活性。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。