本申请为2014年7月15日提交的中国发明专利申请201410336374.0的分案申请,所述的中国发明专利申请201410336374.0是2009年8月26日提交的、发明名称为“冷薄荷醇受体trpm8的低分子量调节剂的检测和用途”的pct申请pct/ep2009/061019的分案申请,所述pct申请进入中国国家阶段的日期为2011年2月28日,申请号为200980133390.7。
本发明涉及冷薄荷醇受体trpm8的新型调节剂,使用这些调节剂调节trpm8受体的方法;所述调节剂诱导冷感觉的用途;以及使用这些调节剂制备的物品和组合物。
背景技术:
冷薄荷醇受体trpm8(也称为冷膜受体(cmr)1)属于“瞬时受体电位离子通道”家族,在一类特定的神经元中表达,在细胞膜中形成空穴(在各种情况下4个单元结合形成四聚体),其选择性的允许ca2+离子通过。所述蛋白具有6个跨膜结构域以及胞质c和n末端。低温(优选10-25℃)能刺激该受体,产生信号转导,所述信号被神经系统理解为冷感觉。该受体在2002年在多篇出版物中首次被描述为冷觉受体(peieram等,感觉冷刺激和薄荷醇的trp通道,2002mar8;108(5):705-15;mckemydd等,冷受体的鉴定揭示了trp通道在热感觉中的普遍作用,nature.2002mar7;416(6876):52-8;zukercs.神经生物学:冷离子通道,nature.2002mar7;416(6876):27-8)。
致冷的化合物,例如薄荷醇,很长时间以来在调味剂和芳香剂工业中具有重要作用,以产生新鲜和清洁感的结合。对于化合物薄荷醇来说,已显示其作为受体trpm8的天然调节剂起作用(mckemyd.d.,molecularpain1,2005,16;mckemyd.d.,nature416,2002,52-58;peiera.m.,cell108,2002,705-715;dhakaa.,annu.rev.neurosci.29,2006,135-161)。通过应用薄荷醇,激活trpm8,使得ca2+流入冷敏神经元中。产生的电信号最终被感知为冷感觉。薄荷醇浓度升高可导致刺激和麻醉效应。此外,许多出版物描述了具有类似效应的薄荷醇衍生物(英国专利1971#1315761;watsonh.r.,j.soc.cosmet.chem.29,1978,185-200;furrers.m.,chem.percept.1,2008,119-126)。还有结构上与薄荷醇不相关的个别化合物也产生了显著的trpm8调节效应,例如icilin(weie.t.,j.pharm.pharmacol.35,1983,110-112;wo2004/026840)、ws-23或专利申请wo2007/019719中所列的化合物。
调节trpm8受体和/或其昆虫中的类似物的物质的另一种效应是对昆虫的驱除作用(wo2002/015692;wo2004/000023、us2004/0028714),其在抗肿瘤治疗(例如影响前列腺肿瘤)、炎性疼痛/痛觉过敏的治疗中也具有活性,并且可用作trpm8拮抗剂来有效治疗膀胱综合征或膀胱活动过度(beckb.cellcalcium,41,2007,285-294;levinej.d.biochim.biophys.acta,mol.basisdis.1772,2007,989-1003;mukerjig.,bmcurology6,2006,6;us2003/0207904;us2005/6893626,dissertationbehrendth.j.2004,
然而,迄今为止许多trpm8调节剂在效应强度、效应持续时间、皮肤/粘膜刺激、气味、味觉、溶解性和/或挥发性方面仍具有缺陷。
技术实现要素:
因此,本发明的一个目的是鉴定调节trpm8受体的新物质,其可用作迄今已知的调节剂的备选物。这些化合物还应当尤其适用于化妆品(例如护发、护肤、口腔护理)、营养品(饲料/食物)、纺织品、otc产品(例如烧伤软膏)、药物(例如肿瘤治疗、膀胱虚弱)、包装领域或作为杀虫剂或驱虫剂。
发明详述:
1.通用术语定义:
