血红素加氧酶‑1抑制剂在制备抑制阿霉素心脏毒性药物中的应用的制作方法

本发明涉及血红素加氧酶-1抑制剂锌原卟啉(zincprotoporphyrin，znpp)在与抗肿瘤药物阿霉素联合使用时，能显著减轻阿霉素造成的心脏毒性。

背景技术：

阿霉素(doxorubicin，dox)属于蒽环类抗肿瘤抗生素，具有抗瘤谱广，抗瘤作用强，疗效确切等特点，广泛地用于治疗血液系统恶性肿瘤和实体肿瘤，如急性白血病、淋巴瘤、乳腺癌、胃癌、软组织肉瘤和卵巢癌等。与其他抗肿瘤药物类似，阿霉素一方面对癌变的细胞具有强烈的损伤作用，另一方面对正常的细胞和组织也具有毒害，可以引起脱发、骨髓抑制和心脏毒性等毒副反应。其中，阿霉素最大的毒副作用是不可逆的心脏毒性。临床表现轻者为心律失常，重者为心肌炎或心力衰竭。这不仅极大地影响了患者的生存质量，也使阿霉素的临床应用受到了极大的限制。

阿霉素对心脏的毒性是通过累积和剂量依赖的方式引起心肌损害，但其导致心肌损伤的机制仍未完全明了。目前研究认为与活性氧的过量产生、脂质的过氧化反应、dna的损伤和肿瘤抑制蛋白的累积等有关。近年来越来越多的证据表明，使用阿霉素导致的心脏铁过载在其心脏毒性的发生发展中起着极其重要的作用。目前唯一批准应用于临床的抗阿霉素心脏毒性保护剂右丙亚胺(dexrazoxane,dxz)就是一种铁螯合剂。

然而，心脏铁蓄积的原因却一直不清楚。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供血红素加氧酶-1抑制剂锌原卟啉在制备治疗阿霉素心脏毒性药物中的应用，为新药研发和创新疗法提供基础。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种血红素加氧酶-1抑制剂在制备治疗铁过载疾病的药物中的应用，该血红素加氧酶-1抑制剂为锌原卟啉(zincprotoporphyrin，znpp)。

在发明过程中，发明人发现阿霉素注射后小鼠心脏血红素加氧酶-1表达显著升高，导致组织血红素含量下降和非血红素铁含量升高。进一步通过锌原卟啉(10毫克/公斤体重)注射小鼠模型证实，锌原卟啉能明显抑制阿霉素导致的心脏铁过载，从而改善心脏功能。该研究结果为锌原卟啉改善阿霉素心肌病提供了理论依据，特别是对相关药物研发提供了基础。

本发明经过研究首次发现，阿霉素可以在心脏中激活血红素加氧酶-1(hemeoxygenase-1，ho-1)，降解广泛存在于心脏肌红蛋白中的血红素，将其中的铁离子释放出来。即，本发明首次发现ho-1激活-释放机制。之前的研究只知道阿霉素使用后铁在心脏蓄积，并不清楚这些铁的来源。本发明发现了ho-1降解血红素这条通路，从而获得ho-1抑制剂的治疗价值。

综上所述，本发明发现了血红素加氧酶-1抑制剂锌原卟啉可用于制备治疗阿霉素心脏毒性的药物，扩大了阿霉素的临床应用。

本发明的实际用法和用量为：稀释后进行注射，用量约为5～6g/成人.天。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为锌原卟啉逆转dox导致的小鼠心脏(a)和脾脏(b)体积变化。

图2为锌原卟啉逆转dox导致的小鼠系统性铁蓄积，分别检测了血清(a)、心脏(b)、肝脏(c)和脾脏(d)的铁含量。

图3为锌原卟啉逆转dox导致的小鼠心力衰竭，分别以心脏心房钠尿肽(anp)mrna，脑钠尿肽(bnp)mrna和肌球蛋白重链7(myh7)mrna为指标。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。

1.材料和方法

1.1实验动物

6周龄spf级c57bl/6雄性小鼠购自上海斯莱克实验动物有限公司，spf环境饲养。标准饲料ain-76a(铁含量50mg/kg，researchdiets,inc)适应喂养2周后，按体重随机分组，每组6～8只。

1.2药物及处理

化合物锌原卟啉(znpp)和阿霉素(dox)均购自sigma-aldrich公司。阿霉素溶于生理盐水，锌原卟啉溶于二甲基亚砜(dmso)中。阿霉素以10毫克/公斤体重一次性腹腔注射；锌原卟啉以10毫克/公斤体重的剂量于注射阿霉素前一天腹腔注射。