在文献中,"trpm8"有多个同义词:trpp8、ltrpc6、cmr1、mgc2849、瞬时受体电位阳离子通道亚家族m成员8。在本发明的背景中,涵盖所有的名称。该受体的所有功能性修饰也包括在内,例如尤其是剪接变体,亚型,例如trpm8cra_a、trpm8cra_b,和来自各种生物体例如人、小鼠、大鼠中的所有类似受体。不同受体的核苷酸和氨基酸序列是本身已知的,在序列数据库中列出。因此,例如htrpm8的序列信息可以登录号nm_024080表示。
在本发明的内容中,“调节剂”是指能在体内和/或体外作为trpm8受体激动剂和/或拮抗剂起作用的化合物。
在本文中适当的调节剂可仅作为拮抗剂或激动剂起作用,或同时作为拮抗剂和激动剂起作用,此时,产生激动效应或拮抗效应取决于选择的具体调节剂的浓度。
在本文中,“激动剂”是指介导trpm8受体活化,由此诱导ca2+进入冷敏神经元,从而介导冷感觉的化合物。相反,“拮抗剂”是指阻碍trpm8受体活化的化合物。
本发明的介导物可通过可逆或不可逆、特异性或非特异性结合trpm8受体分子发挥其作用。通常,与受体分子的结合通过离子和/或非离子的例如疏水作用而非共价性的发生。在本文中,“特异性的”包括与一种或多种不同的trpm8受体分子(例如不同来源或不同亚型的trpm8分子)排他性的相互作用。相反,“非特异性的”是指所述调节剂与多种不同功能和/或序列的受体分子相互作用,但是可产生对trpm8所希望的受体激动和/或拮抗调节(如上文所述)。
2.优选的实施方案
本发明首先涉及体外或体内调节冷薄荷醇受体trmp8的方法,尤其是人trpm8受体,其中所述受体与至少一种选自多环有机化合物的化合物接触,所述化合物在使用重组表达人trpm8受体的细胞进行的细胞活性测试中、特别是在标准条件下调节了这些细胞对ca2+离子的通透性。
在该部分中,“标准条件”理解为表示使用经人trpm8转化的hek293细胞进行的实验,该细胞加载了钙敏感染料(例如fluo-4am,即氟-4-乙酰氧基甲基酯)后加入测试化合物,并检测颜色变化,实验过程在37℃进行,如下文实施例3所述,或参见behrendt等(2004),见上文)。
特别的,所述调节化合物包含至少2个4-至7-元环,其各自独立地为碳环或杂环、单环或多环,其中在这些环中至少2个可任选稠合或螺连接。合适的环连接的其他非限制性实例包括环碳原子和/或环杂原子间的化学单键,通过2-6元碳桥连基团连接,其中各个碳原子可被诸如n、o或s的杂原子替换。此外,所述环和桥连基可任选携带取代基,所述取代基选自酮基、-oh、-sh、-cn、-no2、-c1-6-烷基或c2-4-链烯基,其中在烷基或链烯基中,一个或多个h原子可被诸如f、cl、br或i的卤素替换。
在本文中碳环包含4、5、6或7个碳原子;除环碳原子外,杂环包括1-3个相同或不同的环杂原子,例如o、n和s原子。在本文中的环可以各自独立地是饱和的、单或多不饱和的,例如芳环。
本发明使用的调节剂对于细胞ca2+通透性具有激动或拮抗效应。具体而言,所述调节剂是至少一种选自下表1中的式1-19的化合物。
表1:根据本发明的调节剂
其中化合物可以化学纯或富集形式存在,为单个立体异构体或立体异构体混合物形式。此外,所述化合物可以是不带电的或其盐形式,例如酸加成盐。官能团可任选被等价的化学基团替换;氟原子可被其他卤素原子,例如cl、br或i替换;氧原子(例如醚基)可被相应的硫基团替换,反之亦然;酮基团可被相应的亚硫酰基替换。上面具体描述的化合物是本身已知的化学物质,可商购或通过常规有机合成方法获得。
因此,例如下列化合物是已知的:
化合物1,cas号:99602-94-5(3r-顺式)
化合物2,cas号:165753-08-2
化合物3,cas号:338771-57-6
化合物4,cas号:878942-21-3
化合物5,cas号:748783-13-3
如果修饰形式或衍生物也表现出需要的生物学活性(受体trpm8的调节),那么它们也是功能类似物或功能等价化合物。
此外,本发明还包括使具体公开的物质与固相载体偶联的衍生物;本领域技术人员已知可选择多种相应的接头/间隔基团。所述衍生化可在偶联至固相前进行,或仅仅由偶联产生。
本发明还涉及trpm8受体调节剂、尤其是激动剂在诱导人和/或动物的冷感觉,尤其是局部的,即皮肤或口腔的冷感觉中的用途,其中所述调节剂如上文所定义。当化合物在上述细胞活性测试中表现出对于htrpm8的激动效应时,称为“诱导冷感觉”。
本发明还涉及trpm8受体调节剂作为药物组合物的活性成分的用途,其中所述调节剂如上文所定义。
本发明还涉及trpm8受体调节剂在前列腺癌治疗、膀胱虚弱治疗或疼痛治疗中的用途,其中所述调节剂如上文所定义。
本发明还涉及trpm8受体调节剂作为昆虫驱虫剂或杀虫剂的用途,其中所述调节剂如上文所定义。
本发明还涉及trpm8受体调节剂在诱导对以多种加工形式(例如纤维、织物、模塑)的包装(例如由纸或塑料制成)的冷感觉中的用途,其中特别是在接触包装材料时,冷感觉变得显著,其中所述调节剂如上文所定义。在该部分内容中,所述物质可通过多种途径与包装材料相结合:例如通过旋转涂层、凹印、微囊化形式、直接引入到包装材料中(例如挤压)、调节剂的适当衍生物的共价偶联(通过适当的间隔物/接头基团来帮助分子与包装材料可逆或不可逆地结合)。本领域技术人员已知合适的方法。
本发明还涉及trpm8受体调节剂在诱导纺织品的冷感觉中的用途,其中所述调节剂如上文所定义。在该部分内容中,所述物质可通过多种途径与纺织品相结合:例如通过旋转涂层、凹印、微囊化形式、直接引入到纺织品材料中(例如挤压)、调节剂的适当衍生物的共价偶联(通过适当的间隔物/接头基团来帮助分子与纺织品材料可逆或不可逆地结合)。本领域技术人员已知合适的方法。
本发明还涉及根据上述定义的物质本身作为trpm8受体调节剂的用途,尤其是作为激动剂和/或拮抗剂。
本发明还涉及包含至少一种上述定义的化合物的组合物。特别的,所述组合物选自:
a)药物组合物,例如抗肿瘤组合物,治疗膀胱疾病的组合物,止痛剂;
b)食物,例如冰激凌、奶油冻、乳油、饮料、糕饼。
c)口腔护理组合物,例如牙膏、漱口水、口香糖、口气清新剂。
d)护肤或护发组合物,例如防晒霜、晒斑膏、洗剂、洗发水、硬膏、漱口剂、洗液、剃毛霜、调节剂、洗面奶、肥皂、沐浴乳和沐浴泡沫、止汗剂、除臭剂。
e)驱虫剂、杀虫剂。
除了各种具体组合物的常规成分外,所述组合物包含有效量的至少一种本发明的调节剂。在该部分内容中,“有效”表示所述调节剂的浓度足以带来需要的效应,例如药理学效果或感觉效应,例如在应用所述组合物(例如应用至皮肤)后冷的嗅觉效应。
任选地,根据本发明的化合物可与其他已知的活性成分组合,尤其是那些具有相同效应的。例如,可与已知的制冷化合物组合,例如薄荷醇、薄荷酮、n-乙基-p-薄荷烷甲酰胺(ws-3)、n-2,3-三甲基-2-异丙基丁酰胺(ws-23)、乳酸薄荷酯(
本发明还涉及纺织品,例如衬衫、长裤、袜子、毛巾,其采用至少一种上述定义的化合物整理(finish)(尤其在表面上)。
本发明还涉及与至少一种上述定义的化合物结合的包装材料。
现参照下述非限制性的工作实施例来描述本发明。
附图说明
图1显示了来自根据序列数据库登录号nm_024080的htrpm8受体的(a)mrna序列和(b)氨基酸序列。
图2显示了编码htrpm8的质粒pind_m8的载体图谱,其已用于转染hek293细胞。
具体实施方式
实验部分:
实施例1–人trpm8的克隆
人trpm8受体克隆的起点是lncapcdna文库。其例如可从商业获得(例如biochain,hayward,usa)或使用标准试剂盒从雄激素敏感的人前列腺癌细胞系lncap(例如atcc,crl1740或ecacc,89110211)制备。
可使用标准方法pcr扩增和克隆编码trpm8的序列(参见图1a;和http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=nuccore&id=109689694)。通过这种方法分离的人trpm8基因被用于制备质粒pind_m8,其构建通过图2的质粒图谱进行说明。
或者,trpm8基因也可通过合成制备。
实施例2-hek293测试细胞的传代