阿霉素处理1天后，5％水合氯醛腹腔麻醉小鼠，称重，心脏采血，分离血清，并收集心脏、肝脏和脾脏等组织称重后液氮保存。小鼠心脏重量比上体重得到心脏体重比；脾脏重量比上体重得到脾脏体重比，这部分结果如图1所述。根据图1，可得知znpp的使用显著地逆转了阿霉素导致的心脏和脾脏形态变化。

1.3组织非血红素铁水平测定

将小鼠组织块(包括心脏、肝脏、脾脏)称重后加入1毫升组织消化液(3m盐酸300ml/l，和0.61m(10％)99.735g/l三氯醋酸，溶解后超纯水定容到1升)，65℃消化不少于50小时，中间用震荡器震动三次，每次不少于10分钟，确保组织消化完全，之后用组织消化液定容至1.5毫升。在96孔板中每孔加入200微升铁显色液工作液(铁显色液储液：饱和醋酸钠溶液：超纯水＝1:5:5)，加入10毫升样品，充分混匀，室温显色10分钟。在535nm波长读吸光度值(酶标仪)，将组织消化液设为空白，根据铁标准液的吸光度计算组织非血红素铁含量。血清与三个主要器官的铁含量如图2所示。根据图2，可得知：使用znpp抑制ho-1活性后，显著抑制了阿霉素所致的系统性铁过载，有力地证明了阿霉素心肌病中铁过载的发生是源自于ho-1诱导的血红素降解。

1.4rna提取和荧光定量实时pcr

trizol(lifetechnologies)法提取细胞和组织的rna，具体操作按说明书进行。nanodrop1000spectrophotometer上检测rna纯度(od260/od280≈1.9-2.1)及rna浓度(ng/μl)，调整rna浓度到1μg/μl。

2.0μgrna经dnase(promega)处理后，m-mlv反转录酶(promega)和oligo(dt)18primer(takarabioinc.)进行反转录。cfx96real-timesystem(bio-rad)中进行荧光定量实时(real-timepcr)检测mrna水平各相关基因表达，检测体积为10ul，试剂采用iqsybrgreensupermix(bio-rad)，引物序列如下：

mousegapdh:

forwardatcatccctgcatccact

reverseatccacgacggacacatt

mouseanp:

forwardtcgtcttggccttttggct

reversetccaggtggtctagcaggttct

mousebnp:

forwardaagtcctagccagtctccaga

reversegagctgtctctgggccatttc

mousemyh7:

forwardgctgaaagcagaaagagattatc

reversetggagttcttctcttctggag

荧光定量实时pcr体系为：

荧光定量实时pcr程序为：

step1：95℃3min

step2：95℃15s

step3：60℃30s

step4：72℃30s

step5：goto2for39cycles

溶解曲线对应的步骤如下：

step6：95℃10s

step7：65℃-95℃5s(increment:0.5℃)

step8：end。

检测结果如图2所示。根据图2，可得知：znpp的使用极大地改善了阿霉素心肌病小鼠的心脏功能。

1.5统计方法

全部数据采用均数±标准误(mean±sem)表示，使用graphpadprism(version6.0,graphpadsoftware；sandiego,ca,usa)统计学软件进行统计学分析。p＜0.05代表差异有显著性，具有统计学意义。

2.结果

6周龄的c57bl/6雄性小鼠标准膳食均衡2周后随机分成3组，第一组为对照组，腹腔注射生理盐水，二、三组均腹腔注射阿霉素(10毫克/公斤体重)。阿霉素注射前一天，第三组腹腔注射锌原卟啉(10毫克/公斤体重)。阿霉素注射24小时后解剖小鼠，称重，检测心脏组织损伤标记物(心房钠尿肽，脑钠尿肽和肌球蛋白重链7mrna水平)以及血清和组织铁含量。

结果显示，阿霉素联用锌原卟啉能明显挽救阿霉素导致的心脏等脏器体积变化，并抑制被阿霉素显著上调的心脏组织损伤标记物，提示其对心脏毒性的保护作用。

最后，阿霉素与锌原卟啉联合处理组(第三组)同阿霉素单独处理组(第二组)相比，血清及心脏等组织的铁含量显著回落，说明作为血红素加氧酶-1抑制剂的锌原卟啉可能通过影响机体的铁代谢水平来抵抗阿霉素导致的心脏毒性。

基于上述实验，锌原卟啉抑制血红素加氧酶-1介导的铁过载是治疗阿霉素心脏毒性的治疗方法。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

<110>浙江大学

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