制备稳定转染人trpm8dna(参见上述质粒pind-m8)的hek293细胞系作为测试细胞系统。在本文中优选通过引入的质粒提供用四环素诱导trpm8表达的hek293。
本领域技术人员已知生产适当的测试细胞系统的方法。例如,本发明使用的细胞的制备详情参见behrendth.j.等,br.j.pharmacol.141,2004,737-745或behrendt的论文“vergleichendefunktionaleuntersuchungendeshitze-capsaicin-rezeptors(trpv1)unddes
http://www-brs.ub.ruhr-uni-bochum.de/netahtml/hss/diss/behrendthansjoerg/diss.pdf。
特别引用这些文献公开的内容。
实施例3-trpm8调节剂的测定
采用与已描述在文献中的试验相当的试验,参见behrendth.j.等人,br.j.pharmacol.141,2004,737-745。受体的激动或拮抗通过ca2+敏感性染料(例如fura,fluo-4等)来量化。根据其自身特点,激动剂使ca2+信号增加,拮抗剂例如在薄荷醇存在下使ca2+信号减少(各自通过染料fluo-4检测,其具有由ca2+导致的不同的荧光性质)。
a)试验方法:
首先,在细胞培养瓶中以本身已知的方法制备转化的hek细胞的新鲜培养液。使用胰蛋白酶从细胞培养瓶上分离测试细胞hek293-trpm8,按每100μl培养基40000细胞/孔接种在96孔板中(greiner#655948聚-d-赖氨酸-涂覆)。为诱导受体trpm8,向生长培养基中加入四环素(dmem/hg,10%无四环素fcs,4mml-谷氨酰胺,15μg/ml灭菌素,100μg/ml潮霉素b,1μg/ml四环素)。第二天,细胞加载fluo-4am染料,进行试验。使用下列步骤:
-在每100μl培养基(dmem/hg,10%无四环素fcs,4mml-谷氨酰胺,15μg/ml灭菌素,100μg/ml潮霉素b,1μg/ml四环素)中各自加入100μl/孔的染料溶液ca-4kit(rb141,moleculardevices)。
-在培养箱中孵育30分钟/37℃/5%co2,30分钟/rt。
-制备供试物质(在200μlhbss缓冲液中,不同浓度)和阳性对照(不同浓度的薄荷醇、icilin和离子霉素,在200μlhbss缓冲液中)和阴性对照(仅200μlhbss缓冲液)。
-以50μl/孔的量加入试验物质,在485nm激发、520nm发射测定荧光的变化(例如测定仪器flipr,moleculardevices或novostar,bmg),评价不同物质/浓度的效果,确定ec50值。
试验物质以浓度0.1-200μm一式三份进行测定。通常将化合物保存在dmso溶液中,稀释至最大dmso浓度2%进行测定。
b)试验结果
本发明调节剂测定的ec50值总结于下表2。
表2:试验物质对于人受体trpm8的活性
该评价令人惊讶的发现,首次能够制备结构显著不同于已知的trpm8受体激动剂,例如(-)薄荷醇、icilin和其他behrendth.j.等在br.j.pharmacol.141,2004,737-745(参见表1)中描述的激动剂的trpm8受体激动剂,并且,在某些情况中其具有比(-)薄荷醇更好的活性,或与icilin效果相当。
实施例4–漱口剂的制备
制备下列组成的漱口剂:
为制备漱口剂,以所述量混合上述成分。
本文特别参考所引用的文献资源的公开内容。
序列表
<110>巴斯夫欧洲公司
<120>冷薄荷醇受体trpm8的低分子量调节剂的检测和用途
<130>m/49197-pct
<160>2
<170>patentin版本3.3
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<211>5621
<212>dna
<213>人
<400>1
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